新生儿溶血三项检测的临床应用讲义课件

新生儿溶血三项检测的新生儿溶血三项检测的临床应用临床应用有报道有报道:占新生儿溶血比例ABO溶血病85.3%Rh溶血病14.6%MN溶血病0.1%新生儿溶血病新生儿溶血病(Hemolytic disease of newborn HDN）,系系指母、婴血型不合引起的同族免疫性溶血指母、婴血型不合引起的同族免疫性溶血;已发现的人类已发现的人类29个血型系统中，以个血型系统中，以ABO血型不合最常见，血型不合最常见，Rh血型不合血型不合较少见较少见;胎儿从父亲遗传而来的红细胞抗原恰为母亲所缺少胎儿从父亲遗传而来的红细胞抗原恰为母亲所缺少,胎儿红细胎儿红细胞通过胎盘进入母体血循环中刺激母体产生相应的血型抗胞通过胎盘进入母体血循环中刺激母体产生相应的血型抗体（体（IgGIgG）。）。此抗体又可通过胎盘进入胎儿血循环中导致胎儿、新此抗体又可通过胎盘进入胎儿血循环中导致胎儿、新生儿体内特异性抗原抗体反应，使红细胞致敏单核生儿体内特异性抗原抗体反应，使红细胞致敏单核-吞噬吞噬细胞系统内破坏而溶血。细胞系统内破坏而溶血。ABO溶血病的病因和发病机制溶血病的病因和发病机制ABO血型的遗传血型的遗传有有A基因者称基因者称A型，有型，有B基因者称基因者称B型，同时有型，同时有A、B二二个基因者称个基因者称AB型，有型，有H基因而无基因而无A、B基因为基因为O型型假如母假如母“O”型，父型，父“A”型（纯合子或杂合子）型（纯合子或杂合子）母基因母基因型型OOAOA父基因父基因型型AA子基因型子基因型子血型子血型AOOO母基因母基因型型OO父基因父基因型型AOAO或或或或ABO血型抗体血型抗体 正常情况下，红细胞上缺乏正常情况下，红细胞上缺乏A或或B抗原时，血浆中抗原时，血浆中存在相应的抗体即抗存在相应的抗体即抗A抗体或抗抗体或抗B抗体为天然抗体，抗体为天然抗体，以以IgM为主，实质是由于机体与广泛存在的类为主，实质是由于机体与广泛存在的类ABO物质接触产生。物质接触产生。如果由于输血、怀孕或类如果由于输血、怀孕或类ABO物质的刺激使物质的刺激使抗体浓度增加，这种免疫抗抗体浓度增加，这种免疫抗A或抗或抗B抗体多半为抗体多半为IgG，特别是，特别是O型母亲。型母亲。血型基因型血浆中可以存在的抗体OOO抗A抗体和抗B抗体AAA AO抗B抗体BBB BO抗A抗体ABAB无ABO血型与抗体血型与抗体ABO溶血病可发生在溶血病可发生在怀孕第一胎怀孕第一胎 自然界存在自然界存在A或或B血型物质如某些植物、寄生虫、伤血型物质如某些植物、寄生虫、伤寒疫苗、破伤风及白喉类毒素等。寒疫苗、破伤风及白喉类毒素等。O型母亲在第一次妊娠前，已接受过型母亲在第一次妊娠前，已接受过A或或B血型物血型物质的刺激，血中抗质的刺激，血中抗A或抗或抗B(IgG)效价较高。效价较高。怀孕第一胎时抗体即可进入胎儿血循环引起溶血。怀孕第一胎时抗体即可进入胎儿血循环引起溶血。ABO血型不合中约血型不合中约20%发病发病 血浆及组织中存在的血浆及组织中存在的A和和B血型物质，部分中和血型物质，部分中和来自母体的抗体。来自母体的抗体。胎儿红细胞胎儿红细胞A或或B抗原位点少，抗抗原位点少，抗原性弱，反应能力差。原性弱，反应能力差。Rh溶血病的病因和发病机制溶血病的病因和发病机制Rh基因基因编码编码Rh抗原的两个基因是抗原的两个基因是RHD和和RHCE;Rh基因系统的等位基因中最重要的是基因系统的等位基因中最重要的是D、E、C、c、e五种，不存在五种，不存在d基因基因;RHD基因编码基因编码D抗原，抗原，RHCE基因的编码产物为基因的编码产物为C/c和和E/e，C和和E一起遗传，排列为一起遗传，排列为DCE；无；无d抗原抗原;d表示表示D阴性表现型阴性表现型;RHD和和RHCE基因编码的单倍型中最常见的有基因编码的单倍型中最常见的有8种形种形式：式：Dce、dce，DCe、dCe、DcE、dcE、DCE和和dCE。