DNA测序技术

人类基因组计划（人类基因组计划（Human Genome ProjectHGP）于）于1990年正式启动，其主要目标有：年正式启动，其主要目标有：识别人类识别人类DNA中所有基因（超过中所有基因（超过10万个）；测定万个）；测定组成人类组成人类DNA的的30亿碱基对的序列亿碱基对的序列；将这些信息；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。意义和商业上的巨大价值。中国的中国的HGPHGP起步较晚起步较晚,但中国人口众多但中国人口众多,有有56 56 个民族和许多遗传隔离群个民族和许多遗传隔离群,拥有世界上最丰富的拥有世界上最丰富的遗传家系资源遗传家系资源,对于研究对于研究HGPHGP的重要目标之一的重要目标之一人类遗传的多样性正具有得天独厚的优势。人类遗传的多样性正具有得天独厚的优势。拥有一批国家重点实验室及专业齐备的科拥有一批国家重点实验室及专业齐备的科研力量研力量,因此可以根据因此可以根据HGPHGP的目标的目标,结合中国的结合中国的特点开展研究。特点开展研究。19991999年年7 7月，我国在国际人类基因组注册，月，我国在国际人类基因组注册，承担了其中承担了其中1 1的测序任务，此举标志着我国已的测序任务，此举标志着我国已掌握生命科学领域中最前沿的大片段基因组测序掌握生命科学领域中最前沿的大片段基因组测序技术，在结构基因组学中占了一席之地。技术，在结构基因组学中占了一席之地。DNA测序的方法n n链终止法测序链终止法测序n n化学降解法测序化学降解法测序n n自动化测序自动化测序n n非常规非常规DNADNA测序测序链终止法测序链终止法测序(the chain termination method)n nddNTPddNTP与普通与普通dNTPdNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的不同之处在同它们在脱氧核糖的3 3 位置缺少一个位置缺少一个羟基。它们可以在羟基。它们可以在DNADNA聚合酶作用下通过其聚合酶作用下通过其5 5 三磷酸基团掺入到正在三磷酸基团掺入到正在增长的增长的DNADNA链中，但由于没有链中，但由于没有3 3羟基，它们不能同后续的羟基，它们不能同后续的dNTPdNTP形成形成磷酸二酯链，因此，正在增长的磷酸二酯链，因此，正在增长的DNADNA链不可能继续延伸。这样，在链不可能继续延伸。这样，在DNADNA合成反应混合物的合成反应混合物的4 4种普通种普通dNTPdNTP中加入少量的一种中加入少量的一种ddNTPddNTP后，后，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNADNA合成的引物末端到出合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在现过早链终止的位置之间的距离。在4 4组独立的酶反应中分别采用组独立的酶反应中分别采用4 4种种不同的不同的ddNTPddNTP，结果将产生，结果将产生4 4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个的每一个A A、每一个、每一个GG或每一个或每一个T T的位置上。的位置上。生成生成互相独立互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有酸，每组寡核苷酸都有固定的起点固定的起点，但却，但却随机终止随机终止于特定的一种或者多种残基上。于特定的一种或者多种残基上。由于由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原原DNA全片段上的位置所决定。全片段上的位置所决定。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上上的核苷酸顺序。的核苷酸顺序。脱脱氧氧核核甘甘酸酸与与双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸结结构构比比较较少一个少一个OH技术路线与要求技术路线与要求制备单链模板制备单链模板 将将单链单链模板与一小段引物退火模板与一小段引物退火 加入加入DNADNA多聚多聚酶酶 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸分分别别加入少量加入少量4 4种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸 将将4 4种反种反应产应产物分物分别别在在4 4条泳道条泳道电电泳泳 根据根据4 4个碱基在个碱基在4 4条泳道的条泳道的终终止位置止位置读读出基因序列出基因序列 A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNAD PCR产生单链DNAA 高酶活性B 无53外切酶活性C 无35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基5PP 53HOOH 35POH 3P32 55POH 3HODNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制备单链制备单链DNA加放射性引物加放射性引物ddGTPddATP ddTTP ddCTP5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G聚合产物分别在聚合产物分别在4个泳道电泳个泳道电泳从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列SangerSanger法法法法DNADNA测序的试剂测序的试剂测序的试剂测序的试剂n n引物酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为的合成寡核苷酸作为的合成寡核苷酸作为的合成寡核苷酸作为DNADNA合成的引物。