细胞免疫功能检测平台的建立和应用课件

细胞免疫功能检测平台的建立和应用细胞免疫功能检测平台的建立和应用1T细胞免疫功能与感染n nT细胞免疫功能的抗感染作用 正常人的免疫功能正常人的免疫功能 T T细胞免疫的抗感染作用细胞免疫的抗感染作用n nT细胞免疫功能的测定 T T细胞亚群细胞亚群 T T细胞功能细胞功能n nT细胞免疫功能测定的临床意义T细胞免疫功能与感染T细胞免疫功能的抗感染作用细胞免疫功能检测平台的建立和应用课件机体的免疫系统n n非特异免疫 皮肤粘膜皮肤粘膜,吞噬细胞吞噬细胞,NKNK细胞细胞,补体补体,正常菌群正常菌群n n特异性免疫 细胞免疫细胞免疫:CD4+CD4+细胞细胞,CD8+CD8+细胞细胞 体液免疫体液免疫:BB细胞细胞机体的免疫系统非特异免疫机体的免疫系统CD4细胞非特异性免疫特异性免疫NK细胞，吞噬细胞B细胞CD8细胞机体的免疫系统CD4细胞非特异性免疫特异性免疫NK细胞，吞噬5 5CD4+细胞的免疫中枢指挥功能CD4+细胞的免疫中枢指挥功能CD4+细胞的免疫中枢指挥功能CD4+细胞的免疫中枢指挥功能7 7CD4+细胞的产生和分群记忆 CD4胸腺纯真 CD4Net Naive CD4#5x107/天抗原CD4+细胞的产生和分群记忆 CD4胸腺纯真 CD4Net 纯真 纯真和记忆/效应4 4细胞亚群的产生记忆效应凋亡胸腺效应效应效应纯真 纯真和记忆/效应4细胞亚群的产生记忆效应凋亡胸腺纯真 CD4和记忆CD4细胞纯真 CD4和记忆CD4细胞1010纯真/记忆CD+细胞分泌不同的介素纯真/记忆CD+细胞分泌不同的介素细胞免疫功能的抗感染作用n n感染发生的两个基本要素感染发生的两个基本要素:病原体和机体免疫功能病原体和机体免疫功能n n免疫功能对疾病转归的影响免疫功能对疾病转归的影响:1.1.1.1.对免疫功能正常的人不起致病作用的病原体对免疫功能正常的人不起致病作用的病原体,在免疫功能低下的人身上可在免疫功能低下的人身上可发生致命性的感染发生致命性的感染;2.2.2.2.免疫功能正常的人发生某种感染后可特别快恢复免疫功能正常的人发生某种感染后可特别快恢复,而在免疫功能紊乱的人而在免疫功能紊乱的人则成为慢性状态则成为慢性状态;3.3.3.3.对同样的病原体所导致的感染对同样的病原体所导致的感染,给予同样的抗感染治疗给予同样的抗感染治疗,转归完全不一样转归完全不一样细胞免疫功能的抗感染作用感染发生的两个基本要素:病原体和机体细胞免疫功能的抗感染作用为什么？乙肝病毒感染:有人为乙肝病毒携带者,也有人成为慢性乙肝病人？HPV感染:多数人表现为无症状的HPV潜伏感染者,少数人表现为复发性HPV CMV感染:90%的正常人隐性感染终生带病毒,但免疫功能低下时可致死？细胞免疫功能的抗感染作用为什么？1313细胞免疫功能检测平台的建立和应用课件 n n HIV感染的自然史 CD4CD4细胞细胞(cell/mm3cell/mm3)800800400400 急性感染期 无症状期 艾滋病前期和艾滋病期 CD4 病毒载量抗HIV 的CTLHIV抗体 HIV感染的自然史 CD4细胞 急性感染期 HIV感染者的三种临床转归VirusCD4CD8 a aHIVCD4CD4CD8CD8 a aHIVVirusVirusStandard 8 yFast:4-5 y:(2%)(CCR genes,HLA B35Slow:10 y:(2%),CCR genes,HLA B57HIV感染者的三种临床转归VirusCD4CD8 aHIVC免疫功能与机会性感染相关性 years200CD4 counts白念菌Zona卡波济肉瘤淋巴瘤PCP弓型体CMVMAIC48艾滋病期HIV load210免疫功能与机会性感染相关性 years200CD4 coun细胞免疫功能的抗感染作用不重视机体免疫功能的后果n n化疗药物的滥用n n耐药菌的产生n n二重感染的发生n n进一步损害免疫功能细胞免疫功能的抗感染作用不重视机体免疫功能的后果化疗药物细胞免疫功能与感染细胞免疫功能的抗感染作用 正常人的免疫功能 细胞免疫的抗感染作用T细胞免疫功能的测定 T细胞亚群 T细胞功能细胞免疫功能测定的临床意义细胞免疫功能与感染细胞免疫功能的抗感染作用细胞免疫功能与感染免疫功能测定方法n n体内:PPDPPD试验？试验？