现代生物技术综合实验课件

现代生物技代生物技术综合合实验实验一实验一 质粒质粒DNA的制备与质量鉴定的制备与质量鉴定一、实验目的一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒粒DNA的提取方法。的提取方法。2021/2/42二、实验原理二、实验原理 在碱性溶液中，双链在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，氢键断裂，DNA双螺旋结双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，分子量相对较小，且且呈环状超螺旋结构呈环状超螺旋结构，即使，即使在高碱性在高碱性pH条件下，两条互条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的构型又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色；而线性的大分子量细菌染色体体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的白质，混杂的RNA可用可用RNA酶酶(RNAase)消除。消除。2021/2/43三、实验材料与主要试剂三、实验材料与主要试剂 实验材料：实验材料：含含pEGFP质粒质粒的大肠杆菌的大肠杆菌DH5 主要试剂：主要试剂：溶液溶液I：50 mM葡萄糖，葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液溶液II：0.2 mol/L NaOH溶液（内含溶液（内含1%SDS）,现配现用现配现用 溶液溶液III（pH4.8）:60 mL 5 mol/L醋酸钾，醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，冰醋酸，28.5 mL H2O；饱和酚饱和酚/氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25:24:1）、酚）、酚/氯仿（氯仿（1:1，V/V）TE缓冲液（缓冲液（pH8.0）:10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，含含RNA酶（酶（RNaseA）:20 g/ml 醋酸钠（醋酸钠（pH5.2）、）、70%乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇2021/2/442021/2/45四、实验步骤四、实验步骤1)吸取吸取1.4 ml菌液至菌液至1.5 ml离心管中。离心管中。2)离心离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复断是否需要重复12次）。次）。3)加入加入150 L 溶液溶液，用旋涡振荡器，用旋涡振荡器充分悬浮菌体充分悬浮菌体。4)加入加入200 L溶液溶液，加盖后温和颠倒，加盖后温和颠倒56次，直至呈透次，直至呈透明状。明状。此步骤在此步骤在5分钟内完成。分钟内完成。5)加入加入150 L预冷的溶液预冷的溶液，加盖后反复颠倒混匀，直，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6)离心离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心，移取上清液于另一干净离心管。管。2021/2/467)7)向上清液中向上清液中加等体积加等体积的苯酚的苯酚/氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25:24:1），），振荡混匀抽提，离心振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出，溶液将出现分层。现分层。8)移取上层水相溶液（约移取上层水相溶液（约450500L）于另一干净离心管，）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出现分层。，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的体积的醋酸钠（醋酸钠（pH5.2）和）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。10)离心离心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。，倒掉上清液。2021/2/4711)加加0.5 ml 预冷的预冷的70%酒精振荡，洗酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离沉淀一次，离心心5 min，倒掉上清液。，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥真空抽干或室温自然干燥.13)加加2030L TE缓冲液使缓冲液使DNA完全溶解，室温放置完全溶解，室温放置10min，降解，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒测，剩余质粒-20保存备用。保存备用。14)1%琼脂糖凝胶配制：称取琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入溶液，加热熔化，稍降温后，加入5L溴化溴化乙锭（乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。2021/2/4815)每位同学各取每位同学各取5L质粒质粒DNA加入加入1L 6loading buffer，混匀，混匀，进进行行点样。点样。16)电泳条件：电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。