生物化学基本实验技能训练(二)-721E型分光光度计的原理和使用方法课件

生物化学基本实验技能训练（二）生物化学基本实验技能训练（二）721E型分光光度计的原理型分光光度计的原理和使用方法和使用方法医学院生物化学教研室医学院生物化学教研室实验目的实验目的1、掌握、掌握721E分光光度计的原理、结构与操分光光度计的原理、结构与操 作作方法方法2、学习末知溶液的浓度测定方法、学习末知溶液的浓度测定方法3、制作、制作CuSO4标准曲线，求得未知标准曲线，求得未知CuSO4溶溶液的浓度液的浓度主要内容主要内容分光光度法的原理分光光度法的原理吸光度的测量吸光度的测量定量分析方法定量分析方法721E分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习分光光度计操作练习分光光度法分光光度法问题：问题：如何测定溶液中某一种物质的浓度？如何测定溶液中某一种物质的浓度？提示提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等)光分析光分析：经历了经历了目视比色目视比色、光电比色光电比色和和分光光度法分光光度法几个不同阶段。几个不同阶段。分光光度法分光光度法：利用溶液对：利用溶液对单色光单色光的的吸收度吸收度来确定溶来确定溶液中液中有色物质有色物质的含量的含量 有色物质有色物质溶液溶液颜色的深浅颜色的深浅与其与其浓度浓度有关，浓度愈大，颜有关，浓度愈大，颜色愈深色愈深光的基本性质光的基本性质 光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。波长波长()、频率、频率()和光速和光速(c)之间的关系是之间的关系是 =c/电磁波谱图电磁波谱图可见光区：可见光区：波长范围约为波长范围约为380760nm近紫外光：近紫外光：280380nm图图11 电磁波谱电磁波谱溶液的颜色溶液的颜色当当白光白光通过某一通过某一溶液溶液时，该溶液时，该溶液会选择性地会选择性地吸收吸收某些波长光某些波长光而而让让那些未被吸收的那些未被吸收的光透射过去光透射过去，溶溶液呈现透射光的液呈现透射光的颜色颜色。被吸收的光被吸收的光与与透透射过去的光射过去的光称为称为互补色光互补色光物物质的的颜色色吸收光吸收光颜色色吸收光波吸收光波长范范围(nm)黄黄绿紫紫380435黄黄蓝435480橙橙红绿蓝480500红紫紫绿500560紫紫黄黄绿560580蓝黄黄580595绿蓝橙橙595650蓝绿红650760 吸收曲线吸收曲线 以以波波长长为为横横坐坐标标，吸吸光光度度为为纵纵坐坐标标作作图图，即即可可得得到到一一条条吸吸光光度度随随波波长长变变化化的的曲曲线线，称称之之为为吸吸收收曲曲线线或或吸吸收收光谱光谱。光光吸吸收收程程度度最最大大处处的的波波长长，称称为为最最大大吸吸收收波波长长，常常用用max表示。表示。在在正正常常情情况况下下，选选用用不不同同浓浓度度的的某某种种溶溶液液，最最大大吸吸收收波长是固定不变的波长是固定不变的。图1-2 KMnO4溶液的吸收曲线A(nm)应用：应用：可作为物质定性、定量可作为物质定性、定量分析的依据分析的依据入射光入射光Io透射光透射光It反射光反射光散射光散射光吸收光吸收光Ia光吸收的基本概念光吸收的基本概念 n n 条件：条件：条件：条件：一束一束一束一束平行单色光平行单色光平行单色光平行单色光照射到照射到照射到照射到均匀的、非散射的均匀的、非散射的均匀的、非散射的均匀的、非散射的溶液时溶液时溶液时溶液时 I I0 0=I Ia a+I+Ir r+I+It t I I0 0为入射光强度为入射光强度为入射光强度为入射光强度 I Ia a为吸收光强度为吸收光强度为吸收光强度为吸收光强度 I Ir r为反射光强度为反射光强度为反射光强度为反射光强度 I It t为透射光强度为透射光强度为透射光强度为透射光强度透光率与吸光度透光率与吸光度 透光率透光率(Transmittance，T)T=It/I0100 