Rh溶血病溶血病 红细胞缺乏红细胞缺乏D抗原称为抗原称为Rh阴性，具有阴性，具有D抗原称为抗原称为Rh阳阳性，中国人绝大多数为性，中国人绝大多数为Rh阳性。阳性。母亲母亲Rh阴性阴性(无无D抗原抗原)，若胎儿，若胎儿Rh阳性可发生阳性可发生Rh溶血溶血病。病。母亲母亲Rh阳性阳性(有有D抗原抗原)，但缺乏，但缺乏Rh系统其他抗原如系统其他抗原如E等，若胎儿有该抗原也可发生等，若胎儿有该抗原也可发生Rh溶血病。溶血病。RhD溶血病最常见溶血病最常见其抗原性强弱依次为其抗原性强弱依次为DECce。RhD溶血病最常见，其次为溶血病最常见，其次为RhE，Rhe溶血病罕见。溶血病罕见。Rh溶血病一般不发生在第一胎溶血病一般不发生在第一胎由于自然界无由于自然界无Rh血型物质血型物质 首次妊娠末期或胎盘剥离经过2-6月以后再次妊娠孕期几天内Rh阳性胎儿血 0.51ml胎儿已 娩出胎儿Rh血型同上胎少量胎儿血0.050.1ml胎儿红细胞溶血Rh阴性母血产生IgM抗体产生少量IgG抗体母血循环产生大量IgG抗体初发免疫反应初发免疫反应次发免疫反应次发免疫反应第一胎不溶血第一胎不溶血第二胎溶血第二胎溶血胎盘胎盘Rh溶血病发生在第一胎的情况溶血病发生在第一胎的情况Rh阴性母亲既往输过阴性母亲既往输过Rh阳性血。阳性血。Rh阴性母亲既往有流产或人工流产史。阴性母亲既往有流产或人工流产史。极少数可能是由于极少数可能是由于Rh阴性孕妇的母亲为阴性孕妇的母亲为Rh阳性，其阳性，其母怀孕时已使孕妇致敏，故第一胎发病（外祖母学母怀孕时已使孕妇致敏，故第一胎发病（外祖母学说）。说）。RhD血型不合者约血型不合者约5%发病发病母亲对胎儿红细胞母亲对胎儿红细胞Rh抗原的敏感性不同。抗原的敏感性不同。实验室检查实验室检查 血型检查血型检查母子母子ABO和和Rh血型血型溶血检查溶血检查 溶血时红细胞和血红蛋白减少，早期新生儿毛细血管血溶血时红细胞和血红蛋白减少，早期新生儿毛细血管血血红蛋白血红蛋白6%）;血涂片有核红细胞增多（血涂片有核红细胞增多（10/100个白细胞）个白细胞）;血清总胆红素和未结合胆红素明显增加血清总胆红素和未结合胆红素明显增加;致敏红细胞和血型抗体测定致敏红细胞和血型抗体测定抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验：又称Coombs试验，利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。经常用作试验的有两类方法。直接试验：是检查被检红细胞上有无已结合的不 完全抗体（包括IgG类的抗A或抗B）。间接试验：是检查血清中游离的不完全 抗体（包括IgG类的抗A或抗B）。直接直接Coombs试验试验抗人免疫球蛋白自身抗体注意事项注意事项 标本采取后应立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞中丢失。抗球蛋白试剂应按照说明最适稀释度使用，否则可产生前带或后带现象而误认为阴性结果。受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。最好对阴性结果进行核实，即在该试管中再加1滴IgG致敏红细胞如结果为阳性，则表示试管内的抗球蛋白试剂未被消耗，阴性结果可靠。如需了解体内致敏红细胞的Ig类型，则可分别以抗IgM或抗C3单价抗球蛋白试剂进行试验。注意事项注意事项红细胞上吸附抗体太少,直接抗球蛋白试验可成假阴性反应。全凝集或冷凝集血液标本中有很多网织红细胞且抗球蛋白试剂中含有抗转铁蛋白时，均可使红细胞发生凝集。试剂：多特异性抗球蛋白试剂（IgG、C3d）；阳性对照细胞IgG抗D致敏的5%Rh(D)阳性红细胞生理盐水悬液。