电镜技术及超薄切片技术(研究生)

电镜技术方 周 溪 电镜室现有设备1、H-7500型透射电镜，购于2004年，最大点分辨率为0.24nm,有效放大倍数达60万倍。2、S-3000N型扫描电镜，购于2004年，有效放大倍数达30万倍。3、辅助设备：Tome-Power XL超薄切片机，零界点干燥仪，离子溅射仪等。1924年，法国Broglie提出了“电磁波与光一样，具有波 动性“的假说，并计算出电磁波长为0.005nm.1926年，德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或 磁场中偏转聚焦的现象。19281931年间，德国的Ruska成功研制了世界上第 一台真正的电子显微镜，放大倍数为1200倍。20世纪50年代初到60年代末期，电镜分辨本领得到大 幅度提高，达到1nm左右，到80年代的点分辨率 已接近0.1nm，最新研制的超高压透射电镜（1000KV)的点分辨率可高达0.001nm。电镜基本类型一、透射式电子显微镜二、扫描式电子显微镜三、根据电子枪发射方式不同，可分为热阴极电子枪和场发射电子枪。四、其他（冷冻或低温电子显微镜、高压或超高压电子显微镜、分析电镜、扫描隧道显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子显微镜、原子力显微镜、环境扫描电子显微镜等约几十种不同类型电镜）举例说明：清华大学生命科学学院院长施一公带领的研究团队在科学在线发表了两篇研究长文，揭示了剪接体结构及其工作机理。举例来说，一个苹果，它本身是三维的，我们拿二维照相机多方位、多角度地拍很多张照片，就能重构出苹果的三维模型。（三位重构技术）其实冷冻电镜就相当于一个照相机，当选好的冷冻样品被送到冷冻电镜时，会生成很多图像，这些图像组合起来便可以构建一个三维结构。当数据收集系统收集到大量剪接体的图像后，就可以重构一个剪接体的三维结构。现在科学研究中，科研仪器扮演者越来越重要的角色，这些仪器依托于科学家研发的技术，是科学家眼睛、手和脑的延伸。由于生理结构，人类的一些功能会有局限性，实验必须借助仪器来完成。主要内容1、电镜的基本原理和结构简介(了解）2、电镜的样品制备（透射电镜和扫描电镜）（重点在于取材方面）3、电镜的应用简介（熟悉）光学显微镜与电子显微镜在工作原理上的比较：光学显微镜是利用玻璃制作的透镜对光进行折射，将一物点发出不同角度的光线最终会聚成一个像点。电子显微镜是利用电场或磁场（电磁透镜）折射高速电子束流，达到成像目的。光 源聚光镜样 品物 镜 投影镜最终象 透射电子显微镜 光学显微镜 透射电子显微镜的原理和结构 光的衍射现象：由于光具有波动性，当光线通过小孔或小孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是:中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替的圆环。2D显微镜的分辨本领 显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径 D（分辨能力）大小来决定的即 D=当光的波长为 =500nm=0.5m介质折射率 （油）=1.5物体与物镜所形成夹角的半数 90 央亮斑的半径 D=200nm=0.2m1、人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两点。油镜最小能分辨0.2 m的两点。则油镜理论最大放大能力为：0.2mm /0.2 m=1000（倍）2、假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,则其理论放大倍数为：0.2mm /0.1nm=2x1063、H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm,则其理论放大倍数为：0.2mm /0.24nm=0.83x106。