酶联免疫吸附测定法课件

酶联免疫吸附测定法 生物体系中的化学测量生物体系中的化学测量裴丹青裴丹青03081152酶联免疫吸附测定法 生物体系中的化学测量裴丹青03081151复复杂生物体系中生命物生物体系中生命物质的化学的化学测量是揭示量是揭示生命奥秘的重要手段，在食品生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病、疾病诊断和断和预防的防的过程中也日益凸程中也日益凸现其重要作用。其重要作用。经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以的吸光光度法）是以简单离子或分子离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面象的常量或微量分析，面对生物体系成分复生物体系成分复杂且待且待测物物浓度度较低的低的测试条件条件则往往无能往往无能为力。力。于是，一系列于是，一系列针对生物体系中化学成分的生物体系中化学成分的测量方法量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成运而生。免疫化学分析即其重要成员，它，它将免疫学知将免疫学知识与化学分析手段有机与化学分析手段有机结合，合，为生命体生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示生命奥秘的重要2 什么是什么是 酶联免疫分析技免疫分析技术 ELISAELISA的基本原理和方法的基本原理和方法ELISAELISA的种的种类和和变化化ELISAELISA的特点的特点 ELISAELISA的的应用用实例例 什么是 酶联免疫分析技术 ELISA的基本原理和方法 EL3 19711971年瑞典学者年瑞典学者EngvailEngvail和和Perlmann,Perlmann,荷荷兰学者学者VanWeermanVanWeerman和和SchuursSchuurs分分别报道将道将免疫技免疫技术发展展为检测体液中微量物体液中微量物质的固相的固相免疫免疫测定方法，即定方法，即酶联免疫吸附免疫吸附测定法定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)ELISA)。ELISAELISA现在已成在已成为目前分析化学目前分析化学领域中的前沿域中的前沿课题，它是一种特殊的，它是一种特殊的试剂分析分析方法，是在免疫方法，是在免疫酶技技术(immunoenzymatic(immunoenzymatictechniques)techniques)的基的基础上上发展起来的一种新型展起来的一种新型的免疫的免疫测定技定技术。1971年瑞典学者Engvail和Perlma4一、基本原理一、基本原理它采用抗原与抗体的特异反它采用抗原与抗体的特异反应将待将待测物与物与酶连接，然后通接，然后通过酶与底物与底物产生生颜色反色反应，用于定量，用于定量测定。定。测定的定的对象象可以是抗体也可以是抗原。可以是抗体也可以是抗原。在在这种种测定方法中有定方法中有3 3种必要的种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（的抗原或抗体（标记物）物）酶作用的底物（作用的底物（显色色剂）一、基本原理在这种测定方法中有3种必要的试剂：5测量量时，抗原（抗体）先，抗原（抗体）先结合在固相合在固相载体上，体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与与酶结合成的偶合成的偶联物（物（标记物），此偶物），此偶联物仍保物仍保留其原免疫活性与留其原免疫活性与酶活性，当偶活性，当偶联物与固相物与固相载体体上的抗原（抗体）反上的抗原（抗体）反应结合后，合后，再加上再加上酶的相的相应底底物，即起物，即起催化水解催化水解或氧化或氧化还原反原反应而而呈呈颜色。色。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免6其所生成的其所生成的颜色深浅与色深浅与欲欲测的抗原（抗体）含量成的抗原（抗体）含量成正比。正比。这种有色种有色产物可用肉眼、物可用肉眼、光学光学显微微镜、电子子显微微镜观察，也可以用分光光度察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以）加以测定。定。其方法其方法简单，方便，方便讯速，速，特异性特异性强。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。7二、二、酶及其底物及其底物酶结合物是合物是酶与抗体或抗原与抗体或抗原,半抗原半抗原在交在交联剂作用下作用下联结的的产物。是物。是ELISAELISA成成败的关的关键试剂，它不，它不仅具有抗体抗原特异的具有抗体抗原特异的免疫反免疫反应，还具有具有酶促反促反应，显示出生物示出生物放大作用，但不同的放大作用，但不同的酶选用不同的底物用不同的底物，将得到不同的将得到不同的颜色反色反应.