DNA甲基化和临床应用培训ppt课件

本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。目录目录甲基化的作用甲基化的作用2临床相关床相关应用用4引言及概念引言及概念3 1甲基化甲基化检测相关技相关技术3 3目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关1本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。为什么为什么熊猫熊猫熊猫熊猫是是黑白黑白黑白黑白的？的？基因决定命运基因决定命运基因决定命运基因决定命运为什么熊猫是黑白的？基因决定命运2本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。同卵双生的同卵双生的孪生子具有完全相同的基生子具有完全相同的基因因组。但他。但他们长大成人后在性格、健康方大成人后在性格、健康方面往往存在很大差异。面往往存在很大差异。同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但3本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。先从表观遗传学谈起相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型?基因环境表型表观遗传学先从表观遗传学谈起相同的基因型 不同的表型?基因环境4本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。现代表观遗传学概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可可遗传的表型。表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）：DNA甲甲基基化化-表表表表观观遗遗传传学学学学的的的的核核核核心心心心（最最最最初初初初始始始始的的的的调调控控控控方式）方式）方式）方式）组蛋白修饰MicroRNAGenomic imprinting现代表观遗传学概念：5本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。不同不同层次表达次表达调控控不同层次表达调控6本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基转移酶：DNMT胞嘧啶：Cytosine5-甲基胞嘧啶：5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸：SAM S-腺苷-高半胱氨酸：SAH DNA甲甲基基化化是指在DNA甲甲基基化化转移移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞胞嘧啶5碳位以共价键结合一个甲基甲基基团。DNA甲基化的概念DNA甲基转移酶：DNMT DNA甲基化是指7本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基转移酶(DNMT)哺乳动物体内有三种DNA甲基化转移酶：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。nDNMT1-持续性DNA甲基转移酶；与甲基化相关，缺乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形。nDNMT3A、DNMT3B-从头甲基转移酶；与去甲基化相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达。DNA甲基转移酶(DNMT)哺乳动物体内有三种DNA甲基化转8本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。通常启动子和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区。结构基因构基因组中中70%90%的独立的独立CpG 都被甲基化都被甲基化,未甲基未甲基化的化的CpG 成簇地聚集形成成簇地聚集形成CpG 岛约有有60以上基因的启以上基因的启动子含有子含有CpG岛。是是结构基因启构基因启动子的核心序列和子的核心序列和转录起始点。起始点。CpG岛（岛（CpG island）预测软件件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/通常启动子和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值59本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。目录目录甲基化的作用甲基化的作用2临床相关床相关应用用4引言及概念引言及概念3 1甲基化甲基化检测相关技相关技术3 3目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关10本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基化的生物学作用甲基化的生物学作用u在发育和分化中调控基因的表达转录抑制特征性表型基因的表达（肤色、毛发）X染色体的失活（X-inactivation）基因印记碱基突变肿瘤代谢DNA甲基化的生物学作用在发育和分化中调控基因的表达11本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基化作为一种可遗传的表观遗传修饰，在体细胞增殖过程中通过依赖于DNA复制的DNA甲基转移酶Dnmt1稳定地传递给子细胞。但在胚胎发育的不同时期，基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发育阶段，甲基化模式在配子形成时已经建立。DNA甲基化与胚胎甲基化与胚胎发育育 DNA甲基化作为一种可遗传的表观遗传修饰，12本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基化在甲基化在动物胚胎和生殖物胚胎和生殖细胞胞发育育过程中的重程中的重编程程DNA甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中的重编程13本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 基因表达的调控开关基因表达的调控开关转录抑制转录抑制CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基14本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。影响基因表达影响基因表达 直接抑制基因表达或甲基化的 CpG双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族 识别，而后者可通过吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰蛋白质来改变染色质的活性，以间接方式影响基因表达。