免疫组化

免疫组织（细胞）化学王颖颖2013.07.16内容n免疫组化免疫组化n免疫荧光免疫荧光n显微镜的使用显微镜的使用免疫组织（细胞）化学免疫组织（细胞）化学用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）技术。概念IHCICC原理n根据抗原抗体反应和化学显色原理n最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量 酶或荧光基团酶或荧光基团分类按标记物质的种类按标记物质的种类免疫荧光法：荧光染料放射免疫法：放射性同位素免疫酶标法：HRP（辣根过氧化物酶）免疫金银法：胶体金按结合方式按结合方式抗原抗原-抗体结合抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接亲和连接，如亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法；聚合物链接聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。内容n免疫组化免疫组化*n免疫荧光n显微镜的使用实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理n石石蜡蜡切切片片：组织切片在60恒温箱中烘烤6-8h，浸二甲苯前应在60烤0.5-1h。v脱蜡：组织切片置于二甲苯中浸泡15分钟,更换二甲苯后再浸泡15分钟v水化：分别过无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，自来水，双蒸水n冰冰冻冻切切片片：将切片放在37烘烤1h，然后置于组化PBS或蒸馏水中浸泡预处理实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理抗原修复抗原修复抗原修复(Antigen Retrieval，AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化，以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。修复介质修复介质：0.01M pH6.0柠檬酸盐缓冲液(CB)；EDTApH9.0。修复方式修复方式：微波9610min2；直接加温100，15min；水浴锅100，10/20min；高压锅/消毒锅120，3min；真空加热10min；直接烤片法。热处理后应注意自然冷却（至少半小时）；热处理液不要让其煮干；不要任何抗原的检测都使用该方法；同一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。抗原修复实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理去除内源性过氧化物酶尤其在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响。用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别。注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%-5%，时间不宜过长，10-40min。实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清血清封闭（试剂封闭（试剂A）室温室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理血清封闭n驴血清10%nBSA3%ntriton-1000.1%ntween-200.05%nPBS组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物的非免疫血清(1:51:20)封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%5%牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为室温2h，或根据说明书。封闭前封闭前 封闭后封闭后实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理一抗首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号购置抗体的注意事项种属：单克隆抗体，多克隆抗体能否用于石蜡切片稀释度特异性，交叉反应用何种组织前处理形式（如抗原修复形式等）包装单位，价格孵育浓度孵育浓度：首先不同的稀释度摸条件，如150、1100、1200等。选择合适的稀释度完成后续实验。（选择表达较高的组织进行此步实验）孵育时间孵育时间：可先选择短时间如2 h，若结果不理想，则适当延长时间。但确定后不要更改。孵育温度孵育温度：室温为宜（25 左右），如过夜则置于4孵育，加二抗前复温至少0.5 h。37孵育可能会使染色过强，或产生非特异性着色。一抗对照阳性阳性对照照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做。