医学分子生物学实验课件

医学分子生物学医学分子生物学实验医学分子生物学实验医学分子生物学实验医学分子生物学实验1实验规范化操作实验规范化操作v微量高速离心机（样品分离）微量高速离心机（样品分离）v移液器（微量取液）移液器（微量取液）实验规范化操作微量高速离心机（样品分离）2高速离心机及高速离心机及使用注意事项使用注意事项高速离心机及使用注意事项3台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机样品的分离样品的分离台式高速冷冻离心机4落地式高速冷冻离心机落地式高速冷冻离心机落地式高速冷冻离心机5微量高速离心机操作微量高速离心机操作v装液（装液（1.5ml 1.5ml 离心管或离心管或0.2ml PCR0.2ml PCR管）管）v标记标记(记号笔记号笔)v平衡（等体积相同管）平衡（等体积相同管）v放置（对称）放置（对称）v离心（时间按钮，转速按钮）离心（时间按钮，转速按钮）注意点：缓慢转动，记录时间注意点：缓慢转动，记录时间 v停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后轻轻轻轻取出离心管）取出离心管）微量高速离心机操作装液（1.5ml 离心管或0.2ml PC6使用注意事项使用注意事项v1.样品需对称放置；样品需对称放置；v2.先调节离心时间，离心开始缓慢提高转速先调节离心时间，离心开始缓慢提高转速至设定值；至设定值；v3.离心结束需等转子完全停止后才能打开离离心结束需等转子完全停止后才能打开离心盖，取出样品。心盖，取出样品。使用注意事项1.样品需对称放置；7移液器规范操作移液器规范操作v工作原理：工作原理：活塞通过活塞通过弹簧弹簧的伸缩运动实现吸液和放液。的伸缩运动实现吸液和放液。v含内置活塞，依靠推动空气进行吸液和放液。含内置活塞，依靠推动空气进行吸液和放液。实验结束时将移液器调至最大量程！实验结束时将移液器调至最大量程！移液器规范操作工作原理：含内置活塞，依靠推动空气进行吸液和放8量程的选择移液器量程的选择移液器量程的选择移液器9移液循环移液循环v吸头安装吸头安装v容量设定容量设定v预洗吸头预洗吸头v吸液吸液v放液放液v卸去吸头卸去吸头移液循环吸头安装101、吸头安装、吸头安装v旋转安装法旋转安装法:把白套筒顶端插入吸头在轻轻用力下压的把白套筒顶端插入吸头在轻轻用力下压的同时，把手中的移液器同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转按逆时针方向旋转180度度。切记用力不能过猛，更不能采取。切记用力不能过猛，更不能采取剁吸头剁吸头的方法来进行安装，因为那样做会对您手中的方法来进行安装，因为那样做会对您手中的移液器造成不必要的损伤。的移液器造成不必要的损伤。1、吸头安装旋转安装法:112、容量设定、容量设定v一是一是粗调粗调，即通过排放按钮将容量值迅速调，即通过排放按钮将容量值迅速调整至接近自己的预想值；整至接近自己的预想值；v二是二是细调细调，当容量值接近自己的预想值以后，当容量值接近自己的预想值以后，应将移液器横置，水平放至自己的眼前，通应将移液器横置，水平放至自己的眼前，通过调节轮慢慢地将容量值调至预想值，从而过调节轮慢慢地将容量值调至预想值，从而避免视觉误差所造成的影响。避免视觉误差所造成的影响。2、容量设定一是粗调，即通过排放按钮将容量值迅速调整至接近自12v 在容量设定时，还有一个需要特别注意的在容量设定时，还有一个需要特别注意的地方。当我们从大值调整到小值时，刚好就地方。当我们从大值调整到小值时，刚好就行；但行；但从小值调整到大值时，就需要调超三从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。一定的空隙，需要弥补。在容量设定时，还有一个需要特别注意的地方。当我们133、预洗吸头、预洗吸头v 在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体该把需要转移的液体吸取、排放两到三次吸取、排放两到三次，这样做，这样做是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现性。其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性。其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在吸头室内形成负压，从而产生漏液的情性气体会在吸头室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们况，这时就需要我们预洗四到六次预洗四到六次，让吸头内的气，让吸头内的气体达到饱和，负压就会自动消失。体达到饱和，负压就会自动消失。