发根农杆菌介导的植物基因转化培训 医学ppt课件

发根农杆菌介导的植物基因转化发根农杆菌介导的植物基因转化1.发根农杆菌介导的植物基因转化1.n n发根是发根农杆菌发根是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)感染整体感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，产生的一种形态上与植物气原生质体后，产生的一种形态上与植物气生根类似的根状器官生根类似的根状器官.发根（发根（hairy root）是什么？）是什么？2.发根是发根农杆菌发根（hairy root）是什么？2.3.3.什么是发根农杆菌什么是发根农杆菌?发根农杆菌（发根农杆菌（发根农杆菌（发根农杆菌（A.rhizogenesA.rhizogenes）来自土壤来自土壤来自土壤来自土壤,呈棒呈棒呈棒呈棒(杆杆杆杆)状状状状,细胞质内有一种质粒细胞质内有一种质粒细胞质内有一种质粒细胞质内有一种质粒(plasmid(plasmid）,叫诱根质粒叫诱根质粒叫诱根质粒叫诱根质粒（root inducing plasmidroot inducing plasmid）,简称简称简称简称 Ri Ri 质粒质粒质粒质粒,与发根与发根与发根与发根的诱导有关的诱导有关的诱导有关的诱导有关.发根农杆菌发根农杆菌发根农杆菌发根农杆菌能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物植物植物植物.4.什么是发根农杆菌?发根农杆菌（A.rhizogenes）Ri质粒5.Ri质粒5.Ri Ri 质粒质粒质粒质粒 T TDNADNA区和区和区和区和 VirVir 区的两个功能区区的两个功能区区的两个功能区区的两个功能区.T TDNADNA叫可转移叫可转移叫可转移叫可转移DNADNA区区区区,可插入到寄主植物基因组可插入到寄主植物基因组可插入到寄主植物基因组可插入到寄主植物基因组中，其中携带生根基因和冠瘿碱合成酶的基因中，其中携带生根基因和冠瘿碱合成酶的基因中，其中携带生根基因和冠瘿碱合成酶的基因中，其中携带生根基因和冠瘿碱合成酶的基因.Vir Vir 称致病区称致病区称致病区称致病区,不插入到寄主植物基因组不插入到寄主植物基因组不插入到寄主植物基因组不插入到寄主植物基因组DNADNA中，中，中，中，但与但与但与但与T TDNADNA的转移有关，的转移有关，的转移有关，的转移有关，Vir Vir 区区区区 缺失或突变则不缺失或突变则不缺失或突变则不缺失或突变则不能使感染的植物出现发根能使感染的植物出现发根能使感染的植物出现发根能使感染的植物出现发根 发根农杆菌诱导发状根产生的原因发根农杆菌诱导发状根产生的原因发根农杆菌诱导发状根产生的原因发根农杆菌诱导发状根产生的原因?6.Ri 质粒 TDNA区和 Vir 区的两个功能区.发根LBRBviroriABGCDEopinecatabolismHairy root genesand opine synthaseT-DNARi7.LBRBviroriABGCDEopineHairy roo8.8.1.1.发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导特殊的小分子化合物，诱导特殊的小分子化合物，诱导特殊的小分子化合物，诱导 Ri Ri 质粒的质粒的质粒的质粒的VirVir区基因群区基因群区基因群区基因群活化；活化；活化；活化；2.2.在在在在VirVir区基因表达产生的酶作用下区基因表达产生的酶作用下区基因表达产生的酶作用下区基因表达产生的酶作用下T TDNADNA被切下；被切下；被切下；被切下；3.3.T TDNADNA转移进细胞并整合到植物基因组转移进细胞并整合到植物基因组转移进细胞并整合到植物基因组转移进细胞并整合到植物基因组DNADNA中；中；中；中；4.4.T TDNADNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根在细胞中转译，使宿主植物产生发根在细胞中转译，使宿主植物产生发根在细胞中转译，使宿主植物产生发根 Ri 质粒感染过程质粒感染过程9.发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合发状根的特点发状根的特点n n生长迅速生长迅速生长迅速生长迅速n n激素自养激素自养激素自养激素自养n n分化程度高分化程度高分化程度高分化程度高n n遗传性状稳定遗传性状稳定遗传性状稳定遗传性状稳定10.发状根的特点生长迅速10.