n n体外:体液免疫:B B细胞数量细胞数量,免疫球蛋白定量免疫球蛋白定量 细胞免疫:T细胞亚群的数量和功能 (流式细胞仪流式细胞仪,ELISAELISA,ELISPOTELISPOT)细胞免疫功能与感染免疫功能测定方法体内:T细胞免疫功能的测定T细胞功能（细胞介素，增殖反应）功能亚群（CD28）激活亚群（CD38、HLA-Dr）纯真亚群和记忆亚群凋亡亚群,Treg（T细胞、CD4、CD8、B、NK）T细胞免疫功能的测定T细胞功能功能亚群（CD28）（T细胞、A cytometer looks like an easy-to-use machine but look inside:Its a plex laser machine!A cytometer looks like an easyPMTPMTPMTPMT 4DichroicFiltersBandpassFiltersFlow Cytometry PrincipleLaser 1234Flow cellPMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBanT细胞免疫功能的测定T细胞功能（细胞介素，增殖反应）功能亚群（CD28）激活亚群（CD38、HLA-Dr）纯真亚群和记忆亚群凋亡亚群,Treg（T细胞、CD4、CD8、B、NK）T细胞免疫功能的测定T细胞功能功能亚群（CD28）（T细胞、淋巴细胞免疫表型检测指标B B淋巴细胞淋巴细胞(CD19+CD19+)反映机体体液免疫功能状态反映机体体液免疫功能状态 自然杀伤细胞自然杀伤细胞(CD3-CD3-CD16/56+CD16/56+)反映机体天然免疫功能状态反映机体天然免疫功能状态 辅助性及杀伤性辅助性及杀伤性T T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+CD4+/CD8+CD3+CD4+/CD8+)反映机体细胞免疫功能状态反映机体细胞免疫功能状态 T T淋巴细胞纯真和记忆亚群淋巴细胞纯真和记忆亚群(CD4+CD45RA+62L+/CCD4+CD45RA+62L+/CD45RO+D45RO+)判断判断CD3+CD4+CD3+CD4+降低的重要指标降低的重要指标T T淋巴细胞的激活亚群淋巴细胞的激活亚群(CD4+/CD8+CD38+/HLCD4+/CD8+CD38+/HLA-DR+A-DR+)评价细胞的激活状态。评价细胞的激活状态。T T淋巴细胞的功能亚群淋巴细胞的功能亚群(CD4+/CD8+CD28+CD4+/CD8+CD28+)衡量衡量T T淋巴细胞功能的重要指标。淋巴细胞功能的重要指标。淋巴细胞免疫表型检测指标B淋巴细胞(CD19+)反映机体体不同年龄组正常细胞亚群的建立淋巴细胞表型淋巴细胞表型青年青年(18-40y,N=57)(18-40y,N=57)中年中年(41-60,N=45)(41-60,N=45)老年老年(大于大于61y,N=52)61y,N=52)B B淋巴细胞淋巴细胞6 6 6 6、430430430430、6 6 6 61045711045711045711045714 4 4 4、219219219219、7 7 7 7775667756677566775662 2 2 2、424424424424、3 3 3 339544395443954439544自然杀伤细胞自然杀伤细胞4 4 4 4、235235235235、6 6 6 6968729687296872968723 3 3 3、540540540540、4 4 4 4539855398553985539854 4 4 4、149149149149、8 8 8 8711340711340711340711340辅助性辅助性T T淋巴细胞淋巴细胞25252525、164164164164、0 0 0 0442164544216454421645442164519191919、854854854854、0 0 0 0259194625919462591946259194619191919、655655655655、2 2 2 22911730291173029117302911730杀伤性杀伤性T T淋巴细胞淋巴细胞16161616、747747747747、2 2 2 2321116632111663211166321116615151515、942942942942、3 3 3 32088252088252088252088258 8 8 8、244244244244、4 4 4 41731114173111417311141731114T T淋巴细胞纯真亚淋巴细胞纯真亚群群17171717、461461461461、5 5 5 51175861175861175861175865 5 5 5、268268268268、5 5 5 5407164071640716407162 2 2 2、262262262262、7 7 7 725688256882568825688CD4/CD8CD4/CD80 0、573573、28280 0、553553、30300 0、625625、9797不同年龄组正常细胞亚群的建立淋巴细胞表型青年(18-40y细胞免疫功能测定方法T细胞功能的测定n nT细胞增殖功能 同位素同位素H3H3掺入试验掺入试验 BrdU BrdU,Ki67Ki67 CFSU CFSUn nT细胞毒试验(CTL)和细胞介素测定 同位素同位素Cr51Cr51 四联体四联体 ELISAELISA 流式细胞仪流式细胞仪 ELISPOTELISPOT细胞免疫功能测定方法T细胞功能的测定T细胞增殖功能ELISPOT 方法ELISPOTELISPOT方法是目前国际上广泛应用的较新的体外测定特异性抗体方法是目前国际上广泛应用的较新的体外测定特异性抗体分分泌细胞和细胞因子分泌细胞的方法。