取3人份O型红细胞等量混匀，经生理盐水洗涤后取压积红细胞，加等量抗D血清，至37水浴致敏1小时，取出后用生理盐水洗涤3次压积红细胞洗涤配成5%红细胞生理盐水悬液；阴性对照细胞（正常人5%红细胞生理盐水悬液。取3人份O型红细胞等量混匀，经生理盐水洗涤后取压积红细胞，配成5%红细胞生理盐水悬液）。间接间接Coombs试验试验抗人免疫球蛋白同种异型抗体注意事项注意事项如血清与相应红细胞在37 水浴中致敏1小时，75%的抗体吸附于红细胞上，如致敏2小时，则抗体吸附达95%；如以低离子盐水溶液代替生理盐水配制5%红细胞悬液，则致敏时间可减少至15-30分钟，但抗Fy抗体需较长的孵育时间。红细胞洗涤应迅速、彻底。要将生理盐水用力冲入管底，使管底红细胞松散分离。要防止手上的蛋白质污染。1滴1:4000稀释的血清可中和抗球蛋白血清1滴，导致假阳性结果。离心速度和时间非常重要，应取能使阳性对照管出现阳性反应的最小离心力和最短离心时间。注意事项注意事项当红细胞上的抗体分子数量在500个以上时在有利于抗球蛋白与不规则抗体的结合，当红细胞上抗体数量较少，可通过反复离心、摇摆，在离心的方法，增加抗原抗体的接触，提高阳性率。如果检测的抗体为补体依赖抗体，则必须加入新鲜AB型血清.试剂：多特异性抗球蛋白试剂（IgG、C3d）；已知抗体血清（用于检测特殊红细胞抗原）：5%已知抗原的红细胞盐水悬液（用于检测血清中不完全抗体）；5%D阳性红细胞盐水悬液（阳性对照用）；不完全抗D血清：AB型血清。抗人球蛋白试验的应用直接法：常用于新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医源性溶血性疾病等的检测。间接法：多用于检测母体Rh（D）抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生。亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。游离试验游离试验检查新生儿血清中游离抗体检查新生儿血清中游离抗体：将新生儿血清与标准A(B)细胞（与新生儿同种 红细胞）做间接抗人球蛋白试验，阳性结果，则表示有抗体存在。新生儿血清中游离抗体检查结果新生儿血清中游离抗体检查结果 意义意义 指示红细胞 意义 AC BC OC+-游离的抗-A-+-游离的抗-B+-游离的抗-A抗-B或-AB+-+-+游离的ABO系统以外的抗体-无游离抗体放散试验放散试验放散试验放散试验 放散试验原理放散试验原理 抗原与抗体的结合是可逆的。在物理和化学的条件抗原与抗体的结合是可逆的。在物理和化学的条件 改变时，抗体又会从抗原抗体复合物上分离下来，将改变时，抗体又会从抗原抗体复合物上分离下来，将 抗体由抗原抗体复合物上分离下来的试验称为放散试抗体由抗原抗体复合物上分离下来的试验称为放散试 验。验。放散液放散液放散液放散液 用放散试验用放散试验 技术将大量附着于红细胞上的技术将大量附着于红细胞上的抗体放散到小量的生理盐水中，这种含有抗体抗体放散到小量的生理盐水中，这种含有抗体的溶液称为放散液的溶液称为放散液 放散液中的抗体具有特异性，可以与相应放散液中的抗体具有特异性，可以与相应抗原结合，从而可以进一步确定抗体的特异性。抗原结合，从而可以进一步确定抗体的特异性。热放散试验 主要应用主要应用ABO ABO 血型系统新生儿溶血病及从血型系统新生儿溶血病及从红细胞上洗脱掉红细胞上洗脱掉IgMIgM及及IgGIgG抗体。此方法制备抗抗体。此方法制备抗体最容易，但抗体回收较差，即如果抗体较弱，体最容易，但抗体回收较差，即如果抗体较弱，放散试验可得到假阴性的结果。放散试验可得到假阴性的结果。其优点是适用于一般化验室，缺点是放散其优点是适用于一般化验室，缺点是放散液中含有较多游离白蛋白。液中含有较多游离白蛋白。热放散试验方法 1.1.将疑有抗体包被的红细胞用生理盐水洗涤将疑有抗体包被的红细胞用生理盐水洗涤3 3-4-4次，最后一次次，最后一次尽量吸取红细胞上层的生理盐水。