在许多情况下，可合成的引物。在许多情况下，可合成的引物。在许多情况下，可合成的引物。在许多情况下，可将靶将靶将靶将靶DNADNA片段克隆于片段克隆于片段克隆于片段克隆于M13M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单噬菌体或噬菌粒载体，以取得单噬菌体或噬菌粒载体，以取得单噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链链链链DNADNA分子作为模板。分子作为模板。分子作为模板。分子作为模板。都可以采用能与位于靶都可以采用能与位于靶都可以采用能与位于靶都可以采用能与位于靶DNADNA侧翼的载体序列侧翼的载体序列侧翼的载体序列侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知相退火的通用引物，而不必取得与未知相退火的通用引物，而不必取得与未知相退火的通用引物，而不必取得与未知DNADNA序列互补的引序列互补的引序列互补的引序列互补的引物。物。物。物。n n模板模板模板模板有两类有两类有两类有两类DNADNA可以用作可以用作可以用作可以用作Sanger Sanger 法测序的模板：纯单链法测序的模板：纯单链法测序的模板：纯单链法测序的模板：纯单链DNADNA和经过热变性和经过热变性和经过热变性和经过热变性或碱变性的双链或碱变性的双链或碱变性的双链或碱变性的双链DNADNA。采用通常从重组采用通常从重组采用通常从重组采用通常从重组M13M13噬菌体颗粒中分离得到的单链噬菌体颗粒中分离得到的单链噬菌体颗粒中分离得到的单链噬菌体颗粒中分离得到的单链DNADNA应中获得应中获得应中获得应中获得数百个核苷酸的序列。如用变性双链数百个核苷酸的序列。如用变性双链数百个核苷酸的序列。如用变性双链数百个核苷酸的序列。如用变性双链DNADNA用模板，则较难获得高质量的结果。用模板，则较难获得高质量的结果。用模板，则较难获得高质量的结果。用模板，则较难获得高质量的结果。尽管采用双链尽管采用双链尽管采用双链尽管采用双链DNADNA模板的方法显然既简单又方便（模板的方法显然既简单又方便（模板的方法显然既简单又方便（模板的方法显然既简单又方便（ChenChen和和和和SeeburgSeeburg，19851985），），），），然而只是在不久前得到改进以后，然而只是在不久前得到改进以后，然而只是在不久前得到改进以后，然而只是在不久前得到改进以后，这一方法才发展到能够获得明确可信结果这一方法才发展到能够获得明确可信结果这一方法才发展到能够获得明确可信结果这一方法才发展到能够获得明确可信结果的水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板的水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板的水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板的水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板DNADNA的质量和所用的质量和所用的质量和所用的质量和所用DNADNA聚合酶的种类。小量制备的质粒聚合酶的种类。小量制备的质粒聚合酶的种类。小量制备的质粒聚合酶的种类。小量制备的质粒DNADNA常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及苷酸及苷酸及苷酸及DNADNA聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。结果，种种结果，种种结果，种种结果，种种“鬼鬼鬼鬼”带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、黯然失色。因此采用小量制备的质粒黯然失色。因此采用小量制备的质粒黯然失色。因此采用小量制备的质粒黯然失色。因此采用小量制备的质粒NDANDA来测定未知来测定未知来测定未知来测定未知DNADNA克隆片段的序列，克隆片段的序列，克隆片段的序列，克隆片段的序列，并不可取。然而并不可取。然而并不可取。然而并不可取。然而,这类这类这类这类DNADNA常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进一常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进一常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进一常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进一步的合适模板。采用步的合适模板。采用步的合适模板。采用步的合适模板。采用CsClCsCl溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒DNADNA，测序，测序，测序，测序的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。