该方法可在单细胞水平检测淋泌细胞和细胞因子分泌细胞的方法。该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及计数特异性抗原刺激下细胞因子巴细胞对特异性抗原的反应能力及计数特异性抗原刺激下细胞因子分泌细胞的频数。分泌细胞的频数。优点优点:敏感敏感-能检测产生细胞因子频率极低的细胞能检测产生细胞因子频率极低的细胞,灵敏度高达灵敏度高达 1/10000001/1000000。特异特异 直观直观-可直截了当在显微镜下人工计数斑点或通过可直截了当在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOTELISPOT分分 析系统对斑点进行计数析系统对斑点进行计数,1 1 个斑点代表个斑点代表 1 1 个特异个特异性性 抗体分泌细胞或细胞因子分泌细胞。抗体分泌细胞或细胞因子分泌细胞。ELISPOT 方法ELISPOT方法是目前国际上广泛应用的ELISPOT 原理-PBMC-刺激原孵育16 18h或4048hIFN 抗体BSPA酶和底物斑点!ELISPOT 原理-PBMC-刺激原孵育16 18ELISpot 结果阴性对比阴性对比阳性对比阳性对比样本孔样本孔样本孔样本孔图中的每个斑点代表一个能分泌IFN-的抗原特异性CD4+T细胞或CTLELISpot 结果阴性对比阳性对比样本孔样本孔图中的每个斑T细胞免疫功能与感染n nT细胞免疫功能的抗感染作用 正常人的免疫功能正常人的免疫功能 T T细胞免疫的抗感染作用细胞免疫的抗感染作用n nT细胞免疫功能的测定 T T细胞亚群细胞亚群 T T细胞功能细胞功能n nT细胞免疫功能测定的临床意义T细胞免疫功能与感染T细胞免疫功能的抗感染作用T细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义n nHIV感染和艾滋病n n其它各种感染性疾病-病毒感染病毒感染:SARS,HBVSARS,HBV,HCVHCV,EBVEBV,CMVCMV,HFRS,HFMDHFRS,HFMD-结核病结核病,真菌感染。真菌感染。n n肿瘤和化疗病人的免疫功能监测n n器官移植病人的免疫监测n n自身免疫病和过敏性疾病T细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义HIV感染细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义中国HIV/AIDS的免疫病理改变和免疫重建细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义中国HIV/3333艾滋病的主要免疫病理改变n nCD4+T 细胞数的减少;n nCD4+T 功能的减低;n n异常的细胞免疫激活。艾滋病的主要免疫病理改变CD4+T 细胞数的减少;n n HIV感染的自然史 CD4CD4细胞细胞(cell/mm3cell/mm3)800800400400 急性感染期 无症状期 艾滋病前期和艾滋病期 CD4 病毒载量抗HIV 的CTLHIV抗体 HIV感染的自然史 CD4细胞 急性感染期 HIV/AIDS 患者淋巴细胞亚群与正常对比比较HIV/AIDSHIV/AIDSHIV/AIDSHIV/AIDS患者患者n=263n=263n=263n=263正常对比正常对比n=57n=57n=57n=57B B B