而其有效放大倍数为 0.6x106 光线通过二个比较靠近的小孔时，这二个小孔的衍射图会重叠在一起。当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时，这二个点刚可以分辩。这就是显微镜分辩本领的 瑞利准则瑞利准则。瑞利准则：什么是电磁透镜？由于轴对称弯曲磁场对电子束有聚焦作用，因而可以得到电子光学像。我们称这种具有轴对称弯曲磁场装置构成的电子透镜为电磁透镜（electron magnetic lenses）。由于电磁透镜磁场非均匀分布，物、像点在磁场之外，电子在磁场中既受到轴向分量的作用，又受到径向分量的作用，使平行于轴进入磁场的电子束可获得聚焦。电磁波长的计算 根据公式=(n m)如 V=50000 v 则 =0.005 nm=0.000005m 代入公式 D=则 D=0.000002m电镜的像差和畸变 球差：电子束光源通过透镜受到偏转，通过样品，从物平面向下发射，形成物点孔径角。从物点发出的射线，到达下一级透镜又被聚集。如果透镜有缺陷或孔径角太大，则靠近光轴的射线和远离光轴的射线，受到电磁场的作用就会不同，这些射线在光轴上会聚的位置不同，结果远离光轴的射线就会在像面上形成一个最小模糊圈。此时可有图象中央凸起感。这是目前影响电镜分辨率的一个主要因素。像散：由于透镜的磁场强度在纵向或横向上不同，以致纵向与横向上的射线聚焦于光轴的位置也有上有下，两者共同形成一个最小模糊像。色差：由于电磁波长随加速电压而变化，当加速电压不稳定时，电子束波长就可变异，因而发生类似的像差。畸变：由于离轴较远处的径向磁场的作用力强，使放大倍数随物点离轴的距离而变化，进而使图象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、桶形畸变和S形畸变等，如图所示：反差人的眼睛在区分物体时，主要根据物体不同部位或物体之间的光强度与波长的差别，这些差别构成了物体的反衬度，又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同，疏密度不同，它们散射电子的能力也各不相同，散射电子能力强的地方，显现为暗像；相反，散射能力弱的地方，显现为亮像。因此，在荧光屏上所看到的是由暗像与亮像组成的具有一定反差的荧光图像。1、照明系统：电子枪：可分为热阴极和场发射两种。前者主要有钨丝(W)和六硼化镧(LaB6)；后者又分热场发射和冷场发射，一般采用的是单晶钨，但现在有采用六硼化镧(LaB6)的趋势。聚光镜 2）样品室 3）成象系统：物镜 中间镜 投影镜 4）观察记录系统：观察室 照相机 CCD数字成像系统 5）辅助系统 透射与扫描电镜原理图解扫描电子显微镜工作原理及结构通过极细的电子束扫描射击标本表面而激发出二次电子或产生反射电子，并通过一定途径被接收到阴极射线管而成像。扫描电镜由两个主要部分组成：探查系统和显示系统一、探查系统探查系统：由电子枪、电磁透镜组成。二、显示系统显示系统：电子检测器，闪烁器，光电倍增器以及显示屏组成。电子束的穿透能力一般较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须把样品切成厚度为 101000nm 的薄片。我们把切片厚度小于100nm的薄片称为超薄切片，是电镜观察生物样品常用方法之一，常用厚度为50-100nm。