3、预洗吸头 在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，144、吸液、吸液v 先将移液器排放按钮按至第一停点，再将先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：P2、P10小于或等于小于或等于1毫米，毫米，P20、P100、P200小于或等于小于或等于2毫米，毫米，P1000小于或等于小于或等于3毫米，毫米，P5ML、P10ML小于或等于小于或等于4毫米毫米,平稳松开按平稳松开按钮，切记不能过快。钮，切记不能过快。4、吸液 先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直15v垂直吸液；垂直吸液；v吸头尖端需浸入液面吸头尖端需浸入液面3mm3mm以下；以下；v缓慢吸液；缓慢吸液；垂直吸液；165、放液、放液v 放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至按至第一停点第一停点，略作停顿以后，再按至，略作停顿以后，再按至第二第二停点停点，这样做可以确保吸头内无残留液体。，这样做可以确保吸头内无残留液体。如果这样操作还有残留液体存在的话，您就如果这样操作还有残留液体存在的话，您就应该考虑更换吸头了。应该考虑更换吸头了。5、放液 放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一17完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；按钮待液体完全打出后再放松按钮待液体完全打出后再放松血清和粘性液体的吸液和放液血清和粘性液体的吸液和放液速度都要保持缓慢速度都要保持缓慢完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；血清和粘性液体的吸液18正向吸液正向吸液2 2个档位个档位 1 1档档 2 2档档正向吸液2个档位 1档 2档196、卸去吸头、卸去吸头v 卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。产生交叉污染。6、卸去吸头 卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生20用大量程的移液器移取小体积的液体用大量程的移液器移取小体积的液体装配吸头时气密性不好，吸头不匹配装配吸头时气密性不好，吸头不匹配吸液速度和放液速度太快吸液速度和放液速度太快 自我检测漏气：自我检测漏气：吸取液体，垂直静置吸取液体，垂直静置5 5秒，秒，观察是否有液滴流出；观察是否有液滴流出；规范操作，损坏赔偿！规范操作，损坏赔偿！移液不准确的常见原因：移液不准确的常见原因：用大量程的移液器移取小体积的液体自我检测漏气：吸取液体，垂直21实验报告要求实验报告要求实验报告要求22实验报告按下列要求书写实验报告按下列要求书写v1.实验题目实验题目当次实验当次实验v2.实验原理实验原理简明扼要，有针对性简明扼要，有针对性v3.操作步骤操作步骤最好是流程或表格形式最好是流程或表格形式v4.注意事项注意事项v5.实验结果实验结果图表、数据或现象图表、数据或现象v6.结果分析结果分析根据实验结果，结合理论分析、体会根据实验结果，结合理论分析、体会v7.思考题思考题实验报告按下列要求书写1.实验题目当次实验23碱裂解法碱裂解法提取重组质粒提取重组质粒DNADNA 医学分子生物学实验医学分子生物学实验碱裂解法提取重组质粒DNA 医学分子生物学实验24v独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗传单位。制和遗传的辅助性遗传单位。质粒质粒 (plasmid)(plasmid)独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗25碱裂解法原理碱裂解法原理v利用质粒利用质粒DNADNA和染色体和染色体DNADNA的变性与复性的差异的变性与复性的差异达到分离目的。达到分离目的。强碱条件下破坏碱基配对，使宿主菌的染色体强碱条件下破坏碱基配对，使宿主菌的染色体DNADNA变变性解链，但闭环质粒性解链，但闭环质粒DNADNA链由于处于拓扑缠绕状态而不链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNADNA链迅速得到链迅速得到准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子。准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子。质粒质粒DNADNA染色体染色体DNADNA碱裂解法原理利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达26碱裂解法碱裂解法：v在碱性条件（在碱性条件（NaOH,NaOH,pH12.0-12.6pH12.0-12.6）下，用）下，用EDTAEDTA和和SDSSDS裂解细胞，裂解细胞，并使细胞的蛋白质与并使细胞的蛋白质与DNADNA发生变性，释放出质粒发生变性，释放出质粒DNADNA。