B细胞计数细胞计数109(159,71)109(159,71)109(159,71)109(159,71)*261(294,207)261(294,207)261(294,207)261(294,207)NKNKNKNK细胞计数细胞计数110(195,61)110(195,61)110(195,61)110(195,61)*339(471,234)339(471,234)339(471,234)339(471,234)CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T计数计数205(348,63)205(348,63)205(348,63)205(348,63)*787(1058,615)787(1058,615)787(1058,615)787(1058,615)纯真纯真CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T计数计数29(86,6)29(86,6)29(86,6)29(86,6)*328(382,256)328(382,256)328(382,256)328(382,256)纯真纯真CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T比例比例18181818、5(325(325(325(32、0,60,60,60,6、5)5)5)5)*35353535、4(454(454(454(45、5,305,305,305,30、0)0)0)0)记忆记忆CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T计数计数136(232,44)136(232,44)136(232,44)136(232,44)*453(538,360)453(538,360)453(538,360)453(538,360)记忆记忆CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T比例比例72727272、6(836(836(836(83、2,602,602,602,60、1)1)1)1)*56565656、0(660(660(660(66、3,473,473,473,47、7)7)7)7)CD4+CD28+CD4+CD28+CD4+CD28+CD4+CD28+功能亚群比例功能亚群比例86868686、1(941(941(941(94、0,680,680,680,68、3)3)3)3)*95959595、7(977(977(977(97、6,916,916,916,91、0)0)0)0)CD8+TCD8+TCD8+TCD8+T计数计数652(914,422)652(914,422)652(914,422)652(914,422)538(642,480)538(642,480)538(642,480)538(642,480)CD8+CD38+CD8+CD38+CD8+CD38+CD8+CD38+激活亚群比例激活亚群比例84848484、3(923(923(923(92、7,697,697,697,69、0)0)0)0)*42424242、6(506(506(506(50、6,366,366,366,36、1)1)1)1)(计数:个/mm3,比例:%,数值以中位数(上四分位数,下四分位数)表示)*与正常对比组相比存在显著差异P P00、001001。与正常对比组相比存在显著差异P P=0=0、021021。HIV/AIDS 患者淋巴细胞亚群与正常对比比较HIV/AI早中晚3组患者淋巴细胞亚群的比较分组分组组组n=131n=131n=131n=131组组n=66n=66n=66n=66组组n=66n=66n=66n=66CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T细胞计数细胞计数63(134,20)63(134,20)63(134,20)63(134,20)279(317,246)279(317,246)279(317,246)279(317,246)493(627,413)493(627,413)493(627,413)493(627,413)病毒载量病毒载量4 4 4 4、88(588(588(588(5、41,441,441,441,4、46)46)46)46)4 4 4 4、3(43(43(43(4、71,371,371,371,3、69)69)69)69)3 3 3 3、49(449(449(449(4、22,222,222,222,2、73)73)73)73)B B B B细胞计数细胞计数84(118,51)84(118,51)84(118,51)84(118,51)*130(171,91)130(171,91)130(171,91)130(171,91)161(216,123)161(216,123)161(216,123)161(216,123)纯真纯真CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T比例比例11111111、5(255(255(255(25、5,45,45,45,4、7)*7)*7)*7)*26262626、3(373(373(373(37、4,15)4,15)4,15)4,15)25252525、4(404(404