发根农杆菌感染植物的方法发根农杆菌感染植物的方法n n向植物体直接注射向植物体直接注射向植物体直接注射向植物体直接注射n n对植物外植体进行接种感染对植物外植体进行接种感染对植物外植体进行接种感染对植物外植体进行接种感染n n与原生质体共培养与原生质体共培养与原生质体共培养与原生质体共培养11.发根农杆菌感染植物的方法11.n n含抗生素的培养基上继代培养除菌含抗生素的培养基上继代培养除菌含抗生素的培养基上继代培养除菌含抗生素的培养基上继代培养除菌n n选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 n n增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长的生长的生长的生长 .n n一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖子发根每月增殖子发根每月增殖子发根每月增殖2500250050005000倍）倍）倍）倍）发根的筛选及增殖培养发根的筛选及增殖培养12.发根的筛选及增殖培养12.发根的鉴定发根的鉴定n n形态学水平形态学水平形态学水平形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝，：激素自养，根丛生，多分枝，：激素自养，根丛生，多分枝，：激素自养，根丛生，多分枝，多根毛，多根毛，多根毛，多根毛，无向地性无向地性无向地性无向地性 n n组织水平：组织水平：组织水平：组织水平：GUS GUS 活性的测定或活性的测定或活性的测定或活性的测定或 NPTII NPTII 酶的检测酶的检测酶的检测酶的检测 n n细胞水平：冠瘿碱的测定细胞水平：冠瘿碱的测定细胞水平：冠瘿碱的测定细胞水平：冠瘿碱的测定 n n分子水平：分子水平：分子水平：分子水平：Southern Blot,PCRSouthern Blot,PCR等方法等方法等方法等方法 13.发根的鉴定形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝，多根毛影响发根农杆菌转化的因素影响发根农杆菌转化的因素 1.1.菌株菌株菌株菌株:常用菌株有常用菌株有常用菌株有常用菌株有 LBA9402LBA9402，ATCC15834ATCC15834，R1601R1601，TR105TR105，A41027A41027，A42659 A42659 等等等等 14.影响发根农杆菌转化的因素 1.菌株:14.目前超过100,000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约4000种新化合物的速度增加.植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等植物是自然界中最好的化工厂植物是自然界中最好的化工厂15.植物是自然界中最好的化工厂15.16.16.植物次生代谢物的获得植物次生代谢物的获得1.1.1.1.直接从野生植株中分离提取直接从野生植株中分离提取直接从野生植株中分离提取直接从野生植株中分离提取2.2.2.2.植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地限制；不占用耕地限制；不占用耕地限制；不占用耕地;缺点：植物细胞生长缓慢；缺点：植物细胞生长缓慢；缺点：植物细胞生长缓慢；缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化3.3.3.3.植物发根培养植物发根培养植物发根培养植物发根培养17.植物次生代谢物的获得直接从野生植株中分离提取17.n n对对对对RiRi质粒的敏感性：双子叶植物质粒的敏感性：双子叶植物质粒的敏感性：双子叶植物质粒的敏感性：双子叶植物 单子叶植物，草本单子叶植物，草本单子叶植物，草本单子叶植物，草本植物植物植物植物 木本植物木本植物木本植物木本植物n n在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植体叶柄、胚轴作为外植体叶柄、胚轴作为外植体叶柄、胚轴作为外植体 n n将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根诱导率的变化诱导率的变化诱导率的变化诱导率的变化 2.2.植物种及外植体的种类植物种及外植体的种类植物种及外植体的种类植物种及外植体的种类18.2.植物种及外植体的种类18.n n水溶性酚水溶性酚水溶性酚水溶性酚 ：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、对羟基苯酚香草酚、对羟基苯酚香草酚、对羟基苯酚香草酚、对羟基苯酚 等，可激活等，可激活等，可激活等，可激活VirVir区基因表达区基因表达区基因表达区基因表达n n光照光照光照光照3.