n nDNADNA聚合酶聚合酶通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow片段（片段（SangerSanger等，等，19771977），反转录酶（见），反转录酶（见文献，如文献，如MieredorfMieredorf和和PrfefferPrfeffer，19871987）经过修饰消除了）经过修饰消除了3535外节酶活外节酶活性的性的T7T7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶（聚合酶（SequenaseSequenase）和测序酶）和测序酶2.02.0），），TaborTabor和和RichardsonRichardson，19781978惟及从嗜热水生菌（惟及从嗜热水生菌（Thermus aquaticusThermus aquaticus）分离的）分离的耐热耐热DNADNA聚合物（聚合物（Taq DNATaq DNA聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的可大大影响通过链终止反应所获得的DNADNA序列的数量的质量。序列的数量的质量。n n放射性标记的放射性标记的dNTPdNTP直至几年以前，实际上所有直至几年以前，实际上所有DNADNA测序反应都用测序反应都用32PdNTP32PdNTP来来进行。然而进行。然而32P32P发射的强发射的强 粒子造成两个问题。粒子造成两个问题。首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的的DNADNA条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列（尤其是从条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列（尤其是从放射自显影片的上部所读取的序列）的正确性并将制约从单一凝胶上放射自显影片的上部所读取的序列）的正确性并将制约从单一凝胶上能读出的核苷酸序列的长度。其次能读出的核苷酸序列的长度。其次32P32P的衰变会引起样品中的衰变会引起样品中DNADNA的辐的辐射分解，因此用射分解，因此用32P32P进行标记的测序反应只能保存一两天，否则进行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNADNA将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。35SdATP35SdATP的引入（的引入（BigginBiggin等，等，19831983）大大缓解了上）大大缓解了上述两方面的矛盾。由于述两方面的矛盾。由于35S35S衰变产生较弱的衰变产生较弱的 粒子，其散射有所减弱，粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数百核苷酸的中确切测定数百核苷酸的DNADNA序列。此外，序列。此外，35S35S的低能辐射所引起的的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反应可在样品分解比较轻微，因此，测序反应可在2020保存至保存至1 1周，而分辨周，而分辨率不见下降。这样，职果聚丙烯酰胺凝胶方面了发生技术故障，只要率不见下降。这样，职果聚丙烯酰胺凝胶方面了发生技术故障，只要对测序反应进行重分析即可。对测序反应进行重分析即可。n ndNTP类似物化学降解法测序n n基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.技术路线技术路线 将双链将双链DNADNA样品变为单链样品变为单链 每个每个单链单链的同一方向末端都用放射性同位素的同一方向末端都用放射性同位素标记标记,以便以便显显示示DNADNA条条带带 分分别别用不同方法用不同方法处处理理,获获得只差一个核苷酸的降解得只差一个核苷酸的降解DNADNA群体群体 电电泳泳,读读取取DNADNA的核苷酸的核苷酸顺顺序序Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert 法所用的化学技术法所用的化学技术碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶化学法测序实例化学法测序实例哌啶自动化测序自动化测序n n基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.计算机排序5非常规测序非常规测序n n 毛细管电泳毛细管电泳用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省节省时间时间,加快测序进程加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序其他程序同链终止法或化学测序法法.n n 光点测序光点测序脱氧三磷酸核苷酸脱氧三磷酸核苷酸连接到连接到DNA 3DNA 3-末端末端时会时会释放释放1 1个焦磷酸个焦磷酸(PPi)(PPi),焦磷酸焦磷酸在在磷酸化酶磷酸化酶的作用下转的作用下转化为化学能化为化学能,并发出光亮并发出光亮.