(404(40、2,142,142,142,14、1)1)1)1)记忆记忆CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T比例比例77777777、8(888(888(888(88、3,663,663,663,66、7)*7)*7)*7)*67676767、2(792(792(792(79、1,58)1,58)1,58)1,58)64646464、9(779(779(779(77、2,542,542,542,54、1)1)1)1)CD4+CD28+T/CD4+TCD4+CD28+T/CD4+TCD4+CD28+T/CD4+TCD4+CD28+T/CD4+T72727272、7(897(897(897(89、3,523,523,523,52、8)8)8)8)*92929292、9(959(959(959(95、8,858,858,858,85、1)1)1)1)91919191、3(943(943(943(94、9,829,829,829,82、7)7)7)7)CD8+CD38+T/CD8+TCD8+CD38+T/CD8+TCD8+CD38+T/CD8+TCD8+CD38+T/CD8+T90909090、2(942(942(942(94、7,807,807,807,80、1)1)1)1)*78787878、9(869(869(869(86、7,667,667,667,66、4)4)4)4)69(8469(8469(8469(84、9,619,619,619,61、5)5)5)5)组与、组相比P P00、001,001,组与组相比P P00、001001。*组与、两组均存在显著差异P P00、001,001,、组两组无显著差异。(计数:个/mm3,比例:%,数值以中位数(上四分位数,下四分位数)表示)早中晚3组患者淋巴细胞亚群的比较组组组CD4+THIV/AIDS的免疫病理改变选择性纯真T4细胞的减少正常人HIV感染者AIDS病人HIV/AIDS的免疫病理改变选择性纯真T4细胞的减少正3838HIV/AIDS的免疫病理改变T4细胞辅刺激信号受体的表达减少正常人HIV感染者AIDS病人HIV/AIDS的免疫病理改变T4细胞辅刺激信号受体的表3939CD28CD28T T细胞辅刺激信号受体CD28T细胞辅刺激信号受体4040HIV/AIDS的免疫病理改变异常的T细胞免疫激活AIDS病人HIV感染者正常人HIV/AIDS的免疫病理改变异常的T细胞免疫激活AID4141中国艾滋病病人的免疫改变特点n n艾滋病病人有选择性的纯真艾滋病病人有选择性的纯真 T4T4细胞减少细胞减少;n nCD4+CD28+CD4+CD28+是细胞免疫功能的标记指标是细胞免疫功能的标记指标;n nCD8+CD38+CD8+CD38+CD8+CD38+CD8+CD38+亚群是疾病进展和病毒复制的预测指标。亚群是疾病进展和病毒复制的预测指标。、n nHIVHIV感染当感染当CD4+TCD4+T细胞计数低于细胞计数低于200200个个/mm/mm3 3时时:CD28CD28表达下降较感染早中期更为严重表达下降较感染早中期更为严重纯真纯真CD4+TCD4+T细胞减少的速率较感染早中期明显加快细胞减少的速率较感染早中期明显加快 异常的免疫激活更为严重异常的免疫激活更为严重中国艾滋病病人的免疫改变特点艾滋病病人有选择性的纯真 T4细T细胞免疫功能检测在SARS诊治中的应用T细胞免疫功能检测在SARS诊治中的应用T细胞检测对SARS诊断的意义n nSARS病人CD4+细胞(98%)和CD8+(80%)细胞同时减少;n n发生在发病一周内(有些发生在胸片改变之前)n nT细胞检测有助于SARS的早期诊断T细胞检测对SARS诊断的意义SARS病人CD4+细胞(98细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义其它病毒感染结核病真菌感染细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义其它病毒感染T细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义n nHIV感染和艾滋病n n其它感染性疾病-病毒感染病毒感染:HBVHBV,HCVHCV,EBVEBV,CMVCMV,HFMD,HFRSHFMD,HFRS-结核病结核病,真菌感染。真菌感染。n n肿瘤和化疗病人的免疫功能监测n n器官移植病人的免疫监测n n自身免疫病和过敏性疾病T细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义HIV感染感感谢您的聆听！您的聆听！感谢您的聆听！47