影响基因表达 直接抑制基因表达或甲基化的 Cp15本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。IAP:intracisternal A particle去甲基化：灰鼠基因（agouti）仅微量表达甲基化：基因超量表达特征性表型基因的表达特征性表型基因的表达 IAP:intracisternal A part16本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。X染色体的失活染色体的失活X染色体的失活（X-inactivation）：生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。研究发现失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。避免因拥有两条X染色体而产生双倍 基因产物，保持和雄性动物X染色体 数量及功能上的一致性。X染色体的失活X染色体的失活（X-inactivation 17本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。基因组印记？组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达的现象，相应的基因则称为印记基因。父系不表达称父系印记母系不表达称母系印记基因印基因印记基因组印记？组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性，即只有一18本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。差异甲基化区域差异甲基化区域 差异甲基化区域(differentially methylated region，DMR)，是指染色体上甲基化状态具有亲本特异性的区域，即来源于不同亲本的DNA序列甲基化状态不同的区域 差异甲基化主要发生在基因的启动子区，少数在外显子，现已发现的印记基因大多数具有DMR或受DMR调控。差异甲基化区域 差异甲基化区域(differentially19本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。碱基碱基C T突变突变碱基突变碱基突变 甲基化 突变碱基C T突变碱基突变 20本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。肿瘤细胞发生时常出现DNA甲基化模式的变化，主要包括甲基化转移酶表达水平的提高、基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组不稳定，如染色质构象异常、转座子激活、原癌基因激活表达以及抑癌基因被抑制表达等。DNA甲基化与肿瘤甲基化与肿瘤 肿瘤细胞发生时常出现DNA甲基化模式的变化，21本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。目录甲基化的作用甲基化的作用2临床相关床相关应用用4引言及概念引言及概念3 1甲基化甲基化检测相关技相关技术3 3目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关22本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。A基因组甲基化水平基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析的分析1.1.高效液相色谱高效液相色谱2.2.高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法B候选基因候选基因(Candidate Gene)甲基化分析甲基化分析 1.1.甲基化敏感性限制性内切酶甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法法2.2.重亚硫酸盐测序法重亚硫酸盐测序法3.3.甲基化特异性的甲基化特异性的PCR4.4.甲基化荧光法甲基化荧光法(MethyLight)5.5.焦磷酸测序焦磷酸测序6.结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法甲基化甲基化检测相关技相关技术A基因组甲基化水平(Methylation Content23本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。C.基因组范围的基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析甲基化模式与甲基化谱分析 1.1.限制性标记基因组扫描限制性标记基因组扫描 2.2.甲基化间区位点扩增甲基化间区位点扩增 3.3.甲基化甲基化CpG岛扩增岛扩增 4.4.差异甲基化杂交差异甲基化杂交 5.5.由连接子介导由连接子介导PCR出的出的HpaII小片断富集分析小片断富集分析 6.6.甲基化甲基化DNA免疫沉淀法免疫沉淀法 C.基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析 24本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法25本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。直接测序法直接测序法直接测序法26本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。焦磷酸焦磷酸测序法序法 通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。焦磷酸测序法 通过检测CpG对应位点上C27本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。全基因全基因组甲基化甲基化图谱全基因全基因组甲基化甲基化测序（序（WGBS）全基因组甲基化图谱全基因组甲基化测序（WGBS）28本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。芯片平台芯片平台 Illumina 850K芯片可检测人全基因组约853,307个CpG位点的甲基化状态。850K芯片不但保持了对CpG岛，基因启动子区的全面覆盖，还特别加强了增强子区以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组DNA甲基化芯片。Illumina 850K芯片技术流程芯片平台 Illumina 850K芯片可检测29本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基化和临床应用培训ppt课件30本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。