细胞破碎与提取要点课件

第二章第二章蛋白质的制备蛋白质的制备-细胞破碎与萃取细胞破碎与萃取第二章蛋白质的制备-细胞破碎1第一节第一节蛋白质制备总则蛋白质制备总则 来源、来源、胞内（胞外）、胞内（胞外）、可溶性、可溶性、分子大小、分子大小、等电点、等电点、稳定性稳定性（对温度、（对温度、pHpH、蛋白酶、金属离子的耐受性）、蛋白酶、金属离子的耐受性）等等二、方法选择依据：二、方法选择依据：根据不同蛋白质的根据不同蛋白质的性质性质和和研究目的研究目的一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性1 1、蛋白质的性质：、蛋白质的性质：第一节蛋白质制备总则来源、二、方法选择依据：一、目2 工业化应用：经济性（高收率，纯度次要）工业化应用：经济性（高收率，纯度次要）一般研究：一般研究：80%-90%80%-90%纯度纯度 结构研究：结构研究：95%95%以上纯度以上纯度 医疗：全面分析医疗：全面分析2 2、研究目的：、研究目的：越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低 考虑产品的质量、数量和经济性考虑产品的质量、数量和经济性工业化应用：经济性（高收率，纯度次要）2、研究目的：3三、确立有效成分的测定方法三、确立有效成分的测定方法1、蛋白质初步提取和浓缩、蛋白质初步提取和浓缩l吸附法吸附法l超滤法超滤法l沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）l透析透析三、确立有效成分的测定方法1、蛋白质初步提取和浓缩吸4三、确立有效成分的测定方法三、确立有效成分的测定方法2、蛋白质高效分离纯化、蛋白质高效分离纯化l色谱法色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）l电泳法电泳法（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）三、确立有效成分的测定方法2、蛋白质高效分离纯化色谱53、根据蛋白质性质确立分离方法、根据蛋白质性质确立分离方法l溶解度不同溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析：等电点，有机溶剂，盐析l电荷不同电荷不同：电泳，离子交换：电泳，离子交换l分子形状大小不同：分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤离心，透析，凝胶过滤3、根据蛋白质性质确立分离方法溶解度不同：等电点，有机溶剂，6四、蛋白质的制备流程：四、蛋白质的制备流程：原料液原料液细胞分离细胞分离(离心，过滤离心，过滤)细胞胞内产物细胞胞内产物细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离(盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等)纯化纯化(层析、电泳层析、电泳)脱盐脱盐(凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤)浓缩浓缩(超过滤超过滤)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包含体包含体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性四、蛋白质的制备流程：原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内7首先：首先：l材料的选择和预处理材料的选择和预处理l细胞的破碎和细胞组分分离细胞的破碎和细胞组分分离l有效成分的萃取有效成分的萃取首先：材料的选择和预处理8第二节第二节材料的选择、预处理与保存材料的选择、预处理与保存一、原料选择原则：有效成分含量高、原料来源丰富，易得；有效成分含量高、原料来源丰富，易得；原料中杂质含量少；原料中杂质含量少；原料成本低等；原料成本低等；植物采收植物采收具有季节性具有季节性微生物生长微生物生长的对数期的对数期注意动物的注意动物的年龄与性别年龄与性别第二节材料的选择、预处理与保存一、原料选择原则：有效成9微生物：微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。二、原料的预处理：动物原料：动物原料：动物原料：动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。植物原料：植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分，要择时采集并就地去除不用的的部分，有用部分保鲜处理。有用部分保鲜处理。微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。二、原料的预10（3 3）防腐剂保鲜）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原常用乙醇、苯酚等。适用于液体原常用乙醇、苯酚等。适用于液体原常用乙醇、苯酚等。适用于液体原 料，如发酵液、提取液等。料，如发酵液、提取液等。料，如发酵液、提取液等。料，如发酵液、提取液等。三、原料的保存方法（1 1）冷冻法）冷冻法：适用于所有生物原料。常用适用于所有生物原料。常用适用于所有生物原料。常用适用于所有生物原料。常用-40-40速冻。速冻。速冻。速冻。