尽量吸取红细胞上层的生理盐水。2.2.在压积红细胞中加等量生理盐水（也可用在压积红细胞中加等量生理盐水（也可用ABAB血清或血清或6%6%牛血清牛血清白蛋白），置白蛋白），置 56 56水浴箱中水浴箱中1010分钟，期间摇动数次（分钟，期间摇动数次（15-3015-30S S摇动摇动1 1次）。次）。3.3.取出后立即高速离心，取出后立即高速离心，3000 3000 转转/分钟；取上清液（樱红色的分钟；取上清液（樱红色的上清液即为放散液），与已知红细胞试验。按不同试验要求做上清液即为放散液），与已知红细胞试验。按不同试验要求做试验，将放散液作为抗体使用试验，将放散液作为抗体使用。热放散试验注意事项 鉴定放散液应与原抗原抗体反应方法相同，如抗体较弱，可用酶处理鉴定放散液应与原抗原抗体反应方法相同，如抗体较弱，可用酶处理红细胞做试验红细胞做试验 放散液用生理盐水制备不稳定，若要保存放散液，用放散液用生理盐水制备不稳定，若要保存放散液，用ABAB血清进行放散血清进行放散 受检血清与吸收用红细胞比例要高一些，若抗体弱，可以充分与红细受检血清与吸收用红细胞比例要高一些，若抗体弱，可以充分与红细胞结合胞结合 加热放散温度要准确，如温度降低，放散出的抗体又会重新与抗原结加热放散温度要准确，如温度降低，放散出的抗体又会重新与抗原结合合 放散抗体时，应不断摇动，促使抗体从抗原抗体复合物上分离下来放散抗体时，应不断摇动，促使抗体从抗原抗体复合物上分离下来乙醚放散试验 主要应用于温自身抗体（主要应用于温自身抗体（IgGIgG）或同种抗体或同种抗体引起的直抗阳性，以及用于分离引起的直抗阳性，以及用于分离IgGIgG抗体混合物抗体混合物 其最大优点是适用于检查获得性溶血性贫其最大优点是适用于检查获得性溶血性贫血，鉴定血，鉴定RhRh抗体效果最好，不宜用于抗体效果最好，不宜用于 ABO ABO 抗抗体鉴定体鉴定酸放散放散试验的应用 鉴定新生儿溶血病患儿红细胞上的抗体鉴定新生儿溶血病患儿红细胞上的抗体 在溶血性贫血和可疑输血反应中，用来鉴定产生直抗在溶血性贫血和可疑输血反应中，用来鉴定产生直抗阳性的红细胞阳性的红细胞 制备少量的单特异性抗体制备少量的单特异性抗体 从病人红细胞上去除抗体，制备可用于自身吸收或鉴从病人红细胞上去除抗体，制备可用于自身吸收或鉴定血型及交叉配血次测试验中使用的红细胞定血型及交叉配血次测试验中使用的红细胞 新生儿红细胞抗体放散试验结果意义新生儿红细胞抗体放散试验结果意义 指示红细胞指示红细胞 意义意义 AC BC OC +-放散出IgG抗-A -+-放散出IgG抗-B +-放散出IgG抗-AB或同时放散 IgG抗-A或IgG抗-B +-+-+放散出ABO血型以外的抗体 -没有放散出抗体 新生儿血型血清学检查结果分析新生儿血型血清学检查结果分析 游离 释放 结果 直抗 试验 试验 抗筛 判定 意义 +/-+-/+确诊 ABO HDN,抗筛（+）存在ABO以外抗体 +/-+-/+确诊 ABO HDN,抗筛（+）存在ABO以外抗体 +/-+-/+确诊 ABO HDN,抗筛（+）存在ABO以外抗体 +-可疑 可疑ABO HDN -+-可疑 可疑ABO HDN -否定 血清学实验未能证实新生儿溶血三项检测新生儿溶血三项检测试验名称目的方法结果判定意义改良直接抗人球蛋白试验(改良Coombs试验)测定患儿红细胞上结合的血型抗体“最适稀释度”的抗人球蛋白血清与充分洗涤后的受检红细胞盐水悬液混合红细胞凝聚为阳性红细胞已致敏，为确诊实验Rh溶血病阳性率高而ABO溶血病低抗体释放试验测定患儿红细胞上结合的血型抗体加热使患儿致敏红细胞结合的母体血型抗体释放于释放液中，该释放液与同型成人红细胞混合，再加入抗人球蛋白血清红细胞凝聚为阳性检测致敏红细胞的敏感试验，为确诊实验Rh和ABO溶血病一般均为阳性游离抗体试验测定患儿血清中来自母体的血型抗体在患儿血清中加入与其相同血型的成人红细胞，再加入抗人球蛋白血清红细胞凝聚为阳性估计是否继续溶血和换血效果，不是确诊试验治疗治疗产前治疗产前治疗血浆置换血浆置换宫内输血宫内输血酶诱导剂酶诱导剂提前分娩提前分娩新生儿治疗新生儿治疗光疗光疗药物治疗药物治疗换血疗法换血疗法其他治疗其他治疗产前治疗产前治疗血浆置换血浆置换 