二、酶及其底物8酶 底底 物物显色色反反应 测定波定波长 辣根辣根过氧化物氧化物酶 邻苯二胺苯二胺四甲替四甲替联苯胺苯胺氨基水氨基水杨酸酸邻联苯甲胺苯甲胺2,2-2,2-连胺基胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐 橘橘红色色黄色黄色棕色棕色兰色色蓝绿色色492492460460449449425425642642碱性磷酸碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸磷酸盐+重氮重氮盐 黄色黄色红色色 400400500500葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色黄色深深蓝色色 405405420420-半乳糖半乳糖苷苷酶 甲基甲基伞酮基半乳糖苷基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光光黄色黄色 360,450360,450420420 酶 底 物显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲9ELISAELISA的种的种类和和变化化（一）双抗体（一）双抗体夹心法心法（二）（二）间接法接法（三）（三）竞争法争法（四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕（五）捕获法法测IgMIgM抗体抗体（六）（六）应用用亲和素和生物素的和素和生物素的ELISAELISA ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心法10（一）双抗体（一）双抗体夹心法心法此法适用于此法适用于检验各种蛋白各种蛋白质等大分子抗原等大分子抗原（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原11获得待分析物的未得待分析物的未标定抗体定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体体连接形成固相抗体接形成固相抗体 洗洗涤除去未除去未结合的合的抗体及抗体及杂质 加入封加入封闭蛋白溶液以封蛋白溶液以封闭载体体表面残留的蛋白表面残留的蛋白结合位点合位点洗洗涤并除去未并除去未结合的封合的封闭蛋白蛋白加受加受检标本（抗原）形成本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物洗洗涤除去其他除去其他未未结合的物合的物质 加加酶标抗体生成抗体生成抗体抗体 待待测抗原抗原 酶标记抗体抗体的复合物的复合物 彻底洗底洗涤未未结合的合的 酶标抗体抗体 加底物加底物进行行酶催化反催化反应 根据根据颜色反色反应的的程度程度进行行该抗原抗原的定性或定量的定性或定量测定定获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相洗涤除去未结合的加12 间接法是接法是检测抗体最常用的方抗体最常用的方法，其原理法，其原理为利用利用酶标记的抗抗体以的抗抗体以检测已与固相已与固相结合合的受的受检抗体，故称抗体，故称为间接法。接法。（二）（二）间接法接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗13包被固相包被固相载体体:用已知抗原包被用已知抗原包被固相固相载体体 加待加待检标本本:使相使相应抗体与固相抗原抗体与固相抗原结合合洗洗涤，除去无关的物，除去无关的物质 加加酶标抗抗体抗抗体:与固相与固相载体上抗原抗体体上抗原抗体复合物复合物结合；洗合；洗涤，除去，除去未未结合的合的酶标抗抗体抗抗体加底物加底物显色色 根据根据颜色反色反应的程度的程度进行行该抗原的定性或定量抗原的定性或定量测定定包被固相载体:加待检标本:加酶标抗抗体:加底物根据颜色反14（三）（三）竞争法争法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于抗原和半抗原的定量量测定，也可用于定，也可用于测定抗体定抗体。（三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，15用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相固相载体体 测定管加待定管加待测抗原和抗原和一定量的一定量的酶标抗原使二者与抗原使二者与固相抗体固相抗体竞争争结合合 对照管只加一定量照管只加一定量酶标抗原抗原与固相抗体直接与固相抗体直接结合合 分分别洗洗涤除去未除去未结合合的成分的成分 加底物加底物显色色分分别测定两管的吸光度定两管的吸光度值，根据根据对照管与照管与测定管吸光度定管吸光度值之比，之比，计算算标本中待本中待测抗原含量抗原含量用已知特异性测定管加待测抗原和对照管只加一定量酶标抗原分别洗16此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素例如杀暝松（FN）、邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐ELISA的应用实例载体连接形成固相抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。对照管由于只加照管由于只加酶标抗原，与固抗原，与固相抗体充分相抗体充分结合，故分解底物合，故分解底物显色深；色深；测定管的定管的显色程度色程度则随待随待测抗原和抗原和酶标抗原与固相抗体抗原与固相抗体竞争争结合的合的结果而果而异。如待异。如待测抗原量多，抗原量多，竞争性地抑制争性地抑制酶标抗原与固相抗体抗原与固相抗体结合，使固相上合，使固相上结合的合的酶标抗原量减少。因此，加入抗原量减少。因此，加入底物后底物后显色反色反应较弱。弱。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。17特点一：灵敏性特点一：灵敏性该测定法的灵敏度来自作定法的灵敏度来自作为报告集告集团的的酶。众所周知。