透光率的变化范围：透光率的变化范围：0-100%吸光度吸光度(absorbance，A)：透光率的负对数透光率的负对数，又称为，又称为光密度光密度(Optical density，OD)A=-lgT=lg(I0/It)吸光度的变化范围：吸光度的变化范围：0 0-Lambert-Beer定律定律条件：单色光，稀溶液条件：单色光，稀溶液Lambert定律（定律（1760年）：年）：A=k1LBeer定律（定律（1852年）：年）：A=k2C 吸光度吸光度（Absorbance）吸光系数吸光系数液层厚度液层厚度溶液浓度溶液浓度Lambert-Beer定律定律：光吸收基本定律光吸收基本定律吸光系数是物质的特征性常数吸光系数是物质的特征性常数吸光系数是物质的特征性常数吸光系数是物质的特征性常数A=kLC吸光光度法的原理吸光光度法的原理吸光度的测量吸光度的测量定量分析方法定量分析方法721E分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习分光光度计操作练习仪器结构：仪器结构：分光光度计分光光度计光源光源钨丝灯钨丝灯氢灯或氘灯氢灯或氘灯单色器单色器棱镜棱镜光栅光栅吸收池（比色杯、比色皿）吸收池（比色杯、比色皿）玻璃玻璃石英石英检测器检测器光电管光电管光电倍增管光电倍增管显示器显示器检流计检流计数码管显示数码管显示 紫外光紫外光可见光可见光 紫外光紫外光可见光可见光分光光度计的误差分光光度计的误差 Lambert-Beer定律偏离的原因定律偏离的原因物质浓度太高物质浓度太高，改变了被吸收光的折射率，改变了被吸收光的折射率仪器的局限性仪器的局限性入射光的波长不纯；杂散光的干扰；光电检测器的疲劳现象入射光的波长不纯；杂散光的干扰；光电检测器的疲劳现象 非对称的化学平衡非对称的化学平衡因其浓度、因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生解离、溶剂和温度的改变，发生解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变化而发生偏离。缔合、溶剂化和互变异构等化学变化而发生偏离。测量条件的选择测量条件的选择入射光波长入射光波长一般选用被测物质溶液的一般选用被测物质溶液的max。可以获得较。可以获得较高的灵敏度高的灵敏度控制适当的吸光度测量范围控制适当的吸光度测量范围最小误差出现在最小误差出现在T%=20-65%(A=0.2-0.7)的的范围内范围内 选择适当的参比溶液选择适当的参比溶液参比溶液的选择参比溶液的选择 1、溶剂参比、溶剂参比当当被测试液、显色剂及其他试剂被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都在测定波长处都无吸收无吸收时，时，可用可用纯溶剂纯溶剂(如蒸馏水如蒸馏水)作参比溶液。作参比溶液。2、试剂参比、试剂参比当被测试液无吸收，而当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波长处有显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收吸收时，时，可用可用不加试样的不加试样的“试剂空白试剂空白”作参比溶液。作参比溶液。3、试样参比、试样参比若若被测试液本身在测定波长处有吸收被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，而显色剂等无吸收时，时，可用可用不加显色剂等的不加显色剂等的“试样空白试样空白”作参比溶液作参比溶液。