五、实验结果五、实验结果 观察并分析电泳图片观察并分析电泳图片六、实验报告六、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。2021/2/49实验二实验二 质粒质粒DNA的片断化及分离的片断化及分离 一、实验目的一、实验目的 1、学习利用紫外分光光度法鉴定学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量质量 2、采用、采用型限制性核酸内切酶切割质粒型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。2021/2/410二、实验原理二、实验原理 DNA吸收光谱峰在吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下处，测定此波长下DNA溶液的溶液的OD值，当值，当OD260=1时，双链时，双链DNA含量约为含量约为50 g/mL，据此可，据此可用紫外分光光度计测定溶液中用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质吸收峰含量。由于蛋白质吸收峰在在280 nm处，在测定处，在测定DNA含量时，通过计算含量时，通过计算OD260/OD280值，值，可了解所测可了解所测DNA的纯度，如该值为的纯度，如该值为1.82.0时，时，DNA纯度高。纯度高。已知已知型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该处切断双链处切断双链DNA，形成一定长度和序列的，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切反片段。酶切反应需应需Mg2+等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（高（5%），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。绝），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度大多数酶的反应温度37。2021/2/411三、实验材料：三、实验材料：实验一提取的质粒实验一提取的质粒DNA四、试剂四、试剂 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Xba I；缓冲液；缓冲液10M Buffer；0.1%BSA;0.5TBE Buffer；1%琼脂糖琼脂糖五、实验步骤五、实验步骤 1、DNA的测定的测定 空白测定空白测定(Blank)：吸取：吸取200 l TE缓冲液至比色杯，进行空缓冲液至比色杯，进行空白测定。白测定。DNA测定测定(Sample)：取质粒：取质粒DNA 1 l至一干净的离心管，至一干净的离心管，加入加入199 l TE缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定色杯中，测定260 nm及及280 nm的光吸收值；计录的光吸收值；计录DNA浓度浓度及及OD260/OD280比值。比值。2021/2/4122021/2/4132 2、酶切反应、酶切反应 酶切反应液的配制酶切反应液的配制:Xba I I 1l 10M buffer 2l 0.1%BSA 2l DNA 5l(根据质粒浓度来确定用量根据质粒浓度来确定用量)ddH2O 10l 酶切反应条件：酶切反应条件：3737水浴水浴2 23 3小时小时。3 3、电泳检测、电泳检测 反应结束后，向反应液中加入反应结束后，向反应液中加入2.5l 102.5l 10loading loading bufferbuffer，混匀，用以停止酶切反应，所有，混匀，用以停止酶切反应，所有22.5l22.5l样品均样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,20120V,20分钟左右。分钟左右。2021/2/414六、实验结果六、实验结果 观察并分析电泳图片。观察并分析电泳图片。七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。2021/2/415实验三实验三 大分子大分子DNA的制备和质量鉴定的制备和质量鉴定 一、实验目的一、实验目的 采用采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织法从植物组织中提取基因组中提取基因组DNA，并进行，并进行DNA纯度分析和琼脂糖纯度分析和琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶电泳检测。2021/2/416二、实验原理二、实验原理 核酸是生物有机体的重要成分，在细胞中核酸常与蛋白质核酸是生物有机体的重要成分，在细胞中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨结合在一起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。在浓在浓NaCl溶液溶液(12mol/L)中，中，DNA核蛋白的溶解度很大，核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液溶液(0.14mol/L)中，中，DNA核蛋白的溶解度很小，核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的可利用不同浓度的NaCl溶液将溶液将DNA核蛋白和核蛋白和RNA核蛋白从样核蛋白从样品中分别抽提出来。品中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓是一种阳离子去污剂，具有从低浓度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液中中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去。