用于排除方法和实验系统有无问题；阴性阴性对照照一般是用PBS替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。用于排除有无一抗外的非特异性染色。实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗孵二抗试剂试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联孵生物素偶联二抗二抗（试剂（试剂B）室温室温2 h孵二抗孵二抗试剂试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理二抗PV即用型即用型SP生物素放大生物素放大PV9000：鼠、兔通用：鼠、兔通用PV9003：羊来源一抗：羊来源一抗SP9000：鼠、兔通用：鼠、兔通用SP9003：羊来源一抗：羊来源一抗实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理DAB显色nDAB试剂盒试剂盒：浓缩液：稀释液=1：20n量取50mLPBS置于有毒区棕色瓶，再称取DAB粉末0.02g溶于PBS，振荡混合，避光过滤到专用玻片缸中，加入200LH2O2摇晃均匀，即可开始显色。根据显微镜下观察的结果终止染色，记录显色时间。n注意：1.粉末DAB显色阳性信号可能会在显色1-2min时才出现，请勿过早终止。2.DAB的有效作用时间为半小时，如果超过15min未产生阳性信号，则可以提高一抗浓度或延长一抗孵育时间。3.同一分子在不同处理组的显色时间要保证一致。4.DAB为一次性试剂，用后自觉将液体倒掉，并将玻片缸放于固定位置。5.DAB粉末放于有毒冰箱-20度，用后放回原处。实验步骤石蜡切片石蜡切片脱蜡、水化脱蜡、水化 冰冻切片冰冻切片 ddH2O或或PBS洗洗抗原修复抗原修复 3%H2O2孵育孵育10 min去除内源性过氧化物酶去除内源性过氧化物酶即即用用型型二二步步法法 ABC放放大大法法 血清封闭（试剂血清封闭（试剂A）室温）室温2 h孵育一抗孵育一抗 孵一抗孵一抗 孵二抗试剂孵二抗试剂137度度20分钟分钟孵生物素偶联二抗孵生物素偶联二抗（试剂（试剂B）室温）室温2 h孵二抗试剂孵二抗试剂237度度30分钟分钟孵孵ABC液（试剂液（试剂C）37度度40分钟分钟DAB显色显色 复染复染 封片封片脱水、透明脱水、透明37度烤片度烤片二甲苯二甲苯梯度酒梯度酒精精梯度酒精梯度酒精二甲苯二甲苯预预处处理理n苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗5分钟n脱水、透明、封片、镜检。脱水：70%酒精3分钟，80%酒精3分钟，95%酒精5分钟，无水乙醇5分钟，拿出晾干。透明：二甲苯各8分钟封片：中性树脂镜检原则原则必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位。如人白细胞共同抗原LCA和上皮膜抗原EMA应定位在细胞膜上；肌酸激酶CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。结果判定尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。n免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。一、阳性阳性标记免疫特征免疫特征：分弱(+)、中(+)、强(+)三级。免疫酶标记（HRP-DAB/H2O2）表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。+二、阳阳性性标记细胞胞学学特特征征（以HRP-DAB/H2O2为例）可分为胞膜型；胞核型；胞质(浆)型；微绒毛型和复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。三、阳阳性性标记组织学学特特征征（以HRP-DAB/H2O2为例）免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：局灶型；弥漫型；片块型；网状型；腺管型；腔缘型和菊团型，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。四、阳阳性性标记强强度度特特征征 依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）1分；中等阳性（+）2分；强阳性（+）3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性（+,指阳性细胞总数在25%49%)；强阳性（+，指阳性细胞总数在50%以上)。此外，还有+，指阳性细胞总数在75%以上)。IS染色结果=染色强度阳性细胞百分比。结果为0-12分，其中0-3分为低表达组，4-12分为高表达组。l只有一种评判标准，具体的可参考文献。平均值：随机选择5个高倍视野，计数10002000个细胞，取其平均值为该病例的细胞表达率，高于均值为高表达，低于为低表达统计软件统计是否差异有统计学意义lSPSS/state注意事项二甲苯在烘箱中加热时必须将鼓风关掉鼓风关掉，防止二甲苯挥发溢出。