(1)超薄切片技术二、透射电子显微镜样品制备透射电镜样品制备(包埋块制作）操作流程：取材漂洗（生理盐水）前固定（2.5%戊二醛，4C冰箱2小时以上）漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）后固定(1%锇酸1小时左右）漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）块染（1%醋酸铀2小时）梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟，100%2次，各10分钟）浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 C烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4，37C烘箱过夜；纯包埋液45C烘箱2小时）包埋聚合（45C烘箱3小时，65C烘箱48小时）透射电镜样品制作示意图 取材要点及注意事项 快：取材时间在12分钟以内完成；小：体积大小在1立方毫米左右或横切 面为1平方毫米的长条形；冷：固定液温度在4摄氏度左右。准：取材部位要准确，尽量取材于所要 观察的部位。取材方法介绍：1、器官组织 取材法：主要针对活体器官组织的取材如肾、肝、肺等活检组织2、游离细胞收集法：主要针对培养细胞及游离细胞如血细胞、脱落细胞等。常用方法有血浆或血清预包埋法。标本取材方向及大小示意图双刀切割法常见脏器的取材简介、灌注固定 2、注射固定 3、浸泡固定 4、位置选择：要观察生精细胞或支持细胞，取材于睾丸的睾丸网部位，大鼠与小鼠的睾丸网比较表浅，就在白膜下附近。如果要观察成熟精子，最好取材于附睾的尾部，此处精子已基本成熟，而且精子密度最高。睾丸组织取材方法肝组织取材法1、灌注固定法2、浸泡固定法 动物经麻醉后打开腹腔，暴露出肝脏，选取一片肝小叶（如左小叶），先用细线扎紧小叶间连接部位防止出血，接着用手术剪剪下这片小叶组织放在滴有固定液的蜡板上进行修块，切成1立方毫米大小即可。1、脑组织灌注固定（4%多聚甲醛溶液）、取材位置选择：如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞，建议取材于脑组织白质部分，此处有髓神经纤维相对较多，胶质细胞比较丰富；如要研究神经元以及血脑屏障结构，建议取材于脑皮质的灰质部分。、定向包埋，以神经元长轴方向（大约为脑组织的矢状面）作为切面方向，这样可以很好地观察神经元细胞核、轴突以及树突结构的变化，突触以及毛细血管的结构也比较容易见到。、灌注固定 2、浸泡固定：载玻片挤压法：将组织放在载玻片上，并将固定液滴在其上，用另外一片载玻片轻轻压在上面并轻轻挤压。3、位置选择：如果以研究支气管粘膜或研究肺动脉为主的（这里指肺内的支气管），尽量取材于靠近肺门部位。如果主要研究肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构等，建议取材于肺叶靠近胸膜一侧或者肺尖部。肺组织取材法、灌注固定或浸泡固定（主要是肾穿刺活检）、位置选择：根据需要切取皮质或髓质进行观察。动物肾组织取材要注意的是，一要取材位置选择在肾的上极，二要准确判定皮质与髓质的位置，如果是皮质部位，只要将包膜分离后，将肾最外层组织取下来即可，这里一般都会有肾小球存在。一般要求切长条形。肾组织取材法 胃肠道取材法 剖开胃肠道腔，暴露出粘膜面，用PBS或生理盐水浸洗内腔，尽量清洗干净，但注意保护好粘膜面以免损伤，然后剪一段组织进行修块。具体做法如下：沿着胃肠道纵轴和横轴各切几条长约2毫米，宽约1毫米的长条形组织，尽量包括粘膜全层结构，以直接浸泡固定方法为宜，注意保护粘膜层细胞免受人为损伤。各实验组选取部位尽量在相同部位，以利实验比较。骨组织取材方法 取小块骨片（12mm大小），先用2.5%戊二醛固定2小时，磷酸缓冲液漂洗2次，再将骨片浸入脱钙液进行脱钙处理，视脱钙效果而定脱钙时间，如用EDTA脱钙液，大约3天时间，主要视组织块是否变得柔软，通常用细针刺脱钙骨片是否容易刺穿来判断脱钙效果。软骨组织一般直接固定，不需要脱钙处理。皮肤组织取材方法 皮肤组织一般观察表皮细胞及部分固有层结构，取材以长条形为主，长约1.5mm,横径在0.5mm-1.0mm,包括表皮全层细胞及部分固有层（依据上文定向取材图示处理），表皮是复层鳞状上皮层，无血管分布。