v细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNADNA形成缠连的、不形成缠连的、不溶性的网状、大的复合物，在溶性的网状、大的复合物，在高盐高盐条件下可有效沉淀；条件下可有效沉淀；v当当pHpH调至中性时，质粒调至中性时，质粒DNADNA就可重新恢复天然的超螺旋，保留在就可重新恢复天然的超螺旋，保留在上清液中，经上清液中，经离心离心可与染色体可与染色体DNADNA等分离等分离。苯酚可变性蛋白质；。苯酚可变性蛋白质；氯仿加速有机相和水相分离；异戊醇减少蛋白质变性过程中产生氯仿加速有机相和水相分离；异戊醇减少蛋白质变性过程中产生的气泡。的气泡。v使用预冷使用预冷无水乙醇无水乙醇沉淀上清液中的质粒沉淀上清液中的质粒DNADNA，再用，再用70%70%的乙醇洗涤。的乙醇洗涤。碱裂解法：在碱性条件（NaOH,pH12.0-12.6）下27质粒质粒DNADNA的提取步骤的提取步骤v收集宿主细菌收集宿主细菌v菌体裂解菌体裂解v质粒分离质粒分离v去除杂质去除杂质v浓缩沉淀浓缩沉淀质粒DNA的提取步骤收集宿主细菌28实验步骤：实验步骤：1)1)取已培养好菌液取已培养好菌液1.41.4ml,ml,8000 8000 rpmrpm离心离心1 1min,min,弃尽上清弃尽上清 （倒扣，流尽液体（倒扣，流尽液体）；）；2)2)菌体沉淀菌体沉淀重悬于重悬于100 100 l l预冷的预冷的溶液溶液I I中，振荡使菌体分散中，振荡使菌体分散 （使菌体完全重悬）（使菌体完全重悬）；3)3)加加200 200 l l 溶液溶液IIII，盖紧管盖，温和颠倒混匀数次，室温静止，盖紧管盖，温和颠倒混匀数次，室温静止5 min 5 min（避免（避免DNADNA断裂断裂)；4)4)加加150 150 l l 溶液溶液IIIIII ，温和颠倒混匀数次，冰浴，温和颠倒混匀数次，冰浴 5 min5 min；5)5)10000 10000 rpmrpm离心离心5 5min,min,取取上清（？上清（？l l）至新的离心管中。至新的离心管中。6)6)加加等体积等体积苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇，颠倒混匀，异戊醇，颠倒混匀，12000 12000 rpmrpm离心离心5 5 minmin；7)7)取取上清（？上清（？l l）至新的离心管中，加至新的离心管中，加2.52.5倍体积倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冰浴预冷的无水乙醇，混匀，冰浴10min10min，12000 12000 rpmrpm离心离心5 5 minmin；8)8)弃上清，弃上清，沉淀沉淀加加1ml1ml预冷的预冷的7070乙醇洗涤，乙醇洗涤，10000 10000 rpm/rpm/5 5minmin；9)9)弃尽上清，弃尽上清，沉淀沉淀于温箱干燥后，加于温箱干燥后，加5050l TE l TE 溶液溶解，溶液溶解，5050水浴水浴10min10min后，用于后，用于PCRPCR和和酶切。酶切。（不能残留乙醇）（不能残留乙醇）。实验步骤：取已培养好菌液1.4ml,8000 rpm离心129溶液溶液I，50 mM葡萄糖葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0溶液溶液II，0.2 M NaOH/1%SDS溶液溶液III，3 M 醋酸钠醋酸钠/2 M 醋酸醋酸溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/30思考题思考题v碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA的原理和方法？的原理和方法？v溶液溶液I I，IIII，IIIIII的作用？的作用？v苯酚，氯仿，异戊醇的作用？苯酚，氯仿，异戊醇的作用？v无水乙醇，无水乙醇，7070乙醇的作用？乙醇的作用？vTETE溶液（溶液（pH8.0pH8.0）,RNase A,RNase A的作用？的作用？思考题碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法？31聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCR聚合酶链式反应PCR32实验原理实验原理v PCR技术是利用技术是利用DNA的变性、复性原理的变性、复性原理在体外进行特定的在体外进行特定的DNA序列高效扩增的技术，序列高效扩增的技术，在试管中，在模板在试管中，在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧核苷种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶进行的聚合酶进行的酶促合成反应，由变性酶促合成反应，由变性-退火退火-延伸反复循环完延伸反复循环完成扩增。成扩增。实验原理 PCR技术是利用DNA的变性、复性原理在33操作步骤操作步骤v1.