众所周知,酶是一种有机催化是一种有机催化剂，很少，很少量的量的酶即可即可诱导大量的催化反大量的催化反应，产生可供生可供观察的察的显色反色反应现象。因此象。因此该体系常被称体系常被称为酶放大体系。放大体系。ELISAELISA实现了在了在细胞或胞或亚细胞水胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至甚至纳克水平上克水平上对其其进行定量。行定量。例如，在例如，在测定血清中某一物定血清中某一物质的含量的含量时，化学比色法的敏感度化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平，水平，酶反反应测定法的敏感度定法的敏感度约为510g/ml510g/ml。特点一：灵敏性18特点二：特异性特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原的其特异性来自抗体或抗原的选择性。性。抗原抗体的抗原抗体的结合合实质上只上只发生在抗原的生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之合位点之间。由于两者在化学由于两者在化学结构和空构和空间构型上呈互构型上呈互补关系，所以抗原抗体反关系，所以抗原抗体反应具有高度的具有高度的特异性。特异性。特点二：特异性19生物体系中的化学测量众所周知,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。该抗原的定性或定量测定再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）根据对照管与测定管吸光度值之比，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐计算标本中待测抗原含量饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。例如乙肝病毒中的例如乙肝病毒中的表面抗原（表面抗原（HBsAgHBsAg）、）、e e抗原（抗原（HBeAgHBeAg）和核心抗）和核心抗体（体（HBcAgHBcAg），），虽来源于来源于同一病毒，但同一病毒，但仅与其相与其相应的抗体的抗体结合，而不与合，而不与另外两种抗体反另外两种抗体反应。抗。抗原抗体反原抗体反应的的这种特异种特异性使免疫性使免疫测定能在一非定能在一非常复常复杂的蛋白的蛋白质化合物化合物（例如血清）中（例如血清）中测定某定某一特定的物一特定的物质，而不需，而不需先分离待先分离待检物。物。生物体系中的化学测量 例如乙肝病毒中的表面抗原（H20ELISAELISA应用用实例例ELISA应用实例21 饲料中料中盐酸克酸克伦特特罗的的测定定 饲料中毒素的料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速料中有害微生物的快速筛检（如沙（如沙门氏氏菌菌）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基甲基对硫磷残留分析硫磷残留分析 呋喃丹残留分析喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测 饲料中盐酸克伦特罗的测定 甲胺磷残留分析 ELISA在饲料22河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻啡、藻类毒素毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草主要有除草剂与与杀虫虫剂两大两大类例如例如杀暝松（暝松（FNFN）、）、甲氟磷酸异已甲氟磷酸异已酶（SOMANSOMAN）、）、草不草不绿（AlachorAlachor）、）、西西维因（因（CarbarylCarbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（CaptanCaptan）等。）等。农药的的检测：河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘 主要有除23ELISAELISA检测“非典型肺炎非典型肺炎”冠状病毒冠状病毒 ELISAELISA在在结缔组织病早期病早期诊断中的断中的应用用检测抗异抗异质性胞核核糖蛋白性胞核核糖蛋白A2A2（hnRNPA2hnRNPA2）/类风湿性关湿性关节炎炎（PtAPtA）3333抗体抗体ELISAELISA在疾病在疾病诊断中的作用断中的作用ELISAELISA法法检测幽幽门螺杆菌抗体螺杆菌抗体 ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔24ELISAELISA试剂盒商盒商业资讯ELISA试剂盒商业资讯25ELISA试剂盒盒ELISA试剂盒26酶联免疫吸附测定法课件27酶联免疫井免疫井酶联免疫井28DNM-9602GDNM-9602G酶标分析分析仪DNM-9602DNM-9602标配配酶标分析分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析分析仪几种几种酶标分析分析仪DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602 标配酶标分析仪29参考文献：参考文献：生物体系中的化学生物体系中的化学测量量Kentk.StewartRichardE.EBELKentk.StewartRichardE.EBEL著著 生命生命经纬普通免疫学普通免疫学课程程参考文献：30谢谢大家31酶联免疫吸附测定法课件32