2021/2/417有效制备大分子有效制备大分子DNA的两个原则：的两个原则：1）防止和抑制内源）防止和抑制内源DNase对对DNA的降解。的降解。2）尽量减少对溶液中）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；所有操作的机械剪切破坏；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。均须温和，避免剧烈震荡。2021/2/418三、实验材料：三、实验材料：植物叶片约植物叶片约0.2克克四、实验试剂四、实验试剂 1M Tris-HCl(pH8.0)(提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏)CTAB分离缓冲液：分离缓冲液：2%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巯基巯基乙醇乙醇(EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易从基因组DNA中除去)洗涤缓冲液：洗涤缓冲液：76%乙醇，乙醇，10mmol/L乙酸铵乙酸铵 氯仿氯仿-异戊醇异戊醇(24:1)、异丙醇、异丙醇、TE缓冲液缓冲液 液氮液氮2021/2/419五、实验步骤五、实验步骤1.CTAB分离缓冲液置于分离缓冲液置于60水浴中预热；水浴中预热；2.2人一组，摘取人一组，摘取0.5g叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎；快将叶片研碎；3.取约取约0.2g叶片粉末加入到叶片粉末加入到2.0mL离心管中，加入离心管中，加入1ml预预热的热的CTAB分离缓冲液，轻轻转动使之混匀；分离缓冲液，轻轻转动使之混匀；4.样品置于样品置于65保温保温30min；5.加等体积加等体积(1mL)的氯仿的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀；异戊醇，轻轻颠倒混匀；6.室温下室温下14000 rpm离心离心10min；2021/2/4207.上层水相吸入另一干净上层水相吸入另一干净1.5mL离心管中，加入离心管中，加入2/3体积体积的异丙醇，轻轻混匀，静置的异丙醇，轻轻混匀，静置5min，使核酸沉淀下来；，使核酸沉淀下来；8.室温下室温下10000 rpm离心离心10min；9.弃去上清液，加入弃去上清液，加入500L洗涤缓冲液，悬浮混匀；洗涤缓冲液，悬浮混匀；10.4条件下，条件下，14000 rpm离心离心10min；11.在室温下使在室温下使DNA沉淀干燥至周围透明，中间有少许白沉淀干燥至周围透明，中间有少许白色为止；色为止；12.将将DNA沉淀溶于沉淀溶于20L TE中，中，-20保存备用；保存备用；13.取取5uL DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取DNA的完整性；的完整性；14.利用核酸蛋白检测仪进行利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。浓度和纯度检测。15.（方法同实验二）（方法同实验二）2021/2/421六、实验结果六、实验结果 基因组基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片的浓度和纯度；观察并分析电泳图片七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。2021/2/422实验四实验四 PCR反应反应一、实验目的一、实验目的 了解了解PCR的基本原理，掌握的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。的基本操作技术。2021/2/423二、实验原理二、实验原理PCR技术是通过模拟技术是通过模拟体内体内DNA复制复制的方式，在体外选择的方式，在体外选择性地性地将将将将DNADNA某个特殊区域某个特殊区域某个特殊区域某个特殊区域扩增出来的技术。扩增出来的技术。PCR的过程：的过程：q高温变性高温变性：将反应体系置于高温下变性，使模板双链：将反应体系置于高温下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。解链为两条单链。q低温退火低温退火：引物与模板链结合，形成部分双链：引物与模板链结合，形成部分双链DNA。q中温延伸中温延伸：Taq DNA聚合酶使引物从聚合酶使引物从5端向端向3端延伸，端延伸，4种种dNTP掺入合成新的掺入合成新的DNA互补链。互补链。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。序列以指数形式扩增。2021/2/424三、实验材料三、实验材料 质粒：质粒：pEGFP 四、试剂四、试剂1.10 PCR buffer、rTaq 酶酶2.dNTP mixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP 各各2.5mM3.引物引物(2.5M)GFP-F:5:5-TAGTCGACT-TAGTCGACTATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5GTGAGCAAGGGCGAGGAG-5 (Tm=65.5)GFP-R:5:5-GCGTCTAGA-GCGTCTAGATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3CTTGTACAGCTCGTCCATG-3 (Tm=61.5)4.2.