反应体系的配置反应体系的配置v2.反应条件的设置反应条件的设置v3.产物的鉴定和分析产物的鉴定和分析操作步骤1.反应体系的配置34重组质粒重组质粒DNA质粒载体质粒载体 2692bpAmp目的基因目的基因(205bp)重组质粒DNA质粒载体 2692bpAmp目的基因(35PCR反应体系反应体系(20 l)vddH2O 14.0 l v10缓冲液（缓冲液（Buffer）2.0 l vdNTP 2.0 l vprimer 1(P1)0.4 l vprimer 2(P2)0.4 l vTaq 酶酶 0.2 l v重组质粒重组质粒DNA 1.0 l空白对照空白对照：以以H2O替代重组质粒替代重组质粒DNA作为模板作为模板请使用合适量程加样器！请使用合适量程加样器！20 lPCR反应体系(20 l)ddH2O 36PCR反应步骤和条件：反应步骤和条件：v预变性预变性 94 2 minv变性变性 94 20 s 退火退火 55 20 s 延伸延伸 72 20 s 延伸延伸 72 5 min 30 cyclesPCR反应步骤和条件：预变性 94 2 min30 c37思考题思考题vPCR实验中造成假阳性的原因可能有哪些实验中造成假阳性的原因可能有哪些?思考题PCR实验中造成假阳性的原因可能有哪些?38PCR反应产物检测反应产物检测 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR反应产物检测 琼脂糖凝胶电泳39目的要求目的要求v 掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸原理及方法；掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸原理及方法；v 掌握荧光染料使掌握荧光染料使DNA染色原理；染色原理；v 掌握电泳结果观察分析方法掌握电泳结果观察分析方法;目的要求 掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸原理及方法；40琼脂糖琼脂糖v琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由D D-半乳糖和半乳糖和3,63,6-脱水脱水-L L-半乳糖组成的链状多糖分子，可以形成具有半乳糖组成的链状多糖分子，可以形成具有刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的大小。大小。琼脂糖琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由D-半乳糖和3,6-脱水41-+-+42实验原理实验原理v 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最常用的方法，在常用的方法，在pH8.0的缓冲液中，核酸带负电的缓冲液中，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，由于分子筛效应，可荷，在电场中向正极移动，由于分子筛效应，可将将分子大小和构象分子大小和构象不同的核酸分子分离，不同浓不同的核酸分子分离，不同浓度的凝胶可分离不同分子大小的度的凝胶可分离不同分子大小的DNA片段。片段。实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最常4312345612345644医学分子生物学实验课件45琼琼 脂脂 糖糖 凝凝 胶胶 电电 泳泳 系系 统统琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 系 统46紫外投射分析仪：紫外投射分析仪：紫外投射分析仪：47凝凝 胶胶 成成 像像 系系 统统凝 胶 成 像 系 统48琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶电泳操作步骤v样品：样品：PCRPCR产物产物 10 10 l lv加加上样缓冲液上样缓冲液2 2 l l，加荧光染料如，加荧光染料如Sybr Green ISybr Green I (SG)(SG)2 2 l l，混匀，混匀v取取10 10 l l加入加样孔中加入加样孔中 (记录样品次序记录样品次序)v110V110V稳压，电泳约至凝胶稳压，电泳约至凝胶2/32/3处处v紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果(与与DNA MarkerDNA Marker比较比较)v记录并画出示意图记录并画出示意图注意：注意：加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可手腕，以减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。