（2 2）有机溶剂脱水法：）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、丙酮，该法适用于原料少而价值高、丙酮，该法适用于原料少而价值高、丙酮，该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原三、原料的保11第三节第三节细胞破碎细胞破碎一、破碎方法的原则和依据一、破碎方法的原则和依据 原则：最大提取、不易变性、减少干扰原则：最大提取、不易变性、减少干扰具体须从具体须从材料特性材料特性和和目的物特性目的物特性综合考虑。综合考虑。第三节细胞破碎一、破碎方法的原则和依据原则：最大提取121、材料细胞的特性、材料细胞的特性l动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法l植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法l微生物细胞较复杂，一般用较强的方法微生物细胞较复杂，一般用较强的方法1、材料细胞的特性动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方132、目的物的特性、目的物的特性.处理量处理量l有些处理量大，如组织捣碎机等。有些处理量大，如组织捣碎机等。l 有些处理量少，如超声波破碎等。有些处理量少，如超声波破碎等。细胞中的位置细胞中的位置游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎敏感性敏感性温度、温度、pHpH、氧、剪切力、杂酶等影响、氧、剪切力、杂酶等影响2、目的物的特性.处理量细胞中的位置敏感性14机械法机械法1.组织捣碎机：组织捣碎机：适用：动植物组织适用：动植物组织二、破碎方法二、破碎方法l原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞l具体方法：具体方法：2.匀浆器匀浆器适用：较柔软、易分散的组织细胞适用：较柔软、易分散的组织细胞3.研钵研钵适用：微生物（细菌）与植物细胞适用：微生物（细菌）与植物细胞机械法1.组织捣碎机：适用：动植物组织二、破碎方法15物理法物理法1超声波破碎超声波破碎2渗透压冲击法：渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。适用：处理胞壁较脆弱的微生物。细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂物理法1超声波破碎2渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆163反复冻融法：反复冻融法：-15-20，适用：动物材料适用：动物材料将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至15到到20，然后放于室温，然后放于室温(或或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。采用此法。4急热骤冷法：急热骤冷法：8590数分钟，冰浴冷却数分钟，冰浴冷却适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质3反复冻融法：-15-20，适用：动物材料4急17化学法化学法2表面活性剂法表面活性剂法破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。1溶剂处理法：溶剂处理法：丙酮、氯仿、甲苯等丙酮、氯仿、甲苯等溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。化学法2表面活性剂法1溶剂处理法：丙酮、氯18（四）酶解法（四）酶解法2外加酶法外加酶法将细胞壁分解，使内含物释放出来。将细胞壁分解，使内含物释放出来。l细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTAEDTA）l酵母：采用酵母：采用-葡聚糖酶葡聚糖酶l霉菌：添加几丁质酶霉菌：添加几丁质酶l植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。1自溶法自溶法保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。（四）酶解法2外加酶法1自溶法19例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白0 0产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白/%/%外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包含体形成包含体-丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包含体形成包含体凝乳酶原凝乳酶原形成包含体形成包含体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包含体形成包含体-内酰胺酶内酰胺酶形成间区包含体形成间区包含体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包含体形成包含体三、包含体及其纯化三、包含体及其纯化例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白0产物占菌体总蛋白/%外源20l包涵体（inclusionbodies），或包含体，是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。