真皮部分位于表皮深面，主要由胶原纤维和弹性纤维交织构成，并含有从表皮陷入的毛发和腺体，以及从深层来的血管、淋巴管、神经及其末梢，一般不需要定向取材，但要注意位置的准确。外周神经纤维的取材方法 脊椎动物的外周神经系统包括由脑发出的脑神经和由脊髓按节段性排列发出的脊神经。按所联系的器官不同，可分为躯体和内脏两大类，每一类又可按照传导兴奋的方向不同而分为传入神经和传出神经两类。取神经纤维时，应先分离掉包裹神经的神经外衣，再分离出所要研究的神经。如果神经纤维直径在1mm以内，可直接切成1.5mm长条形即可，如果直径较大，则一分为二，同样切成长条形。需要注意的是，在包埋的时候必须定向包埋，纵横方向都要包埋。肌肉的取材方法 每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官，有丰富的血管、淋巴管分布，在躯体神经支配下收缩或舒张，进行随意运动。肌肉具有一定的弹性，当外界刺激较激烈的情况下，肌肉往往出现痉挛现象，因此，切取肌肉组织后应先浸泡在生理盐水或磷酸缓冲液中，等肌肉恢复自然常态后再取材，纵横方向都要取，以长条形为主，大小约1*1*1立方毫米，然后浸入固定液内进行固定，需要注意的是，在取心肌的时候应取在心尖部位，在包埋的时候必须定向包埋。胰腺的取材方法 胰腺可分为胰头、胰体和胰尾三部分。胰腺一般观察胰岛细胞、腺泡细胞以及导管细胞，胰岛主要分布在胰尾部位，胰体部位较少，腺泡及导管基本存在于胰体内，容易观察。组织可以直接浸入固定液内固定。值得注意的是，由于胰腺腺泡内酶原颗粒较丰富，容易引起细胞自溶，取材时要尽量快速取材以免细胞自溶影响结果。肿瘤组织取材方法 肿瘤的生长位置几乎遍布全身，肿瘤组织主要观察肿瘤细胞的组织来源、细胞类型、分化程度以及与周围组织的关系等内容。电镜标本的取材应多位置取材，包括肿瘤的实体内部、生长发生部位、与周围正常组织的交界部位以及癌旁组织。各部位均要取若干个组织块进行固定，这样才能观察的比较全面，尤其怀疑是恶性肿瘤的组织。大小约1mm*1mm*1mm,不能过大。游离细胞取材法血浆凝集法：血浆凝集法：将抗凝全血离心分层（2000转/每分钟，1020分钟），用毛细吸管沿着管壁轻轻的将上清夜吸取（不要破坏白细胞层），接着用吸管吸取固定液，并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入进行固定，然后把它放在4冰箱内保存。血浆（血清）混合法：血浆（血清）混合法：如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成悬液放置于离心管内（最好是玻璃的），离心成团（10003000转/分钟，10分钟，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分钟左右，离心，再弃去多余的固定液，然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀，离心成团，去上清液（留少许），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿着离心管壁缓慢滴入，尽量避免团块分散，静置于4冰箱内保存备用。双重固定法：1、固定目的是尽量保持细胞生活时的形 态结构以及减少细胞的死后变化。2、前固定一般采用2.5%戊二醛溶液固定，后固定采用1%锇酸溶液固定 3、常用固定剂：2.5%戊二醛、1%锇酸、4%多聚甲醛溶液、福尔马林、高锰酸 钾等，有时还用戊二醛-多聚甲醛混合 固定液固定。固定不良，染色淡，结构不清晰固定较好，染色较深1组织块固定：切割小块浸入固定液中的方式。2游离细胞的固定：有离心法和悬浮制备法。3.原位固定法：结扎相应血管，在脏器表面切割“井”字型，然后直接在该表面上滴加固定液进行固定。4.灌注固定法：目前比较广泛采用，效果较好。几种化学固定方式：几种化学固定方式：漂洗 目的是彻底洗净戊二醛固定液的残余，防止其与锇酸起化学反应而降低固定效果。