目录目录甲基化的作用甲基化的作用2临床相关床相关应用用4引言及概念引言及概念3 1甲基化甲基化检测相关技相关技术3 3目录甲基化的作用2临床相关应用4引言及概念31甲基化检测相关31本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。正常生物正常生物DNA甲基化甲基化DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组DNA经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种DNA甲基化模式就相对稳定下来。正常生物DNA甲基化DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞32本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。肿瘤组织的肿瘤组织的DNA甲基化甲基化肿瘤中普遍存在瘤中普遍存在DNA甲基化状甲基化状态的改的改变，其特点是，其特点是总体的体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。肿瘤瘤细胞的特征：胞的特征：n癌基因癌基因 低甲基化低甲基化 被激活被激活n抑癌基因抑癌基因 高甲基化高甲基化 被沉默被沉默肿瘤组织的DNA甲基化肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，33本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA甲基化和临床应用培训ppt课件34本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。应用前景应用前景1-肿瘤的早期诊断肿瘤的早期诊断抑癌基因抑癌基因发生异常甲基化是在生异常甲基化是在肿瘤早期就瘤早期就发生而且一直生而且一直进行的，行的，导致致恶性性肿瘤表型的瘤表型的表达表达l优点：点：DNA甲基化甲基化检测具有早期、无具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮皮标本）本）l缺点：特异性不足缺点：特异性不足应用前景1-肿瘤的早期诊断抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早35本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。表表观遗传学生物学生物标记开开发 2017年3月，张鹍教授团队在Nature Genetics（NG）杂志发布了令人振奋的研究成果，利用更灵敏的算法配合组织甲基化模式开发的无创诊断技术，可以检测并定位肿瘤。通过比较肿瘤和正常细胞的DNA甲基化数据找到肿瘤特异的甲基化Marker。表观遗传学生物标记开发 2017年3月，张鹍36本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统(MERMAID)，运用多层级甲基化探针设计策略，可实现在检测成本可控的情况下同时检测超超过10万个万个临床床诊断相关的甲基化断相关的甲基化CpG位点位点，并通过机器学习算法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。cfDNA无无创甲基化甲基化检测系系统(MERMAID)用于用于肺部占位病肺部占位病变（含肺癌）的早（含肺癌）的早筛可可实现99.6%的敏感的敏感性和性和100%的特异性，用于肺部的特异性，用于肺部结节良良恶性判定可性判定可实84.8%的敏感性和的敏感性和87.5%的特异性。的特异性。cfDNA甲基化液体活甲基化液体活检技技术 燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统(ME37本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。应用前景应用前景2-肿瘤复发的独立预测因子肿瘤复发的独立预测因子口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患者复发率明显增高甲基化影响生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因发生异常甲基化时，患者存活时间明显缩短LONG N K,et al.Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in oral squamous cell carcinomas J.Oral Oncol,2008,44(11):1 052-1 058.ELL INGER J,et al.Hypermethylation of Cell-Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder Cancer.J Urol,2008,179(1):346-352.应用前景2-肿瘤复发的独立预测因子口腔鳞状细胞癌时存在RE38本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。应用前景应用前景3-肿瘤的去甲基化治疗肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用，DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化）抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望应用前景3-肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于DN39本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。优点：新型抗点：新型抗肿瘤瘤药物物缺点：缺点：n无基因特异性无基因特异性,不能不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会性地活化沉默的目的基因，从而会引起整体的低甲基化引起整体的低甲基化;n药物的活化作用可逆，物的活化作用可逆，疗效依效依赖于于药物的持物的持续存在存在;n大大剂量量应用用时会会对正常正常细胞有毒副作用胞有毒副作用 是否会是否会诱发第二第二肿瘤？瘤？应用前景应用前景3-肿瘤的去甲基化治疗肿瘤的去甲基化治疗优点：新型抗肿瘤药物 是否会诱发第二肿瘤？应用前景3-肿40本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。Figure：KaplanMeier Estimates of Overall Survival,According toMGMTPromoter Methylation Status.应用前景用前景4-肿瘤的甲基化治瘤的甲基化治疗 MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预41本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。Thank You!Thank You!42