包涵体（inclusionbodies），或包含体，是无定21l包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（proteinfolding）机理研究提出了新的课题。包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达22l重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包涵体（inclusionbodiesIBs)。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了232、包含体的构成、包含体的构成l基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。的，所以没有生物活性。l分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。（蛋白质折叠）（蛋白质折叠）l 包含体主要包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。2、包含体的构成基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是243 3、包含体特点包含体特点:l是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。l包含体难溶于水，易溶于变性剂（如盐酸胍、脲）。包含体难溶于水，易溶于变性剂（如盐酸胍、脲）。l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，离心（细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，离心（5000-20000g15min）就可以沉淀。）就可以沉淀。3、包含体特点:是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。包25几种常见的工艺路线（一）几种常见的工艺路线（一）机械破碎机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨）差速离心提取出包含体差速离心提取出包含体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法几种常见的工艺路线（一）机械破碎差速离心提取出包含体加变性剂26路线路线1 1 的特点的特点 特点特点:用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、白质分开，摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单。内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单。缺点缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。加工时间较长。基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法路线1的特点特点:用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性27几种常见的工艺路线（二）几种常见的工艺路线（二）机械破碎机械破碎膜分离除可溶性蛋白膜分离除可溶性蛋白加变性剂溶解包含体加变性剂溶解包含体除变性剂复性除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法几种常见的工艺路线（二）机械破碎膜分离除可溶性蛋白加变性剂溶28路线路线2 2 的特点的特点l优点：优点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，封闭式操作，不污染环境也不受环境污染。封闭式操作，不污染环境也不受环境污染。基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法缺点：缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常导致可溶性蛋白质的滞留。且膜的堵塞和浓差极化常导致可溶性蛋白质的滞留。路线2的特点优点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白29几种常见的工艺路线（三）几种常见的工艺路线（三）化学破碎化学破碎（加变性剂）（加变性剂）离心除细胞碎片离心除细胞碎片除变性剂复性除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法几种常见的工艺路线（三）化学破碎离心除细胞碎片除变性剂复性基30 路线路线3 3 特点：特点：基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法优点：优点：化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。比前两者更适合于实验室操作。缺点：缺点：所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。给后续分离带来困难。