由此由此,往反应液中每次只加入往反应液中每次只加入1 1种核苷酸种核苷酸,当加入的核苷酸结合时当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点反应液发出亮点,并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时当核苷酸未结合时,反应液中的核反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定由此来测定DNADNA序列序列.n nDNA芯片测序 基本原理基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的待检测的DNADNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装进行对比组装,拼接成完全的拼接成完全的DNADNA顺序顺序.利用基因芯片进行杂交测序的原理序列的组装序列的组装随机测序与序列组装随机测序与序列组装随机测序也称随机测序也称”鸟枪法鸟枪法”.序列组装原理序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点优点:不需预先了解任何基因组的情况不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装ABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装鸟枪法鸟枪法(Shotgun)测序的问题测序的问题 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP错装错装实例实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装序组装超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组DNADNA 琼琼脂糖脂糖电电泳收集泳收集1.61.6 2.0Kb2.0Kb的的区区段、段、纯纯化化 构构建到建到质质粒粒载载体中体中 随随机挑机挑选选1968719687个个克隆克隆,进进行行2864328643次次测测序序,得到可得到可读顺读顺序序为为11 11 631 485 bp631 485 bp 组组装成装成140140个个覆盖全基因覆盖全基因组组范范围围的的独独立的立的顺顺序重序重叠叠群群,各重各重叠叠群群间间仍有仍有间间隙隙 顺顺序序间间隙隙 物理物理间间隙隙 载体或宿主菌载体或宿主菌 选用不当而被丢失选用不当而被丢失的顺序的顺序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库一、科学发展与社会需求之间的关系：一、科学发展与社会需求之间的关系：HGP计划原定于计划原定于2005年完成，而实际上到年完成，而实际上到2003年年就完成了，原因何在？就完成了，原因何在？二、分析化学的新发展：二、分析化学的新发展：分析化学正在向生命科学领域渗透。分析化学正在向生命科学领域渗透。-金钦汉（吉林大学博士生导师）金钦汉（吉林大学博士生导师）三、三、DNA 测序的研究工作测序的研究工作,历经了数十年历经了数十年,成绩辉成绩辉煌煌,曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家更大的创造力！更大的创造力！Shotgun测序测序DNA整体切成切成小段小段小段和载体结合小段和载体结合进行扩增、测序进行扩增、测序片段重叠排序三 未来的测序技术 n n对现有技术的改进主要包括：对现有技术的改进主要包括：n n(1)(1)在自动测序仪内增加每块胶上的脉道数。在自动测序仪内增加每块胶上的脉道数。n n(2)(2)改进软件分析系统，提高对增加泳道和延长改进软件分析系统，提高对增加泳道和延长DNADNA片段初始荧光数据的分析能力。片段初始荧光数据的分析能力。n n(3)(3)采用新型凝胶电泳技术，提高条带的分辨率，采用新型凝胶电泳技术，提高条带的分辨率，扩展单反应数据范围。扩展单反应数据范围。n n(4)(4)改进光学检测系统，开发新型荧光标记改进光学检测系统，开发新型荧光标记 ，提，提高检测的灵敏度，降低对模板数量及质量的要求。高检测的灵敏度，降低对模板数量及质量的要求。n n(5)(5)采用自动加样系统，提高加样质量和速度。采用自动加样系统，提高加样质量和速度。未来的测序技术主要包括：未来的测序技术主要包括：n n质谱法质谱法(mass spectrometrymass spectrometrymass spectrometrymass spectrometry)；n n杂交测序法杂交测序法(seguencing by hybridization,SBHseguencing by hybridization,SBHseguencing by hybridization,SBHseguencing by hybridization,SBH)；n n单分子测序法单分子测序法(single-molecule seguencingsingle-molecule seguencingsingle-molecule seguencingsingle-molecule seguencing)；n n扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(atomic probe microscopyatomic probe microscopyatomic probe microscopyatomic probe microscopy）；n