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 2021/2/425五、实验步骤五、实验步骤1、PCR反应混合液的配制反应混合液的配制(50l)10 PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物前向引物(P1)8l 反向引物反向引物 (P2)8l DNA 模板模板 0.5l rTaq酶酶 0.5l 灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水 24l 所有试剂所有试剂按量仔细添加按量仔细添加按量仔细添加按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加为了防止反应混合液蒸发，可添加30l矿物油覆盖。矿物油覆盖。2021/2/4262、PCR仪的参数设置仪的参数设置 94 4 min 94 30sec 40 cycles 61 30sec 72 50sec 72 5 min3、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取反应结束后，取5l PCR产品，加入产品，加入1l 6loading buffer，混匀后点样，电泳混匀后点样，电泳20min。其余其余45l PCR产品保存在产品保存在-20冰箱中，下次实验使用。冰箱中，下次实验使用。2021/2/427六、实验结果六、实验结果 观察并分析电泳图片观察并分析电泳图片七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。2021/2/428实验五实验五 PCR产品纯化及克隆产品纯化及克隆一、实验目的一、实验目的 学习学习PCR产物纯化的实验技术，掌握基因工程产物纯化的实验技术，掌握基因工程操作技术中最常用的操作技术中最常用的T-A克隆方法克隆方法。2021/2/429二、实验原理二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、产物一般都含有过量的引物、Taq酶及酶及dNTP等等成分，直接影响后续的成分，直接影响后续的DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应;实验中可实验中可采用苯酚采用苯酚/氯仿氯仿/异戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质异戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质杂质变性的方法纯化杂质变性的方法纯化DNA产品，然后在酸性条件下用无产品，然后在酸性条件下用无水乙醇沉淀水乙醇沉淀DNA。利用普通的利用普通的Taq DNA聚合酶所扩增的聚合酶所扩增的PCR产物的产物的3-端端具有一个具有一个A突出末端，突出末端，T载体的载体的5-端具有一个端具有一个T突出末端，突出末端，二者正好互补，然后用二者正好互补，然后用T4 DNA连接酶在体外将目的片段连接酶在体外将目的片段与线性化载体连接的方法称为与线性化载体连接的方法称为T-A克隆。克隆。2021/2/430三、实验材料三、实验材料 实验四的实验四的 PCR产品产品 pMD19-T Vector四、试剂四、试剂TE 缓冲液缓冲液苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(25/24/1)、氯仿、氯仿醋酸钠（醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、）、无水乙醇、70%乙醇乙醇T4 DNA连接酶混合物连接酶混合物(Solution I)2021/2/4312021/2/432五、实验步骤五、实验步骤1、PCR产品纯化产品纯化将将PCR产品（约产品（约45l）小心转入）小心转入1.5ml离心管中，加离心管中，加入入55l TE缓冲液至总体积缓冲液至总体积100l，混匀；，混匀；加入加入100l苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇，涡旋混合异戊醇，涡旋混合1 min，14000 rpm离心离心5 min；将上层水相转移至新离心管，加入将上层水相转移至新离心管，加入100l氯仿，涡旋氯仿，涡旋混合混合1 min，14000 rpm离心离心5 min；再将上层水相转移至新离心管，加再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠醋酸钠（pH=5.2）和）和250l无水乙醇，颠倒混匀，将离心管无水乙醇，颠倒混匀，将离心管插入冰中放置插入冰中放置 30 min；2021/2/433在在4，14000 rpm离心离心10 min，弃去上清液，观察，弃去上清液，观察DNA沉淀；沉淀；加入加入500l预冷预冷 70乙醇，洗涤乙醇，洗涤DNA沉淀沉淀,4 14000 rpm离心离心5min，弃去上清液；空气干燥，弃去上清液；空气干燥DNA沉淀，沉淀，加加5l无菌水溶解无菌水溶解 DNA。2、连接反应、连接反应经纯化的经纯化的PCR产品产品4.5l转移到转移到PCR管中，加入管中，加入0.5l pMD19-T载体，再加入载体，再加入5l T4 DNA连接酶混合物（连接酶混合物（Solution I），轻轻混匀，稍加离心即可；），轻轻混匀，稍加离心即可；连接反应混合物放置在连接反应混合物放置在PCR仪中，仪中，16连接过夜；连接过夜；连接产物用于下次转化实验。连接产物用于下次转化实验。2021/2/434六、实验结果六、实验结果 本次实验结果必须等到下次实验完成后才能确定是否本次实验结果必须等到下次实验完成后才能确定是否连接成功。连接成功。七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。（下周不用交报告，实验六完成后再交下周不用交报告，实验六完成后再交）2021/2/435实验六实验六 感受态细胞的制备和转化感受态细胞的制备和转化一、实验目的一、实验目的1.