琼脂糖凝胶电泳操作步骤样品：PCR产物 10 l注意：加49上样缓冲液上样缓冲液 (Loading Buffer)(Loading Buffer)上样缓冲液组成：上样缓冲液组成：电泳指示剂与蔗糖电泳指示剂与蔗糖(或甘油或甘油)组成上样缓冲液组成上样缓冲液电泳指示剂：电泳指示剂：溴酚兰溴酚兰 （紫兰色）（紫兰色）二甲苯青二甲苯青 （兰色）（兰色）上样缓冲液作用：上样缓冲液作用：1 1）使样品呈色，便于加样操作）使样品呈色，便于加样操作2 2）增加样品密度和比重，以确保）增加样品密度和比重，以确保DNADNA样品均匀沉入加样孔内样品均匀沉入加样孔内3 3）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断DNADNA电泳的速度电泳的速度和位置和位置上样缓冲液(Loading Buffer)上样缓冲液组成：50荧光染料荧光染料 (如如SYBR Green I)SYBR Green I)SYBR SYBR Green IGreen I 荧荧光光染染料料SYBR SYBR Green Green I I嵌嵌入入DNADNA的的碱碱基基平平面面后后，本本身身无无荧荧光光的的DNADNA在在紫紫外外光光激激发发下下发出荧光，且荧光强度与发出荧光，且荧光强度与DNADNA含量呈正比。含量呈正比。荧光染料(如SYBR Green I)SYBR Green51DNA DNA 分子标准物分子标准物 (DNA Marker)(DNA Marker)DL2000DL20001 kb DNA Ladder 1 kb DNA Ladder 100 bp DNA Ladder100 bp DNA LadderDNA 分子标准物(DNA Marker)DL20001 52琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳优点优点：v 操作简便操作简便v 电泳速度快电泳速度快v 透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收v 琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的DNADNA条带清晰、分辨率高、重复性好条带清晰、分辨率高、重复性好琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳应用应用：核酸分离鉴定核酸分离鉴定 (质粒质粒DNADNA分析分析)v 核酸产物分析核酸产物分析 (PCR(PCR产物分析；产物分析；DNADNA酶切图谱分析酶切图谱分析)v 核酸纯化回收核酸纯化回收 (基因克隆基因克隆)琼脂糖凝胶电泳优点：53影响影响DNADNA电泳迁移率的主要因素：电泳迁移率的主要因素：q DNADNA的分子大小：的分子大小：线性双链线性双链DNADNA分子通过凝胶的速率与其分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。分子量的常用对数成反比。q DNADNA的分子构象：的分子构象：相同分子量的闭环相同分子量的闭环 (型型)，开环，开环 (型型)和线状和线状(型型)的质粒的质粒DNADNA，在琼脂糖凝胶中电泳速率不，在琼脂糖凝胶中电泳速率不同。迁移率同。迁移率型型型型型。型。q 琼脂糖凝胶的浓度：琼脂糖凝胶的浓度：一定大小的一定大小的DNADNA片段在不同浓度的琼片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同。在一定浓度的琼脂糖凝胶中，脂糖凝胶中的迁移率不同。在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的不同大小的DNADNA片段的迁移率也不同。片段的迁移率也不同。q电场强度和电场强度和离子强度离子强度影响DNA电泳迁移率的主要因素：DNA的分子大小：线性双链54线性双链线性双链DNADNA分子迁移率与其相对分子量成反比分子迁移率与其相对分子量成反比 M 1 2 1 2 1 M 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 1 2 1 2 100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 1000 bp 1000 bp 电电泳泳方方向向正正极极负负极极线性双链DNA分子迁移率与其相对分子量成反比 M 55相同分子量不同构型的相同分子量不同构型的DNADNA分子迁移率不同分子迁移率不同三种构型的质粒电泳模式图谱三种构型的质粒电泳模式图谱超螺旋超螺旋 线性线性 开环开环加样孔加样孔开环开环线性线性超螺旋超螺旋相同分子量不同构型的DNA分子迁移率不同三种构型的质粒电泳模56琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度(%)线性线性DNA分子的有效分离范分子的有效分离范围围(kb)0.61.0-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3琼脂糖凝胶浓度和琼脂糖凝胶浓度和DNADNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围琼脂糖凝胶浓度(%)线性DNA分子的有效分离范围(kb)0.57DNA Marker(DL2000)M -PCRDNA Marker(DL2000)M -PCR58PCR产物电泳图产物电泳图300bp引物二聚体引物二聚体目的片段目的片段1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1.DNA marker2-13.PCR扩增产物扩增产物14.