路线3特点：基因工程包含体的纯化方法优点：化学法破碎，所31一、概述一、概述第四节第四节 萃取萃取1、基本概念及分类、基本概念及分类概念：概念：萃取是利用溶质在互不混溶的两相之间分配系数萃取是利用溶质在互不混溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。一、概述第四节萃取1、基本概念及分类32液液-固萃取固萃取液液-液萃取液萃取化学萃取化学萃取物理萃取物理萃取双水相萃取双水相萃取超临界萃取超临界萃取萃取原理萃取原理参与溶质参与溶质分配的两分配的两相不同相不同分类：分类：液-固萃取液-液萃取化学萃取物理萃取双水相萃取超临界萃取萃取33概念概念：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为固取到溶液中的过程称为固-液萃取，也称液萃取，也称浸取或浸取或浸出浸出。应用：应用：v用温水从甜菜中提取糖，用温水从甜菜中提取糖，v用有机溶剂从大豆、花生等油料作物中提取食用油，用有机溶剂从大豆、花生等油料作物中提取食用油，v用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。液液-固萃取固萃取概念：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为34用溶剂用溶剂从溶液中抽提物质叫液从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶液萃取，也称溶剂萃取剂萃取。经典的液。经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取液萃取指的是有机溶剂萃取液液-液萃取液萃取有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。应用应用比化学沉淀法分离程度高；比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低；比蒸馏法能耗低；生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制优点优点用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶剂萃取。经典的液-35溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术：了一系列新型分离技术：q超临界流体萃取超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction）q反胶团萃取反胶团萃取（Reversed micelle extraction）q双水相萃取技术双水相萃取技术（Partition of two aqueous phase system）液液-液萃取液萃取用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、蛋白质、多肽、核酸等）的分离提取上。蛋白质、多肽、核酸等）的分离提取上。溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生液-液萃取用于高品质36根据萃取原理分类的基本概念化学萃取化学萃取利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反应生成脂利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。物理萃取物理萃取溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡而进行萃取的分离过程。配平衡而进行萃取的分离过程。根据萃取原理分类的基本概念化学萃取利用脂溶性萃取剂与372、萃取技术的操作特点l萃取过程具有选择性萃取过程具有选择性l能与其他纯化步骤相配合能与其他纯化步骤相配合l适用于各种不同的规模适用于各种不同的规模l传质速度快，生产周期短，便于连续操作传质速度快，生产周期短，便于连续操作2、萃取技术的操作特点萃取过程具有选择性383、萃取需要考虑下列问题l生物系统的错综复杂和多组分特性生物系统的错综复杂和多组分特性l产物的不稳定性产物的不稳定性l相分离性能相分离性能3、萃取需要考虑下列问题生物系统的错综复杂和多组分特性39v把目标物质从第一个液相中依靠更把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。强大的溶解力抽提到第二个液相中。v物质的溶解和相似相溶原理。物质的溶解和相似相溶原理。v萃取是通过溶质在两个液相之间的萃取是通过溶质在两个液相之间的竟争性溶解（分配）而实现的。竟争性溶解（分配）而实现的。二、溶剂萃取技术（液-液萃取）把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中40影响萃取操作的因素：影响萃取操作的因素：a.a.温度温度b.b.pHpH值值c.c.盐分盐分温度温度互溶性增大；互溶性增大；温度温度产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。影响分配系数，影响物质解离情况影响分配系数，影响物质解离情况无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。解度。盐分盐分分配系数分配系数影响萃取操作的因素：温度温度互溶性增大；影响分配系数，影响41d d乳化乳化分散分散非均相非均相一种一种另一种另一种乳剂乳剂均相均相（溶液）（溶液）l乳化即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。