常用漂洗液为0.1M的磷酸缓冲液（PBS）和二甲砷酸钠缓冲液（注意有毒性）。块染 就是对组织块进行1%醋酸双氧铀整块染色。时间为12小时。脱水（酒精或丙酮）梯度脱水：70%丙酮15分钟，80%丙酮15分 钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮0分钟(二次)。关键在于纯丙酮脱水！浸泡与包埋浸泡与包埋 浸泡：使某种适宜的液体介质（包埋剂）渗入组织块 取代脱水剂。包埋：使浸入的介质（环氧树脂包埋剂）经高温处理 后聚合为固体，将组织块包埋其中，利于超薄 切片。常用包埋剂：Epon-812环氧树脂、DDSA、MNA以及 加速剂DMP-30等。特别注意：操作过程中要严防包埋剂吸潮!包埋剂的理想性质理想的包埋剂应具有以下性质：(1)粘度低，容易渗入组织；(2)聚合均匀而充分，聚合前后体积变化小；(3)有良好的切割性能；(4)能耐受电子束轰击，高温下不变形；(5)对细胞成分抽提少，微细结构保存良好；(6)在电镜的高倍放大下，本身不显示任何结构；(7)材料来源丰富、易得，价格低廉，对人体无害。超微病理标本微波快速制备流程：（了解）取材（按常规要求方法）3%戊二醛固定后经微波高火照射20秒,室温继续固定20分钟1%磷酸缓冲液漂洗4次，每次5分钟，微波中火照射20秒1%锇酸微波中火照射10秒，室温继续固定20分钟丙酮50%、70%、80%、90%脱水，微波中火照射20秒，室温继续脱水2分钟。100%丙酮脱水3次，每次微波中火照射20秒，室温3分钟丙酮：包埋剂=1：1浸透，微波中火照射20秒，室温继续浸透5分钟丙酮：包埋剂=1：3浸透，微波中火照射20秒，室温继续浸透5分钟，2次纯包埋剂微波中火照射20秒，室温10分钟常规包埋聚合：70 20分钟，95 30分钟，110 60分钟半薄切片光镜定位超薄切片醋酸铀微波中火照射染色30秒，双蒸馏水漂洗枸橼酸铅微波中火照射染色20秒，双蒸馏水漂洗45烘箱干燥电镜观察。注意：高火：600800W；中火：约400W。超薄切片流程超薄切片流程 1、切片前的准备：铜网清洗（用丙酮和乙醇浸洗）2、支持膜制备：常用Formvar膜（聚乙烯醇缩甲醛）由氯仿配置，浓度为0.5%。3、玻璃刀制备：专用制刀机制作。4、半薄切片光镜定位（需要了解组织细胞结构）。5、超薄切片：专用超薄切片机切片，需要培训。厚度在 50100 nm 之间较为合适。6、染色：柠檬酸铅-醋酸铀双重染色法。如果前面 已经进行块染的，只要铅染即可。电镜观察、拍片、记录等 首先，观察人员要熟悉电镜的基本操作程序以及所要观察材料的相关知识。熟悉CCD数字成像系统的基本操作程序。其次，做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容。最后，做好各种资料的整理、备案工作。取材（取材（做好样品观察面的标志做好样品观察面的标志）漂洗（生理盐水漂洗（生理盐水或缓冲液）或缓冲液）固定（固定（2.5%2.5%戊二醛戊二醛2 2小时以上）小时以上）漂洗漂洗（0.1M0.1M磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，3 3次，次，4545分钟）分钟）后固定（后固定（1%1%锇酸，锇酸，2 2小时）小时）脱水（脱水（50%50%、70%70%、80%80%、90%90%、95%95%各各1515分钟，换醋酸异戊酯分钟，换醋酸异戊酯1515分钟或叔丁醇分钟或叔丁醇1515分钟）分钟）干燥干燥（零界点干燥或冷冻干燥）（零界点干燥或冷冻干燥）镀膜（真空镀膜仪或离子镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）溅射仪）扫描电镜样品制备流程 负染技术 观察颗粒状生物材料的外部形状常用的染色方法。