切片放入二甲苯及换缸时必须在通风橱中进行，然后再拿到烤箱中。夏季二甲苯可不加热。烤箱温度不要超过62度抗原修复后，切片不能直接放到冷水中，要在修复液中冷却到室温。抗原修复后一定不要干片，尤其是涂唇膏或指甲油的过程中，否则易产生非特异性着色。DAB显色后直接将切片放入自来水中，以免弄到湿盒内造成污染。做好个人防护。二甲苯更换时直接倒在通风橱内的空瓶子中，可用卷纸将缸内蜡渍擦净，然后倒入新的二甲苯。脱蜡和透脱蜡和透明的二甲苯不能混用。明的二甲苯不能混用。通风橱两侧的二甲苯及梯度酒精不能混用左侧脱蜡右侧透明封片脱水时从无水乙醇中拿出后必须晾干，才能放入二甲苯中。而在二甲苯中浸泡到时间不要干片，滴加中性树脂盖盖玻片。在通风橱中吹干后再拍摄，否则影响拍摄效果。拍摄时调整好合适的仪器参数。有有毒毒区区域域物物品品勿勿拿拿到到无无毒毒区域。区域。免疫组化问题解答非特异性背景染色非特异性背景染色操作过程中冲洗不充分，每步冲洗3次每次5分钟组织中含过氧化物酶未阻断，可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长组织中含内原性生物素，正常非免疫动物血清再封闭血清蛋白封闭不充分，延长血清蛋白封闭时间标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色DAB孵育时间过长或浓度过高一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看染色弱染色弱抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少于1 h试剂超过有效使用时间，应更换试剂操作中添加试剂时缓冲液未沥干，每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液，防试剂稀释（应防止切片干燥）室温太低，低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60 min或4 度冰箱过夜蛋白封闭过度，封闭时间减少染色过强染色过强抗体浓度过高或孵育时间过长，降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1h或4度过夜孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度染色阴性染色阴性操作步骤错误，应重试，设阳性对照组织中无抗原或含量低，设阳性对照以验证试验结果抗原修复不全，换修复液或延长时间血清封闭时间过长一抗与二抗种属连接错误，仔细确定一抗二抗种属无误内容n免疫组化免疫组化n免疫荧光免疫荧光n显微镜的使用免疫荧光免疫荧光冰冻切片ddH2O或PBS预处理抗原修复抗原修复血清封闭（勿洗）室温2h敷一抗过夜敷荧光二抗4度2h甘油封片：盖玻片37度烤片取出24孔板，弃培养基血清封闭2h敷一抗过夜敷荧光二抗4度2h甘油封片：载玻片4%细胞多聚固定0.5-1h组织荧光组织荧光细胞荧光细胞荧光敷二抗时根据个人需要选择是否标记细胞核，DAPI或Hoechst染色荧光二抗n根据物种：不同来源的一抗，所用的二抗不同。小鼠、兔、山羊、绵羊、大鼠等。n根据颜色：红、绿、紫Cy2/FITC：绿色荧光Cy3：红色荧光AlexaFluor：红色（568）、绿色（488）鬼笔环肽：phalloidin，标记细胞骨架F-actin，不加一抗，本身以二抗标记。荧光双标：两种一抗的来源要不同，二抗选择不同的颜色。n1、非特异性染色产生原因及其解决方案：、非特异性染色产生原因及其解决方案：游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。n2、阴性染色产生的原因有：、阴性染色产生的原因有：一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。血清封闭时间过长。抗体稀释液pH值不合适，影响抗原抗体反应。组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色。荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。内容n免疫组化n免疫荧光n显微镜的使用显微镜的使用显微镜程序的使用n打开汞灯预热（如拍组化则不用打开）n打开显微镜开关n打开电脑程序图标n图像预览n设置参数n采集图片/保存n组化/荧光的切换n荧光不同颜色通道的切换n关闭程序n关闭显微镜开关n关闭汞灯物镜的切换物镜的切换l观察位置的切换观察位置的切换n拉出为电脑上观察拉出为电脑上观察n推进为显微镜内观察推进为显微镜内观察可能遇到的问题n图像预览打不开任务栏中右键点击窗口，最大化或还原即可。n组化颜色不正常，点自动白光平衡，曝光时间不要太大，否则颜色偏红n汞灯不能启动汞灯关闭后一般等半小时以后才能再次打开。否则易出现不能启动的现象，也减少汞灯的寿命。n荧光颜色不正，可用组化片子将颜色调整，再拍荧光。n图像模糊，用擦镜纸蘸无水乙醇擦拭。n图片保存不了，可能是所存盘内存已满，存入其他盘即可。拍摄图片及时拷走，并删除电脑中的，清理回收站。