n超薄水平凝胶电泳技术超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Horizontal Ultrathin Gel Horizontal Ultrathin Gel Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGEElectropho resis,HUGEElectropho resis,HUGEElectropho resis,HUGE)；n n毛细管电泳法毛细管电泳法(capillary gel electrophoresis,CEcapillary gel electrophoresis,CEcapillary gel electrophoresis,CEcapillary gel electrophoresis,CE)；n n芯片技术等。芯片技术等。快速、简便的快速、简便的DNA 双循环测序法双循环测序法 邓兵、王宁遂、朱静、张锦邓兵、王宁遂、朱静、张锦中华血液学杂志中华血液学杂志(1994.09)人类基因组研究人类基因组研究人类认识自身的跨世纪工程人类认识自身的跨世纪工程 章彤、陈赛娟、陈竺章彤、陈赛娟、陈竺 自然杂志自然杂志(1995.02)杂交测序杂交测序-DNA测序新技术测序新技术 陈尚武、马涧泉陈尚武、马涧泉 生命的化学生命的化学(1995.02)概述概述DNA测序技术的现状及进展测序技术的现状及进展 邓炜、柴建华邓炜、柴建华 生命的化学生命的化学(1995.06)大规模大规模DNA测序进展测序进展 余才林余才林 国外医学国外医学.遗传学分册遗传学分册 (1996.02)一种简便的双链一种简便的双链DNA测序法测序法 袁汉英袁汉英.、李纹、李育阳、李纹、李育阳 遗传遗传 (1996.06)发展中的发展中的DNA测序技术测序技术 赵晓娟、刘金毅、赵晓娟、刘金毅、蔡有余、蔡有余、琦祖和琦祖和 生物工程进展生物工程进展 (1997.04)“人类基因组计划人类基因组计划”研究进展综述研究进展综述 李晋楠李晋楠 浙江师大学报浙江师大学报(自然科学版自然科学版)(1999.03)发展中的发展中的DNA测序技术测序技术 赵晓娟赵晓娟.刘金毅刘金毅.蔡有余蔡有余.琦祖和琦祖和 生物工程进展生物工程进展(1997.04)未来五年人类基因组研究方向给我们的启发未来五年人类基因组研究方向给我们的启发 刘志红刘志红.黎磊石黎磊石 肾脏病与透析肾移植杂志肾脏病与透析肾移植杂志(1999.02)DNA测序技术新进展测序技术新进展 王强王强.罗伟罗伟.国外医学国外医学.临床生物化学与检验学分册临床生物化学与检验学分册(2000.05)人类基因组计划二期五年目标的焦点人类基因组计划二期五年目标的焦点DNA测序测序 房海燕房海燕.夏家辉夏家辉.国外医学国外医学.遗传学分册遗传学分册(2000.02)DNA测序中的一些常见问题和对策测序中的一些常见问题和对策 贺光贺光.邱广蓉邱广蓉.孙开来孙开来.中国医科大学学报中国医科大学学报(2002.05)377型型DNA测序仪常见问题解析测序仪常见问题解析 黄庆黄庆.张雪张雪.府伟灵府伟灵.医学信息医学信息(2003.07)DNA测序模板的制备和测序引物设计中的相关问题测序模板的制备和测序引物设计中的相关问题 王虎王虎.王晓健王晓健.甄一松甄一松.邹玉宝邹玉宝.郑维越郑维越.张芊张芊.中国分子心脏病学杂志中国分子心脏病学杂志(2004.01)http:/ 1/68 C12Q C12Q 1/68 C12Q C12Q 1/68 C12Q C12Q 1/68 C12Q 1/25 C12N 11/25 C12N 11/25 C12N 11/25 C12N 1范畴分类号：范畴分类号：范畴分类号：范畴分类号：18H18H18H18H优先权项：优先权项：优先权项：优先权项：申请人：上海普洛麦格生物申请人：上海普洛麦格生物申请人：上海普洛麦格生物申请人：上海普洛麦格生物产品有限公司产品有限公司产品有限公司产品有限公司发明人：道格拉斯发明人：道格拉斯发明人：道格拉斯发明人：道格拉斯 斯多斯多斯多斯多兹兹兹兹 利奥柏多利奥柏多利奥柏多利奥柏多 门多萨门多萨门多萨门多萨通讯地址：（）上海市漕宝路号通讯地址：（）上海市漕宝路号通讯地址：（）上海市漕宝路号通讯地址：（）上海市漕宝路号变更事项：视撤日变更事项：视撤日变更事项：视撤日变更事项：视撤日:96.12.11:96.12.11:96.12.11:96.12.11 本发明把生成本发明把生成DNA分子核苷酸碱基顺序的方法与一种分子核苷酸碱基顺序的方法与一种超敏感的银染方法相结合，提供一种新的超敏感的银染方法相结合，提供一种新的DNA序列测定方序列测定方法及试剂法及试剂 盒。这一新的技术组合使电泳分离的序列片段不盒。这一新的技术组合使电泳分离的序列片段不依赖于仪器就直接可见。这种无放射性的系统包括通过用依赖于仪器就直接可见。这种无放射性的系统包括通过用酶促双氧链终止反应形成一系列酶促双氧链终止反应形成一系列DNA序列片段，凝胶电泳序列片段，凝胶电泳分离这些片段，并把凝胶浸入超敏感的银染溶液中分离这些片段，并把凝胶浸入超敏感的银染溶液中,观察引观察引物延伸产物的银染条带物延伸产物的银染条带,从而确定从而确定DNA分子的序列。分子的序列。4.24.2 限制测序限制测序n n 限制测序：是指将一段染色体区段的限制测序：是指将一段染色体区段的DNA DNA 顺顺序进行组装序进行组装.一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法组测序中也采用这一方法.