用重金属盐沉积到样品四周，样品四周散射电子的能力就较强，因而表现为暗区；样品本身散射电子的能力较弱，则表现为亮区，这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。常用磷钨酸盐或醋酸铀溶液。电镜酶细胞化学技术 电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术。酶存在的特定位置称为酶的定位。主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶，有100多种。注意：在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。以下以氧化还原酶（可分为氧化酶和脱氢酶两种）为例进行说明。在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物，再经锇酸固定就形成锇黑。脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。酶细胞化学的常规操作流程1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定 液，常用的缓冲液有二甲砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在4060m，也可以 用冰冻切片机切片。3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为37。5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用 0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液 要保持在4左右。6、后固定：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。7、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好，可以进行铅铀双重染色，但必须有不染色的切片对照。免疫电镜胶体金标记技术 免疫电镜胶体金标记技术也称金标法（或免疫金染色）。金标法是利用胶体金（Colloidal gold）在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜下金颗粒密度很高，清晰可辨。胶体金是金的水溶胶，主要用还原法制备。较多用的还原剂有枸橼酸钠、白磷、鞣酸、乙醇、抗坏血酸、过氧化氢等。枸橼酸三钠还原法 1）取0.01%氯化金（HAuCl4或AuCl3HCl溶液）100ml，放入洁净锥形瓶内煮沸。2）取1%枸橼酸三钠水溶液4ml，加入煮沸的氯化金中。3）混合、搅拌、煮沸，约5分钟，溶液颜色由蓝紫橙红，冷却后即可。此时胶体金颗粒直径约为15nm。如将枸橼酸三钠的量分别减少至1.5ml、1.0ml、0.75ml,则胶体金颗粒直径将分别增至30、50或60nm.胶体金标记物（金探针）的制备 1、胶体金标记蛋白质及其纯化 1）取100ml胶体金PH为7.2。2）称取相应最适量蛋白质，于去离子水中溶解（100ul）。3）在磁力搅拌器中将上述两液混合、静置。4）10分钟后再加入胶体金稳定剂，如3%聚乙二醇（PEG）或5%小牛血清白蛋白（BSA）。5）用超速离心法去除未标记蛋白质。离心速度和时间取决于金颗 粒大小及蛋白质的种类。胶体金标记羊抗兔IgG，以牛血清白蛋 白稳定者，先用低速离心20分钟（金颗粒20nm者用250转/分，5 nm者用4000转/分，视金颗粒实际大小情况而定离心速度）。留 取上清液，再以高速离心，4下离心1小时（金颗粒20nm者用 14000转/分，5 nm者用60000转/分，视金颗粒实际大小情况而定 离心速度）。弃上清液，留取沉淀物备用。