吸光光度法的原理吸光光度法的原理吸光度的测量吸光度的测量定量分析方法定量分析方法721E分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习分光光度计操作练习定量分析方法定量分析方法-1标准对照法标准对照法根据根据Lambert-Beer定律得：定律得：As=abcs Ax=abcx 标准对照法的优缺点标准对照法的优缺点定量分析方法定量分析方法-2标准曲线法标准曲线法配制一系列不同的已知浓度的测定物溶配制一系列不同的已知浓度的测定物溶液液，按测定管同样处理显色，分别读取，按测定管同样处理显色，分别读取各管吸光度；各管吸光度；以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。绘制标准曲线。测定时每一个浓度至少应同时做测定时每一个浓度至少应同时做三管（平行管），取其平均值进三管（平行管），取其平均值进行标准曲线的绘制。行标准曲线的绘制。AxCx测定未知溶液测定未知溶液的吸光度，直接从标的吸光度，直接从标准曲线上查得测定物的浓度准曲线上查得测定物的浓度。标准曲线法的优缺点标准曲线法的优缺点定量分析方法定量分析方法-3摩尔吸光系数法摩尔吸光系数法摩尔吸光系数摩尔吸光系数是溶液浓度为是溶液浓度为1mol/L，液层厚，液层厚度为度为1cm的吸光度。的吸光度。在已知在已知的情况下的情况下(查文献查文献)，读取测定液厚度为，读取测定液厚度为1cm时的吸光度，即可根据下式求得测定液的时的吸光度，即可根据下式求得测定液的浓度。浓度。C=A/摩尔吸光系数法的优缺点摩尔吸光系数法的优缺点吸光光度法的原理吸光光度法的原理吸光度的测量吸光度的测量定量分析方法定量分析方法721E分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习分光光度计操作练习721E分光光度计的结构分光光度计的结构 1 1电源开关电源开关2 2“波长调节波长调节”旋旋纽纽3 3方式设定键方式设定键 （MODEMODE）4.“4.“100%T100%T0A0A”键键 5 5“0 0T T”键键6 6比色皿架（样品比色皿架（样品 室）室）7 7比色皿架拉杆比色皿架拉杆功能键介绍功能键介绍 1电源开关电源开关2“波长调节波长调节”旋纽：设置波长。旋纽：设置波长。360-760nm.3“MODE”键键：设置测试方式：设置测试方式：T与与A4“0T”键：键：将比色皿架处于将比色皿架处于“调零透射比调零透射比”位置，位置，调调T为零为零。5“100%T0A”键：键：使比色皿处于使比色皿处于“参比样品参比样品”位，用于调整位，用于调整“T为为100%”或或“A为零为零”。6比色皿架：插放比色皿，有比色皿架：插放比色皿，有4个槽位。个槽位。7拉杆：推或拉比色皿架拉杆，听到拉杆：推或拉比色皿架拉杆，听到“咔嚓咔嚓”声时，比色声时，比色皿已置光路中。第一声皿已置光路中。第一声“咔嚓咔嚓”，表示比色皿处于，表示比色皿处于“参比参比样品样品”位，第二声位，第二声“咔嚓咔嚓”，表示比色皿处于表示比色皿处于“调零透调零透射比射比”仪器预热与调试仪器预热与调试开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。成仪器故障。1打开电源开关，使仪器打开电源开关，使仪器预热预热20分钟分钟。2用用“波长调节波长调节”旋钮将波长设定在要使用的旋钮将波长设定在要使用的分析波长位置上。分析波长位置上。3盖好样品室盖。用盖好样品室盖。用“方式设定方式设定”键（键（MODE）改变测试为透光率（改变测试为透光率（T）方式。）方式。4调调“T=0”：用比色皿选择拉杆使比色皿槽处：用比色皿选择拉杆使比色皿槽处于于“调零透射比调零透射比”位置，在位置，在T方式下，按方式下，按“0T”键，调透光率为零。键，调透光率为零。5调调“T=100”，推或拉比色皿架拉杆，使比色，推或拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于皿槽处于“参比样品参比样品”位置，按位置，按“100%T”调调100%透射比。透射比。