如高等植物如高等植物拟南芥基因组的测序拟南芥基因组的测序完全依据克完全依据克隆重叠群隆重叠群,先进行各个先进行各个BACBAC克隆的随机测序克隆的随机测序,再再进行序列组装；进行序列组装；水稻基因组测序水稻基因组测序计划采取得策略与此相同计划采取得策略与此相同.4.34.3 指导测序与序列组装指导测序与序列组装 建立在基因组图谱基础上的建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法鸟枪法”,即所谓即所谓”指导指导鸟枪法鸟枪法”或或”指导测序指导测序”。在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其基本步骤如下基本步骤如下:A A 构建平均为构建平均为2Kb2Kb的人类基因组质粒文库的人类基因组质粒文库,进行双向测序进行双向测序;B B 构建平均构建平均10Kb10Kb的人类基因组质粒文库的人类基因组质粒文库,进行双向测序进行双向测序,读读取取2 2个端部顺序个端部顺序;C C 参考人类基因组图参考人类基因组图,特别是大量的特别是大量的STSSTS位标作为基点位标作为基点,进行进行序列组装，排成重叠克隆群序列组装，排成重叠克隆群.先将染色体打成比较大的片段先将染色体打成比较大的片段(几十几十-几百几百Kb),利用利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig),分别分别测序后拼装测序后拼装.这种策略叫这种策略叫基于克隆群基于克隆群(contig-based)的策的策略略.ABCABC大片段大片段contig小片段测序拼装小片段测序拼装两种策略的比较两种策略的比较鸟枪法策略鸟枪法策略鸟枪法策略鸟枪法策略 指导测序指导测序指导测序指导测序策略策略策略策略不需背景信息不需背景信息不需背景信息不需背景信息 构建克隆群构建克隆群构建克隆群构建克隆群 (遗传、物理图谱遗传、物理图谱遗传、物理图谱遗传、物理图谱)时间短时间短时间短时间短 需要几年的时间需要几年的时间需要几年的时间需要几年的时间 需要大型计算机需要大型计算机需要大型计算机需要大型计算机得到的是草图得到的是草图得到的是草图得到的是草图(Draft)(Draft)得到精细图谱得到精细图谱得到精细图谱得到精细图谱4.54.5 其他测序路线其他测序路线n n重要区域优先测序重要区域优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序优先测序.如如:人类主要组织相容性复合区位于第人类主要组织相容性复合区位于第6 6号染色号染色体体,与人类免疫系统有关，因而优先测序与人类免疫系统有关，因而优先测序.n nEST(Expressed sequence tag)EST(Expressed sequence tag)测序测序ESTEST是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记,以以ESTEST为探针很容易从为探针很容易从 cDNAcDNA文库中筛选全基因文库中筛选全基因,又可从又可从BACBAC克隆中找到其基因组的基因序列克隆中找到其基因组的基因序列.优点优点:A mRNA A mRNA 可直接反转录成可直接反转录成cDNA,cDNA,而且而且cDNAcDNA文库也比文库也比较容易构建较容易构建;B B 对对cDNAcDNA文库大量测序文库大量测序,即可获得大量即可获得大量ESTEST的序列的序列;C EST C EST为基因的编码区为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;第三节第三节 基因组测序技术基因组测序技术一、测序流程n n构建生物基因组文库或构建生物基因组文库或cDNAcDNA文库文库DNADNA的提取和制备的提取和制备酶切制备克隆用酶切制备克隆用DNADNA片段片段与载体连接与载体连接转化受体细胞转化受体细胞筛选鉴定筛选鉴定扩增培养。扩增培养。2.2.从基因组文库中提取从基因组文库中提取DNADNA大片段，进行测序：大片段，进行测序：将将DNADNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断序的小片断(200-500bp)(200-500bp)小片断和载体结合，植小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用入细菌中进行扩增（或用PCRPCR扩增）扩增）从细菌中从细菌中提取出繁殖好的质粒提取出繁殖好的质粒 酶切，制取测序的酶切，制取测序的DNADNA片片段段3.3.测序：上测序仪测序测序：上测序仪测序。4.4.利用重叠技术，排出利用重叠技术，排出DNADNA大片段的序列。大片段的序列。二、二、测序的基本方法测序的基本方法n n在分子生物学研究中，在分子生物学研究中，DNADNA的序列分析是进一步研的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有要有SangerSanger等（等（19771977）发明的双脱氧链末端终止）发明的双脱氧链末端终止法和法和MaxamMaxam和和 GilbertGilbert（19771977）发明的化学降解法。）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生终止，产生A A，T T，C C，GG四组不同长度的一系列核四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的苷酸，然后在尿素变性的PAGEPAGE胶上电泳进行检测，胶上电泳进行检测，从而获得从而获得DNADNA序列。