6）将沉淀物用0.02M PBS(pH8.2,内含1%BSA或PEG)悬浮、清 净，高速离心，重复三次，最后将胶体金标记物溶于原液体积 1/10的TBS中，即可应用。免疫金染色法，可分为包埋前染色和包埋后染色。包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面抗原的标记。因此，现今普遍采用包埋后染色。电镜包埋后胶体金染色法 1）超薄切片80 nm左右置于无支持膜的镍网上。2）至110%H2O2液中处理10分钟1小时不等，越硬需要H2O2 浓度越高越利于抗体进入。3）双蒸馏水洗3次，每次510分钟。4）浮于正常羊血清（1：501：100）液滴上，室温3060分钟，或1：5，5分钟。5）PBS漂洗3分钟，PBS（内含1%牛血清白蛋白）PH8.2中，5分钟。6）加适量稀释的胶体金标记抗体液（1：301：100），淡红色为 适宜稀释液，420小时或室温10分钟2小时。7）双蒸馏水洗3次，每次3分钟。8）如做双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复27步骤。9）5%醋酸铀染色，5分钟，双蒸馏水洗涤，3次。10）枸橼酸铅染色，5分钟，双蒸馏水充分洗涤。11）干燥后电镜观察。结果：阳性抗原部位聚集金颗粒。标本回顾性研究 石蜡块做超薄切片技术1、定位取材：根据光镜显示，切取需要的部位，大小约1mm3 的若干小块。2、溶蜡：先在37烘箱内熔蜡4小时，再二甲苯37烘箱内 浸泡812h，期间要震荡摇换一次。3、水化：用100%（1小时）、90%、80%、70%丙酮进行 水化（各15分钟），直到完全水化。4、漂洗：用缓冲液漂洗（0.1M磷酸缓冲液或二甲砷酸 钠缓冲液)两次，各15分钟。5、固定：用2.5%戊二醛固定2小时以上，其余步骤同常规 电镜样品制作处理。1、生命科学上的应用：几乎包括所有的学科研究领域都已经用到或即将用到电镜技术。比如动物或植物细胞的超微结构（包括细胞核、细胞质及其细胞器等内容物、细胞间的连接等）的形态观察，通过对比观察，对动植物形态在超微结构水平上进行分类、分型，以探讨遗传、变异及病理病因的机理或机制，为生命科学的基础研究所不可或缺的研究手段。利用常规电镜技术和特殊电镜技术如免疫电镜技术、电镜酶细胞化学技术、电镜原位杂交技术等可以进行细胞细胞超微结构及超微病理分析，以及细胞内抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。电镜应用简介2、在临床诊断中的应用：主要应用于临床活检组织的超薄切片观察分析。通过活检组织的细胞形态变化及其相互间的关系，根据其形态变化规律和特点进行分析诊断，为临床病理诊断或辅助诊断提供较可靠的形态依据。在鉴别肿瘤组织来源、分化程度、浸润情况等，以及疾病的病理分型或分期和疾病的早期病理改变等方面，电镜比光镜具有一定的优势。病原微生物（如细菌、病毒、支原体、囊虫等）的形态观察或鉴别也是电镜观察的强项。3、材料上的应用：包括材料的内、外部结构或形貌观察，颗粒形态、大小测量、排列分布等情况。如果应用能谱分析仪器，就可以检测材料的元素组成、含量、分布等情况。4、其他领域上的研究：如矿物质、考古等。如何拍摄电镜照片电镜拍摄既是一门技术，又是一门艺术。先低倍，后高倍；先大体，后局部；先对照，后模型，再疗效。电镜应用及超微结构支原体绒毛内支原体细菌卡氏肺囊虫隐球菌可见荚膜肺内大肠杆菌感染艾滋病病毒艾滋病病毒病毒乙型肝炎病毒核仁细胞核质膜内褶线粒体溶酶体卵细胞示意图透明带卵黄颗粒人类卵细胞局部结构精子鞭毛横断面系统小鼠精子结构线粒体鞘石璜精子结构泥螺精子细胞尾部结构细胞核核固缩突触结构中心体神经元细胞心肌细胞线粒体固缩胃腺癌细胞肝转移肌丝溶解现象RER版层状排列骨骼肌糖原沉积Cap血脑屏障内皮细胞内弹力板脱髓鞘现象细胞质溶解弓形虫感染细胞肝细胞淋巴细胞隐窝细胞病毒颗粒电子致密物细胞水肿细菌菌毛细胞壁肝细胞糖原沉积粗面内质网白血病淋巴细胞胶体金颗粒巨噬细胞吞食现象纳米碳管足细胞及足突结构近曲小管上皮细胞线粒体结构纵切近曲小管上皮细胞微绒毛足细胞足突溶酶体线粒体微绒毛（刷状缘）果蝇果蝇复眼米象金属出芽触角头发晶体粘膜表面化纤细菌培养细胞细菌肿瘤细胞人造纤维人造血管微球电镜技术练习题1、透射电镜标本取材的基本要求并简要说明。