乳化即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。d乳化分散非均相一种另一种乳剂均相（溶液）乳化即水或有机42乳化剂类型乳化剂类型 乳状液乳状液 可分为可分为两大类型两大类型水包油，水包油，O/W，油分散在水中，油分散在水中油包水，油包水，W/O，水分散在油中，水分散在油中O/W(水包油型水包油型)W/O(油包水型油包水型)乳化剂类型乳状液水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/43 （亲憎平衡值）（亲憎平衡值）lHLBHLB数即亲水与亲油平衡程度，数即亲水与亲油平衡程度，HLBHLB数越大，亲水数越大，亲水性越强，形成性越强，形成O/WO/W型乳浊液，型乳浊液，HLBHLB数越小，亲油性数越小，亲油性越强，形成越强，形成W/OW/O型乳浊液。型乳浊液。（亲憎平衡值）HLBHLB数即亲水与亲油平衡程度，44乳化与去乳化乳化与去乳化在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。由蛋白质引起的乳化多为水包油型（由蛋白质引起的乳化多为水包油型（由蛋白质引起的乳化多为水包油型（由蛋白质引起的乳化多为水包油型（O/WO/W）。）。）。）。l乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现夹带。乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现夹带。乳化与去乳化在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物45破乳的方法：破乳的方法：1.加热破乳加热破乳 升温加速乳状液液珠的布朗运动使絮凝速率加快，升温加速乳状液液珠的布朗运动使絮凝速率加快，同时使界面粘度迅速降低，使聚结速率加快，有利于膜同时使界面粘度迅速降低，使聚结速率加快，有利于膜的破裂。的破裂。2.高压电破乳高压电破乳 高压电场的破乳较复杂不能只看作扩散双电层的破高压电场的破乳较复杂不能只看作扩散双电层的破坏，在电场下液珠质点可排成一行，呈珍珠项链式，当坏，在电场下液珠质点可排成一行，呈珍珠项链式，当电压升到某一值时，聚结过程在瞬间完成。电压升到某一值时，聚结过程在瞬间完成。破乳的方法：1.加热破乳升温加速乳状液液珠的463.过滤破乳过滤破乳 当乳状液经过一个多孔性介质时，由于油和水对固体当乳状液经过一个多孔性介质时，由于油和水对固体润湿性的差别，也可引起破乳。润湿性的差别，也可引起破乳。4.化学破乳化学破乳 化学破乳的原则是破坏吸附在界面上的乳化剂，使其失化学破乳的原则是破坏吸附在界面上的乳化剂，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳剂。破乳剂也是一种表面活去乳化能力。常用的是使用破乳剂。破乳剂也是一种表面活性剂，有很高的表面活性，能将界面上原来存在的乳化剂顶性剂，有很高的表面活性，能将界面上原来存在的乳化剂顶替走；但破乳剂分子一般具有分支结构，不能在界面上紧密替走；但破乳剂分子一般具有分支结构，不能在界面上紧密排列成牢固的界面膜，从而使乳状液的稳定性大大降低。排列成牢固的界面膜，从而使乳状液的稳定性大大降低。3.过滤破乳当乳状液经过一个多孔性介质时，由475.电解质破乳电解质破乳 对于稀的乳状液，起稳定作用的是扩散双对于稀的乳状液，起稳定作用的是扩散双电层，加入电解质可破坏双电层，也能使乳状电层，加入电解质可破坏双电层，也能使乳状液聚沉液聚沉5.电解质破乳对于稀的乳状液，起稳定作用的是48三三反胶束萃取反胶束萃取（反胶团萃取）（反胶团萃取）三反胶束萃取（反胶团萃取）491、基本术语基本术语胶胶束束(micelles):向向水水中中加加入入表表面面活活性性剂剂，水水溶溶液液的的表表面面张张力力随随S增增大大而而下下降降。当当S达达到到一一定定值值后后，溶溶液液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。临临界界胶胶束束浓浓度度(critical micelle concentration,CMC):S在在水水溶溶剂剂中中形形成成胶胶束束的的最最低低浓度。浓度。1、基本术语胶束(micelles):向水中加入表面活性剂50l反胶束反胶束(reversemicelles):若向若向有机溶剂有机溶剂中加入一中加入一定浓度定浓度S和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶束。束。l微水相或微水相或“水池水池”(waterpool)：反胶束内溶解反胶束内溶解的水。的水。反胶束(reversemicelles):若向有机溶剂中51细胞破碎与提取要点课件522反胶束的溶解作用反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用微水池溶解和分离作用：反反胶胶团团的的微微水水池池的的水水可可溶溶解解氨氨基基酸酸、肽肽和和蛋蛋白白质质等等生生物物分分子子,为为生生物物分分子子提提供供易易于于生生存存的的亲亲水水微微环环境境.因因此此,反反胶胶团团萃萃取取可可用用于于氨氨基基酸酸、肽肽和和蛋蛋白白质质等等生生物物分分子子的的分分离离纯纯化化，特特别别是是蛋蛋白白质质类类生生物物大分子。大分子。