序列。（一）Maxam-Gilbert的化学降解测序法n n该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。测序步骤：测序步骤：n n先用限制性内切酶把先用限制性内切酶把DNADNA切成切成100100200bp 200bp 的的测序材料；测序材料；n n用碱性磷酸化酶处理该片段，消除用碱性磷酸化酶处理该片段，消除55末端末端上的磷酸；上的磷酸；n n在在5-OH5-OH端标记端标记3232P P，用多核苷酸磷酸激酶催，用多核苷酸磷酸激酶催化；化；n n标记片段变性为单链；标记片段变性为单链；n n化学试剂在特定碱基位置降解单链化学试剂在特定碱基位置降解单链DNADNA，产产生一组长度不等的生一组长度不等的DNADNA片段；片段；n n经电泳和放射性自显影后，从经电泳和放射性自显影后，从4 4个反应系统个反应系统统一阅读，统一阅读，待测待测DNADNA的全部核苷酸序列就可直的全部核苷酸序列就可直接读出。接读出。Maxam-Gilbert测序法的特异断裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecific Reaction to G 化學法無放射線片段不能顯像断裂处断裂处ATCGATCGATn nGG反应：反应：DMSDMS使鸟嘌呤的使鸟嘌呤的7 7位氮原子甲基化，其位氮原子甲基化，其后断开第后断开第8 8位碳原子和第位碳原子和第9 9位氮原子间的化学键，位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。n nG+AG+A反应：反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。n nT+CT+C反应：反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。被哌啶所置换。n nC C反应：反应：在在NaClNaCl存在时，只有存在时，只有C C才能与肼发生反才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC碱性磷酸碱性磷酸单酯酶单酯酶除去除去 5磷酸基磷酸基 多核苷酸多核苷酸磷酸激酶磷酸激酶-32P-ATP分离单链分离单链DNA分别在分别在4个个试管中进行试管中进行特异断裂特异断裂GG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G断裂产物断裂产物分别在分别在4个个泳道电泳泳道电泳从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列改进的特异化学切割反应（二）Sanger的酶聚合测序法(链终止法)n nCambridgeCambridge的的F.SangerF.Sanger在在19771977年发明用双脱年发明用双脱氧链终止法测定单链氧链终止法测定单链DNADNA的序列，其基本原理的序列，其基本原理如下：如下：DNADNA聚合酶能够用单链聚合酶能够用单链DNADNA作为模板，合成作为模板，合成准确的准确的DNADNA互补链；互补链；n n该酶能够用该酶能够用2 2，3 3-双脱氧核苷三磷酸作底物双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的并将其聚合到新生寡核苷酸链的3 3-末端，从而末端，从而终止其延伸反应。终止其延伸反应。n n在在DNADNA测序反应中，加入模板测序反应中，加入模板DNADNA，引物（特，引物（特异性引物），异性引物），DNADNA聚合酶，聚合酶，dAdA，dTdT，dGdG，dCdC和一种和一种ddNTPddNTP。常用。常用KlenowKlenow大片段，无大片段，无5353外切酶活性。外切酶活性。（三）全自动DNA测序n nDNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。n n自动测序仪的设计原理是采用荧光标记DNA片段，并用激光激活的荧光探测系统，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。n n分离产物有两种基本方法：单荧光标记四单荧光标记四泳道分离泳道分离和四荧光标记的单泳道分离四荧光标记的单泳道分离。四荧光标记的单泳道分离的测序原理n n四标记单泳道法：四标记单泳道法：n nABIABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用单泳道法是用4 4种不同的荧光标记物标记种不同的荧光标记物标记4 4个反应个反应的引物，的引物，4 4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。信息。n n这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。影响。荧光标记物荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTP聚合反应及产物聚合反应及产物OH 3P 55PHODNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5PddATPddGTP5PddTTP5PddCTP5P单泳道电泳及信号收集正极正极负极负极