空白对照空白对照PCR产物电泳图300bp引物二聚体目的片段1 2 59图图1图图2请评价和分析图请评价和分析图1、图、图2 PCR实验结果！实验结果！图1图2请评价和分析图1、图2 PCR实验结果！60思考题：思考题：v1.1.琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定DNADNA的基本原理？的基本原理？v2.2.影响影响DNADNA电泳迁移率的因素有哪些？电泳迁移率的因素有哪些？v3.3.上样缓冲液的成分和作用？上样缓冲液的成分和作用？思考题：1.琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的基本原理？61重组质粒的限制酶酶切重组质粒的限制酶酶切重组质粒的限制酶酶切62限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease,RE）简简称称限限制制酶酶，是是一一类类能能识识别别和和切切割割双双链链DNADNA分分子子内内特特定定碱碱基基顺顺序序的的核核酸酸内内切切酶酶，为为原原核核生生物物所所特有。特有。型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。限制性核酸内切酶（restriction endonuc63实验原理实验原理v II型限制酶专一行性的识别型限制酶专一行性的识别4-6个具有回文个具有回文结构的碱基序列，并在识别序列特定位置上结构的碱基序列，并在识别序列特定位置上切割切割DNA双链。双链。v 酶切的效率受温度、酶切的效率受温度、pH、盐浓度等影响。、盐浓度等影响。酶切产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。酶切产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。实验原理 II型限制酶专一行性的识别4-6个具有回64重组质粒重组质粒DNA 目的基因目的基因 GAPDH (205bp)质粒载体质粒载体2692bp重组重组质粒载体质粒载体2897bpCAGCTGGTCGACPvu II酶切产物：酶切产物：535bp,2362bp(Pvu II)(Pvu II)Pvu II重组质粒DNA 目的基因质粒载体2692bpCAGCTGP65操作步骤操作步骤v1.在酶切反应管内依次加入下列试剂：在酶切反应管内依次加入下列试剂：v ddH2O 4.0uLv 10Buffer 1.0uLv 质粒质粒DNA 4.0uLv 限制酶限制酶 1.0uLv2.混匀，混匀，37 水浴水浴40minv3.琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果（以未经酶切的质琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果（以未经酶切的质粒做对照，并加入标准分子量粒做对照，并加入标准分子量DNA Marker)）操作步骤1.在酶切反应管内依次加入下列试剂：66注意事项注意事项v1.保证吸样准确；保证吸样准确；v2.注意酶切时加样的顺序，一般为水，缓冲液、注意酶切时加样的顺序，一般为水，缓冲液、DNA各项试剂，最后加限制酶；各项试剂，最后加限制酶；v3.取液时枪头要从溶液表面吸取，防止枪头沾上过取液时枪头要从溶液表面吸取，防止枪头沾上过多的液体；多的液体；v4.每次取酶时更换无菌枪头，以免酶被污染每次取酶时更换无菌枪头，以免酶被污染.注意事项1.保证吸样准确；67限制性内切酶反应影响因素限制性内切酶反应影响因素 vDNADNA的纯度和结构的纯度和结构 v反应缓冲液的反应缓冲液的pHpH值及离子浓度值及离子浓度 v酶解温度和时间酶解温度和时间 v限制酶质量限制酶质量限制性内切酶反应影响因素 DNA的纯度和结构 68实验结果记录实验结果记录1 2 3 4 1-DL150001-DL150002-2-质粒质粒DNADNA酶切前酶切前3-3-质粒质粒DNADNA酶切后酶切后4-DL20004-DL2000实验结果记录1 2 69实验结果实验结果M 切后切后 切前切前实验结果M 切后 切前70请解释和评价重组质粒请解释和评价重组质粒puvII酶切结果酶切结果请解释和评价重组质粒puvII酶切结果71思考题思考题v什么是限制酶？什么是限制酶？v影响限制酶酶切效率的因素有哪些？影响限制酶酶切效率的因素有哪些？思考题什么是限制酶？72谢谢！谢谢！73