2反胶束的溶解作用532反胶束的溶解作用反胶束的溶解作用溶解推动力溶解推动力A 静电作用：静电作用：理理论论上上,当当溶溶质质所所带带电电荷荷与与表表面面活活性性剂剂相相反反时时,由由于于静静电电引引力力的的作作用用,溶溶质质易易溶溶于于反反胶胶团团,溶溶解解率率或或分分配配系系数数较较大大,反反之之,则则不不能能溶溶解解到到反反胶胶团团相相中中,左左图图为为pHpH值值对对不不同同蛋蛋白白质质的的溶溶解解率率急急剧剧变变化化,当当pH7,pH7,即即在在带带正正电电荷荷的的pHpH范范围围内内蛋蛋白白质质的的溶溶解解率率接接近近100%,100%,说说明明静静电电相相互互作作用用对对蛋蛋白白质质的的反反胶胶团团萃取起决定性作用。萃取起决定性作用。2反胶束的溶解作用溶解推动力542、反胶束的溶解作用、反胶束的溶解作用B B 空间相互作用空间相互作用盐盐浓浓度度增增大大对对反反胶胶团团相相产产生生脱脱水水效效应应,含含水水率率W W0 0随随盐盐浓浓度度的的增增大大而而降降低低,反反胶胶团团直直径径减减小小,空空间间排排阻阻作作用用增增大大,propro溶溶解解下下降降.如如，AOT/AOT/异异辛辛烷烷系系统统的的含水率与含水率与I I-0.5-0.5成正比。成正比。图图还还示示：AOT/AOT/异异辛辛烷烷系系统统的的含含水水率率与与AOTAOT浓浓度度无无关关,这这是是多多数数反反胶团系统的共性胶团系统的共性.2、反胶束的溶解作用B 空间相互作用553、反胶束萃取的影响因素、反胶束萃取的影响因素1)pH valueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。3、反胶束萃取的影响因素1)pHvalue562)盐浓度盐浓度盐浓度W0S&Pro Z选择性2)盐浓度盐浓度W0S&ProZ选择性573)、盐离子的种类、盐离子的种类3)、盐离子的种类584)蛋白质分子量蛋白质分子量M4)蛋白质分子量M595)、表面活性剂、表面活性剂SA 种类B S5)、表面活性剂S606)助表面活性剂助表面活性剂6)助表面活性剂614、应用、应用1)蛋白质分离蛋白质分离4、应用1)蛋白质分离622)胞内酶的提取胞内酶的提取2)胞内酶的提取63四、超临界流体萃取SupercriticalFluidExtraction四、超临界流体萃取SupercriticalFluid64简介：l超临界流体萃取超临界流体萃取(SCF)是是20世纪世纪70年代后期迅年代后期迅速发展起来的一种新兴的萃取分离技术，速发展起来的一种新兴的萃取分离技术，是利是利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。分离的过程。l超临界流体具有气体和液体之间的性质，且对超临界流体具有气体和液体之间的性质，且对许多物质均具有很强的溶解能力，分离速率远许多物质均具有很强的溶解能力，分离速率远比液体萃取快，可以实现高效的分离过程。比液体萃取快，可以实现高效的分离过程。简介：超临界流体萃取(SCF)是20世纪70年代后期迅速发展65超临界流体的发展超临界流体的发展l1822年，首次报道年，首次报道l1879年，发现超临界流体对固体有溶解能力年，发现超临界流体对固体有溶解能力l1970年年从咖啡豆提取咖啡因从咖啡豆提取咖啡因l1992年，首先报道了超临界聚合反应年，首先报道了超临界聚合反应超临界流体的发展1822年，首次报道66（一）、超临界流体的萃取的原理（一）、超临界流体的萃取的原理1.流体的临界特征流体的临界特征l气相、液相、固相三相成平衡态共存的点叫三相气相、液相、固相三相成平衡态共存的点叫三相点。点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临。在临界点是所要求的温度和压力分别称为临界温度界点是所要求的温度和压力分别称为临界温度（Tc）和临界压力（）和临界压力（pc）。稳定的纯物质及由其。稳定的纯物质及由其组成的固定组分混合物具有固有的临界状态点。组成的固定组分混合物具有固有的临界状态点。（一）、超临界流体的萃取的原理1.流体的临界特征67超临界流体(SCF)超临界流体(SCF)682.超临界流体的特征超临界流体的特征l超临界流体超临界流体(SCF)是处于临界温度和临界压力以上是处于临界温度和临界压力以上的非凝缩性的高密度流体。的非凝缩性的高密度流体。超临界流体没有明显的超临界流体没有明显的气气-液界面，既不是气体，也不是液体，是一种气液界面，既不是气体，也不是液体，是一种气-液不分的状态，性质介于气体和液体之间。流体处液不分的状态，性质介于气体和液体之间。流体处于超临界状态时，其密度接近液体密度，并且随流于超临界状态时，其密度接近液体密度，并且随流体压力和温度的变化发生十分明显的变化。体压力和温度的变化发生十分明显的变化。2.超临界流体的特征超临界流体(SCF)是处于临界温度和临69超临界流体的性质超临界流体的性质物理物理特征特征密度密度（g/cm3）粘度粘度（g/cm/s）扩散系数扩散系数（cm2/s）气体气体（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2液体液体0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3超临界流体的性质物理密度70超临界流体的主要特性超临界流体的主要特性l密度类似液体密度类似液体l压力和温度的变化均可改变相变压力和温度的变化均可改变相变l粘度粘度,扩散系数接近于气体扩散系数接近于气体lSCF的介电常数，极化率和分子行为与气液的介电常数，极化率和分子行为与气液两相均有着明显的差别两相均有着明显的差别超临界流体的主要特性密度类似液体71l溶质在超临界流体中的溶解度随超临界溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大。流体密度的增大而增大。2.