样品测试样品测试1将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中拿放比色皿时应持其拿放比色皿时应持其“毛面毛面”不要接触不要接触“光面光面”比色皿内的溶液面高度不应低于比色皿内的溶液面高度不应低于2.5cm被测试的样品中不能有气泡和漂浮物被测试的样品中不能有气泡和漂浮物比色皿外的液体用滤纸吸干比色皿外的液体用滤纸吸干2打打开开样样品品室室盖盖，将将盛盛有有溶溶液液的的比比色色皿皿分分别别垂垂直直插插入入比比色色皿皿槽槽中中，盖盖上上样样品品室室盖盖比色皿的比色皿的“光面光面”要与光源在一条线上要与光源在一条线上,垂直放置垂直放置参比样品通常放在样品架的第一个槽位中参比样品通常放在样品架的第一个槽位中3调调“T=100”：将将参比溶液参比溶液推入光路中，用推入光路中，用“MODE”键改变测试为键改变测试为“T”，按，按“100%T0A”键调整键调整T=100或或A=0 仪器在自动调整过程中，显示器显示仪器在自动调整过程中，显示器显示“BLA”，数秒后显示，数秒后显示100。4.调调“T=0”：拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“调零透射比调零透射比”位置，在位置，在T方式方式下，按下，按“0T”键，调键，调T=05.重复步骤重复步骤“3”和和“4”，至，至“T=100”和和“T=0”不再改变。不再改变。6.按按 “MODE”将测试方式设置为将测试方式设置为A方式方式7拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“样品样品”位，位，仪器自动显示该样本的吸光仪器自动显示该样本的吸光度度，记录数据记录数据。吸光光度法的原理吸光光度法的原理吸光度的测量吸光度的测量定量分析方法定量分析方法721E分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习分光光度计操作练习721E分光光度计操作练习分光光度计操作练习已知已知CuSO4溶液的浓度溶液的浓度5%，测定末知，测定末知CuSO4溶液的浓度溶液的浓度方法方法 1、制作、制作CuSO4标准曲线标准曲线，测定未知，测定未知CuSO4溶液的浓度溶液的浓度 2、利用、利用标准对照法标准对照法测定测定Reagents&Materials5%CuSO4 X%CuSO4dH2OTest tubesPipettesSpectrophotometerCuvette实验操作实验操作取取6只只试管，按右表操试管，按右表操作作混匀混匀，在波长，在波长650nm，用，用蒸馏水蒸馏水(参比溶液）参比溶液）校正零点。读取各管吸校正零点。读取各管吸光度，记入右表。光度，记入右表。方法一：方法一：以浓度为横坐标，以浓度为横坐标，吸光度为纵轴，吸光度为纵轴，绘制标绘制标准曲线准曲线。读取未知浓度读取未知浓度CuSO4溶液的光密度，溶液的光密度，从标准从标准曲线上查出其浓度曲线上查出其浓度。方法二：方法二：以以任意一管任意一管为标为标准管，准管，计算计算未知浓度未知浓度CuSO4溶液的浓度溶液的浓度。试管号试管号5%CuSO4溶液溶液(ml)蒸馏水蒸馏水(ml)浓度浓度（%）光密度光密度11.004.0022.003.0033.002.0044.001.0055.000.006X%CuSO4 5.000.002.Cuso4(x%)5ml,AxAxCxX%CuSO4:Ax=?Cx=?1.标准曲线法标准曲线法2.标准对照法标准对照法x%CuSO4,A测定测定=?5%CuSO4-the standard,A标准标准=?Calculation:=？讨论讨论 比较两种不同方法得到的实验结果，分比较两种不同方法得到的实验结果，分析误差产生的原因及减小措施。析误差产生的原因及减小措施。思考题思考题下次实验下次实验血清血清总蛋白总蛋白与与白白/球比值球比值的测定的测定书写预习报告，书写预习报告，包括实验目的、原理、试剂等，包括实验目的、原理、试剂等，实验步骤暂不写实验步骤暂不写第一、二、三组同学制作第一、二、三组同学制作ppt并演讲并演讲组长安排本次做清洁的同学组长安排本次做清洁的同学