2、什么是瑞利准则？电镜与光镜在原理上有何相似和不同之处？3、简述透射电镜及扫描电镜样品制作流程4、常用的化学固定方法有哪些？5、普通透射电镜包括那些结构？请简要叙述。6、简述电镜在生命科学中的应用7、简述电镜的球差和畸变及其形成原因。8、简述电磁透镜及其聚焦原理9、什么是反差？简述电镜荧光图像反差形成的原因。10、游离细胞取材方法有哪些?并简述其处理方法。11、简述超薄切片流程并简要说明。12、简述石蜡块做超薄切片的样品制作流程13、简述负染技术及其应用。选择题选择题人眼的平均分辨率为（）A 0.4mm B 0.2mm C 0.3mm D O.2m E 0.4m电子枪产生的电子是（）A 入射电子 B 透射电子 C 弹性散射电子 D 二次电子 E 俄歇电子用来显示组织和细胞的内部超微结构像的电子为（）A 入射电子 B 透射电子 C 弹性散射电子 D 二次电子 E 反射电子下面哪项不属于透射电镜样品制备技术（）A 镀膜 B 负染技术 C 电镜细胞化学技术D 超薄切片技术 E 半薄切片技术5、下面哪项不属于扫描电镜样品制备技术（）A 表面干燥法 B 浸透包埋 C 冷冻复型D 冷冻割断法 E 组织导电法6、下面哪种电镜既可观察结构又对组织细胞内的元素成分进行分析（）A 透射电镜 B 扫描电镜 C 分析电镜D 超高压透射电镜 E 原子力显微镜7、观察组织细胞内部超微结构应选用哪种电镜（）A 原子力显微镜 B 透射电镜 C 扫描电镜D 磁力显微镜 E 激光扫描共聚焦显微镜8、下面哪项不是超高压电子显微镜的优点（）A 可用于观察厚切片 B 可以提高分辨率 C 可提高图像质量D 可观察复杂的结构 E 减少辐射损伤范围9、下面对扫描电镜的描述错误的是（）A 利用反射电子和二次电子成像 B 用于观察组织细胞内部结构C 样品室大，可用于观察块状样品 D 景深长，立体感强E 样品可被升降和倾斜10、电子枪由（）组成A 阴极、阳极 B 阴极、栅极 C 阳极、栅极D 阴极、阳极、栅极 E 正极、负极、栅极11、二次电子监测系统不包括（）A 检测器 B 阴极射线管 C 闪烁器D 光电倍增器 E 视频放大器12、固定液中戊二醛的常用浓度为（）A 0.5%B 2.0%C 2.5%D 4%E 10%13、下面对透射电镜描述不正确的是（）A 利用透射电子成像 B 观察细胞内部超微结构 C 可观察负染标本 D 景深长、立体感强E 分辨率高，性能最完善14、透射电镜的反差取决于样品对（）的散射能力A 二次电子 B 入射电子 C 透射电子D 散射电子 E 反射电子15、观察生物样品时，透射电镜的加速电压一般为（）A 20-50KV B 50-80KV C 80-100KV D 100-120KV E 120KV以上16、超薄切片是指厚度小于（）的切片A 200nm B 300nm C 400nm D 100nm E 500nm17、超薄切片技术的步骤为（）A 取材、固定、脱水、包埋、切片、染色B 取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色C 取材、脱水、固定、包埋、切片、染色D 取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片E 取材、脱水、固定、包埋、切片18、不属于透射电镜标本取材要求的（）A 动作快 B 组织小 C 切割狠 D 部位准 E 环境冷19、下列试剂中属于强氧化剂以及对粘膜损伤最严重的是（）A 戊二醛 B 环氧树脂 C 锇酸 D 磷酸缓冲液 E MNA20、负染技术中最常用的染色剂是（）A 锇酸 B 甲苯胺蓝 C 磷钨酸 D 柠檬酸铅 E 溴化银谢谢！