了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。义。2.学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习外源学习外源DNA转化大肠杆菌受体细胞的方法。转化大肠杆菌受体细胞的方法。2021/2/436二、实验原理二、实验原理 转化转化是将外源是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株限制修饰系统缺陷的变异株(R-，M-)，这些变异株可以，这些变异株可以容忍外源容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些化学试剂如受体细胞经过一些化学试剂如CaCl2、RbCl等处理后，等处理后，细胞膜的通透性会发生暂时性的改变，成为能允许外源细胞膜的通透性会发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的分子进入的感受态细胞感受态细胞。进入受体细胞的。进入受体细胞的DNA分子分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。新的遗传性状。2021/2/437 三、实验材料三、实验材料 E.coli DH5菌株：菌株：R-，M-，Amp-实验五的连接产物：实验五的连接产物：pMD19/GFP四、试剂四、试剂 1、含氨苄青霉素、含氨苄青霉素(Amp,100mg/L)的的LB固体培养基固体培养基 2、X-gal储存液（储存液（20mg/ml）3、IPTG储存液（储存液（200mg/ml）4、0.10 mol/L CaCl2溶液溶液2021/2/438五、实验步骤五、实验步骤1、受体菌的培养、受体菌的培养 从从LB平板上挑取新鲜活化的平板上挑取新鲜活化的E.coli DH5单菌落，接单菌落，接种于种于3-5mL LB液体培养基中，液体培养基中，37下振荡培养下振荡培养12h左右，左右，直至对数生长后期。直至对数生长后期。将该菌悬液以将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于100mL LB液液体培养基中，体培养基中，37振荡培养振荡培养2-3h至至OD600=0.5左右。左右。(实验老师已帮大家完成实验老师已帮大家完成)2021/2/4392、感受态细胞的制备、感受态细胞的制备(CaCl2法法)吸取吸取1.5mL培养液到一灭菌的离心管中，将离心管培养液到一灭菌的离心管中，将离心管插入冰中放置插入冰中放置10min，然后于，然后于4下下10 000 rpm离心离心10min。弃去上清，用弃去上清，用1mL预冷的预冷的0.10mol/L CaCl2 溶液轻轻溶液轻轻悬浮细胞，将离心管插入冰中放置悬浮细胞，将离心管插入冰中放置30min，4下下10 000rpm离心离心10min。弃去上清，加入弃去上清，加入100 l预冷的预冷的0.10mol/L CaCl2溶液，溶液，轻轻悬浮细胞，冰中放置几分钟，即成轻轻悬浮细胞，冰中放置几分钟，即成感受态细胞感受态细胞。2021/2/4403、连接产物的转化、连接产物的转化 向制备的感受态细胞中加入向制备的感受态细胞中加入10l连接产物，轻轻摇匀，连接产物，轻轻摇匀，插入冰中，放置插入冰中，放置30min。含有混合物的离心管置入含有混合物的离心管置入42水浴中热击水浴中热击90秒，热击秒，热击后迅速插入冰中，冷却后迅速插入冰中，冷却3-5min。向离心管中加入向离心管中加入900 L LB液体培养基，混匀后液体培养基，混匀后37振振荡培养荡培养12h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因编码的抗生素抗性基因(Ampr)。2021/2/4414、转化产物的涂布、转化产物的涂布筛选培养基筛选培养基(含含X-gal和和IPTG)的准备：在事先制备好的准备：在事先制备好的含的含100 mg/L Amp的的LB平板表面（平板表面（中央位置中央位置）加）加40l X-gal储存液和储存液和4 l IPTG储存液，用无菌玻棒将储存液，用无菌玻棒将溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被吸收。的液体完全被吸收。取取500 l复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液待菌液完全被培养基吸收完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿后，用封口膜封住培养皿边缘，倒置培养皿，边缘，倒置培养皿，37培养过夜。培养过夜。2021/2/442全班做两个对照全班做两个对照:(由班长和学委各做一个由班长和学委各做一个)阴性对照组：阴性对照组：以以10l无菌水代替连接产物，其它操作相同。此组正常无菌水代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下在含情况下在含Amp的的LB平板上应没有菌落出现。平板上应没有菌落出现。阳性对照组：阳性对照组：以以1l的质粒的质粒DNA代替连接产物，其它操作相同。此组代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下应产生大量白色菌落正常情况下应产生大量白色菌落。2021/2/443六、实验结果六、实验结果 第二天上午十点左右回实验室观察平板上是否长第二天上午十点左右回实验室观察平板上是否长出转化子出转化子(直径约直径约1mm)，各自拍照记录实验结果，各自拍照记录实验结果，然后将平板保存在然后将平板保存在4冰箱中，作为综合实验的筛冰箱中，作为综合实验的筛选材料。选材料。七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。2021/2/444谢谢观赏谢谢观赏