目的：换出抗体，减少胎儿溶血目的：换出抗体，减少胎儿溶血用于：血用于：血Rh抗体效价明显增高，又不宜提前分娩的孕妇抗体效价明显增高，又不宜提前分娩的孕妇宫内输血宫内输血直接将与孕妇血清不凝集的浓缩红细胞在直接将与孕妇血清不凝集的浓缩红细胞在B超下注入脐血超下注入脐血管或胎儿腹腔内管或胎儿腹腔内目的：纠正贫血目的：纠正贫血用于：胎儿水肿或胎儿用于：胎儿水肿或胎儿Hb80g/L，肺尚未成熟者，肺尚未成熟者产前治疗产前治疗酶诱导剂酶诱导剂孕妇于预产期前孕妇于预产期前12周口服苯巴比妥周口服苯巴比妥目的：诱导胎儿目的：诱导胎儿UDPGT产生增加，减轻新生儿黄疸产生增加，减轻新生儿黄疸提前分娩提前分娩 既往有输血、死胎、流产和分娩史的既往有输血、死胎、流产和分娩史的Rh阴性孕妇阴性孕妇本次妊娠本次妊娠Rh抗体效价逐渐升至抗体效价逐渐升至1:32或或1:64以上以上用分光光度计测定羊水胆红素增高用分光光度计测定羊水胆红素增高羊水羊水L/S2，提示胎肺已成熟，提示胎肺已成熟光疗光疗 降低血清未结合胆红素简单而有效的方法。通过光线照射，能使胆红素的性质改变后经胆汁排泄到肠腔，或从尿内排出。副作用 治标不治本药物治疗药物治疗 白蛋白白蛋白纠正代谢性酸中毒纠正代谢性酸中毒肝酶诱导剂肝酶诱导剂静脉用免疫球蛋白静脉用免疫球蛋白 见新生儿黄疸见新生儿黄疸换血疗法换血疗法 作用作用换出部分血中游离抗体和致敏红细胞，减轻溶血。换出部分血中游离抗体和致敏红细胞，减轻溶血。换出血中大量胆红素，防止发生胆红素脑病。换出血中大量胆红素，防止发生胆红素脑病。纠正贫血，改善携氧，防止心力衰竭。纠正贫血，改善携氧，防止心力衰竭。指征指征产前已明确诊断，出生时脐血总胆红素68mol/L(4mg/dl)，血红蛋白低于120g/L，伴水肿、肝脾大和心力衰竭者。生后12小时内胆红素每小时上升12mol/L（0.7mg/dl）者。总胆红素已达到342mol/L（20mg/dl）者。不论血清胆红素水平高低，已有胆红素脑病早期表现者。大部分大部分Rh溶血病和个别严重溶血病和个别严重ABO溶血病有任一指征者即应换血溶血病有任一指征者即应换血;小早产儿、合并缺氧和酸中毒者或上一胎溶血严重者，应适当放宽指征小早产儿、合并缺氧和酸中毒者或上一胎溶血严重者，应适当放宽指征;换血疗法换血疗法 方法方法血源血源的选择的选择新生儿换血血液的选择Rh溶血病1.Rh系统与母亲同型、ABO系统与患儿同型2.紧急时可选用Rh阳性或O型血 ABO溶血病 母O型、子A或B型1.AB型血浆和O型红细胞的混合血 2.抗A或抗B效价不高的O型血3.患儿同型血 有明显贫血和心力衰竭者，可用血浆减半的浓缩血有明显贫血和心力衰竭者，可用血浆减半的浓缩血 方法方法换血量换血量一般为患儿血量的一般为患儿血量的2倍倍（约（约150180ml/kg）。）。换出换出85%的致敏红细胞和的致敏红细胞和60%的胆红素及抗体。的胆红素及抗体。也有人主张用也有人主张用3倍血。倍血。换出更多致敏红细胞、胆换出更多致敏红细胞、胆红素及抗体。红素及抗体。所需时间较长对患儿循环所需时间较长对患儿循环影响较大。影响较大。方法方法换血途径换血途径脐静脉或其他较大静脉进行换血。脐静脉或其他较大静脉进行换血。动、静脉同步换血。动、静脉同步换血。预防预防 Rh阴性妇女在流产或分娩Rh阳性胎儿后，应尽早注射相应的抗Rh免疫球蛋白，以中和进入母血的Rh抗原。临床目前常用方法是对RhD阴性妇女在流产或分娩RhD阳性胎儿后，72小时内肌注抗D球蛋白300g。Thanks!