理化因子的影响理化因子的影响19.3.理化因子的影响19.感染前高渗处理、感染前高渗处理、感染前高渗处理、感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等诱导培养时添加生长素等诱导培养时添加生长素等诱导培养时添加生长素等4.其它其它20.4.其它20.影响发根培养及次生代谢物合成的因素影响发根培养及次生代谢物合成的因素1.1.培养基：培养基：培养基：培养基：基本培养基、碳源、氮源、基本培养基、碳源、氮源、基本培养基、碳源、氮源、基本培养基、碳源、氮源、pHpH值等值等值等值等2.2.植物激素：发根能在无激素培养基上较好生长，但植物激素：发根能在无激素培养基上较好生长，但植物激素：发根能在无激素培养基上较好生长，但植物激素：发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响成均有影响成均有影响成均有影响3.3.前体物质前体物质前体物质前体物质4.4.诱导子：诱导子：诱导子：诱导子：可刺激代谢物的产生和分泌可刺激代谢物的产生和分泌可刺激代谢物的产生和分泌可刺激代谢物的产生和分泌21.影响发根培养及次生代谢物合成的因素培养基：基本培养基、碳源5.5.培养方法培养方法培养方法培养方法n n固体培养固体培养固体培养固体培养n n液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养n n两步培养法两步培养法两步培养法两步培养法n n两相培养法两相培养法两相培养法两相培养法n n反复成批培养反复成批培养反复成批培养反复成批培养n n补料成批培养补料成批培养补料成批培养补料成批培养6.6.生物反应器生物反应器生物反应器生物反应器n n发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要n n通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器22.5.培养方法22.23.23.发状根的用途发状根的用途n n遗传育种遗传育种遗传育种遗传育种n n植物有用次生代谢产物工业化生植物有用次生代谢产物工业化生植物有用次生代谢产物工业化生植物有用次生代谢产物工业化生产24.发状根的用途遗传育种24.丹参发根生物反应器大规模培养技术丹参发根生物反应器大规模培养技术 丹参丹参(Salvia miltiorrhiza)是我国传统中药是我国传统中药,具有活血化淤具有活血化淤,通经通经止痛的功能止痛的功能.丹参中含有二类活性成分丹参中含有二类活性成分:脂溶性二萜醌类化合脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物物和水溶性酚酸类化合物.二萜醌类化合物二萜醌类化合物,如丹参酮如丹参酮I,丹参酮丹参酮IIA,隐丹参酮等隐丹参酮等,具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉供血等药理作用脉供血等药理作用,是治疗心血管系统疾病的重要药物是治疗心血管系统疾病的重要药物.酚酸类酚酸类化合物化合物,如丹酚酸如丹酚酸A,丹酚酸丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、紫草酸、迷迭香酸,原儿茶醛原儿茶醛,丹参素等丹参素等,具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症、具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症、改善肾功能等作用。但是由于丹参有效成分在原植物根中含改善肾功能等作用。但是由于丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长量低、生长周期长,加之近年来产地环境污染和为防病虫喷施加之近年来产地环境污染和为防病虫喷施农药等原因农药等原因,便得原料药的供应在数量和质量上都不能满足临便得原料药的供应在数量和质量上都不能满足临床应用的需要。在短时间内大量繁殖有效成分含量高且无污床应用的需要。在短时间内大量繁殖有效成分含量高且无污染的绿色丹参原料药就成为丹参这种重要中药资源开发与利染的绿色丹参原料药就成为丹参这种重要中药资源开发与利用的当务之急用的当务之急.25.丹参发根生物反应器大规模培养技术 丹参(Salvia mil26.26.27.27.