超临界流体的特征超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质溶解于流体中，然后溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因密度下体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因密度下降，降，溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大。2.72可作为超临界流体的物质：可作为超临界流体的物质：l二氧化碳、二氧化碳、l一氧化亚氮、一氧化亚氮、l六氟化硫、六氟化硫、l乙烷、乙烷、l庚烷、庚烷、l氨等。氨等。可作为超临界流体的物质：73常用的流体介质常用的流体介质l二氧化碳：二氧化碳：l临界温度：临界温度：31.1；临界压力：；临界压力：7.2MPal临界条件容易达到、化学性质不活泼、无色临界条件容易达到、化学性质不活泼、无色无味无毒、安全性好、价格便宜、纯度高、无味无毒、安全性好、价格便宜、纯度高、容易获得等优点容易获得等优点常用的流体介质二氧化碳：743.超临界流体萃取特点超临界流体萃取特点(优点优点)l萃取和分离合二为一萃取和分离合二为一l压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数l萃取温度低萃取温度低l临界临界CO2流体常态下是气体，无毒流体常态下是气体，无毒l超临界流体的极性可以改变超临界流体的极性可以改变3.超临界流体萃取特点(优点)萃取和分离合二为一754.萃取技术的应用举例萃取技术的应用举例l生物活性物质和生物制品的提取生物活性物质和生物制品的提取lCO2萃取技术主要应用于有害成分成分的脱除、萃取技术主要应用于有害成分成分的脱除、有效成分的提取、食品原料的处理等几个方面。有效成分的提取、食品原料的处理等几个方面。例如：用例如：用SFE从咖啡、茶中脱咖啡因；啤酒花萃从咖啡、茶中脱咖啡因；啤酒花萃取；从植物中萃取风味物质；从各种动植物中萃取；从植物中萃取风味物质；从各种动植物中萃取各种脂肪酸、提取色素；从奶油和鸡蛋中去除取各种脂肪酸、提取色素；从奶油和鸡蛋中去除胆固醇等。胆固醇等。4.萃取技术的应用举例生物活性物质和生物制品的提取76例1脱咖啡因l超临界流体萃取技术得到最早大规模的工业化应超临界流体萃取技术得到最早大规模的工业化应用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。用用SF-CO2法从咖啡豆中脱出咖啡因工艺流程法从咖啡豆中脱出咖啡因工艺流程 例1脱咖啡因用SF-CO2法从咖啡豆中脱出咖啡因工艺流程77例例2.啤酒花萃取l普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为暗绿色膏状（即啤酒花浸膏），含有许多不纯暗绿色膏状（即啤酒花浸膏），含有许多不纯物质，而且还残留有机溶剂。液体物质，而且还残留有机溶剂。液体CO2和和SC-CO2抽提的酒花萃取物颜色为微榄绿，在抽提的酒花萃取物颜色为微榄绿，在2025MPa，40萃取萃取4h，浸膏得率可，浸膏得率可14，硬，硬树脂萃取率仅为树脂萃取率仅为5.2%，而且不萃取农药，芳，而且不萃取农药，芳香成分不氧化。香成分不氧化。例2.啤酒花萃取78例例3.其他其他l从工业性应用的萃取分离角度，从工业性应用的萃取分离角度，SC-CO2萃取萃取技术在医药、食品、化妆品等工业领域中有较技术在医药、食品、化妆品等工业领域中有较宽的应用面。宽的应用面。医药工业医药工业l酶、维生素等的精制回收酶、维生素等的精制回收l动植物中药效成分的萃取（生物碱、生育酚、动植物中药效成分的萃取（生物碱、生育酚、EPA、DHA、鸦片、吗啡、精油等）、鸦片、吗啡、精油等）l医药品原料的浓缩、精炼、脱溶剂医药品原料的浓缩、精炼、脱溶剂l酵母、菌体产物的萃取酵母、菌体产物的萃取例3.其他79食品工业食品工业l植物油脂的萃取植物油脂的萃取l动物油脂的萃取动物油脂的萃取l奶脂中脱除胆固醇等奶脂中脱除胆固醇等l食品脱脂食品脱脂l咖啡、红茶脱咖啡因、酒花萃取咖啡、红茶脱咖啡因、酒花萃取l香辛料萃取香辛料萃取l植物色素的萃取植物色素的萃取l共沸混合物分离，含醇饮料的软化共沸混合物分离，含醇饮料的软化l脱色、脱臭，烟草脱尼古丁脱色、脱臭，烟草脱尼古丁食品工业80化妆品化妆品及香料工业及香料工业l天然香料萃取，合成香料的分离和精制天然香料萃取，合成香料的分离和精制l化妆品原料萃取，精制（界面活性剂、脂肪酸化妆品原料萃取，精制（界面活性剂、脂肪酸脂、甘油单酯等）脂、甘油单酯等）化妆品及香料工业811896年年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性或可溶性淀粉淀粉)。再如下图中，。再如下图中，2.2的葡聚糖水溶液与等体积的的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。液层。葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系 五、五、双水相萃取双水相萃取葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系五、双水相萃取82有机溶剂萃取的不足：有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（都占大比例（8595），蛋白质在两相中不会失活，），蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。且以一定比例分配于两相中。双水相萃取的优点双水相萃取的优点使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；有机溶剂萃取的不足：亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相83（一）、双水相体系的组成（一）、双水相体系的组成双聚物：双聚物：聚合物聚合物-低相低相对分子质量对分子质量的化合物：的化合物：PEG/DEX、聚乙二醇、聚乙二醇/聚乙烯醇、聚聚乙烯醇、聚乙烯醇乙烯醇/甲基纤维素、聚丙二醇甲基纤维素、聚丙二醇/葡聚糖、葡聚糖、聚丙二醇聚丙二醇/甲氧基乙二醇等甲氧基乙二醇等PEG/磷酸钾、磷酸钾、PEG/磷酸胺、磷酸胺、PEG/硫酸钠、硫酸钠、PEG/葡萄糖等、葡萄糖等、常用聚合物常用聚合物：聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇无机盐系统聚乙二醇无机盐系统无毒原则无毒原则（一）、双水相体系的组成双聚物：聚合物-低相对分子质量的化合84（二）、双水相体系形成的原因（二）、双水相体系形成的原因1.双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即聚合双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即聚合物分子的物分子的空间阻碍作用空间阻碍作用，相互间无法渗透，从而分为，相互间无法渗透，从而分为两相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有两相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越水溶性差别越大，相分离的倾向越大大，相分离的倾向越大。2.加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。两相。（二）、双水相体系形成的原因双水相体系的成因是聚合物之间的不85l水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇，丙三醇，l这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用是重要的。是重要的。同一聚合物的疏水性随分子量增加同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。而增加。（三）、影响双水相萃取的因素（三）、影响双水相萃取的因素1.聚合物及其相对分子量聚合物及其相对分子量水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：（三）、影响双水相萃取86lpH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响系统还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。l体系体系pH与蛋白质等电点相差越大，蛋白质在两相中与蛋白质等电点相差越大，蛋白质在两相中分配越不均匀。分配越不均匀。2.pH的影响的影响pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷87l在在PEG/DexPEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分配，中，无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。生很大的影响。l一些无机离子的分配系数正离子正离子分配系数分配系数K负离子负离子分配系数分配系数KK0.824I1.42Na0.889Br1.21NH40.92Cl1.12Li0.996F0.9123.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响88l由于亲水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白由于亲水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白质在双水相中的稳定性增加，所以一般质，蛋白质在双水相中的稳定性增加，所以一般都可在都可在室温下操作室温下操作。而且室温时粘度较冷却时低，。而且室温时粘度较冷却时低，有助于相的分离并节约了能源开支。有助于相的分离并节约了能源开支。4.温度的影响温度的影响由于亲水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白质在双水相89双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。制。1.双水相萃取法常用于胞内酶提取。双水相萃取法常用于胞内酶提取。（四）、双水相萃取的应用（四）、双水相萃取的应用双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。1.双水相萃取90在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃萃取生物转化取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃萃取发酵取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。器。2.两水相反应器两水相反应器在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另91