吸光光度法--东北师范大学

吸光光度法吸光光度法-东北师范大东北师范大学学东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课比色法、紫外可见吸光光度法、红外光谱法。比色法、紫外可见吸光光度法、红外光谱法。吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。建立起来的分析方法。1 1 灵敏度高，灵敏度高，1 110103 32 2 仪器设备简单、操作方便仪器设备简单、操作方便。3 3 准确度高，相对误差准确度高，相对误差2 25 5。4 4 应用广泛。应用广泛。特点特点东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课第一节第一节 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收一、光的基本性质一、光的基本性质 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光可见光：可见光：400750nm东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课单色光、复合光、光的互补单色光、复合光、光的互补单色光单色光单色光单色光复合光复合光复合光复合光光的互补光的互补光的互补光的互补单一波长的光单一波长的光单一波长的光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。为互补色光，这种现象称为光的互补。为互补色光，这种现象称为光的互补。为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝蓝黄黄紫红紫红绿绿紫紫黄绿黄绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课二、物质对光的选择性吸收二、物质对光的选择性吸收（一）物质对光产生选择性吸收的原因（一）物质对光产生选择性吸收的原因h S2S1S0S3E2E0E1E3h h h 物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足Plank Plank 条件条件条件条件东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。（二）（二）物质的颜色与吸收光的关系物质的颜色与吸收光的关系1 1 物质呈现的颜色是它所吸收光的互补色。物质呈现的颜色是它所吸收光的互补色。2 2 物质对光的吸收程度与它的浓度有关。物质对光的吸收程度与它的浓度有关。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（三）（三）吸收曲线（吸收光谱）吸收曲线（吸收光谱）定性分析基础定性分析基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础定量分析基础定量分析基础物质对光的选择物质对光的选择物质对光的选择物质对光的选择物质对光的选择物质对光的选择吸收吸收吸收吸收吸收吸收ABA 在一定的实验条在一定的实验条在一定的实验条在一定的实验条件下，物质对光件下，物质对光件下，物质对光件下，物质对光的吸收与物质的的吸收与物质的的吸收与物质的的吸收与物质的浓度成正比。浓度成正比。浓度成正比。浓度成正比。C增增大大A 东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课第二节第二节 光吸收的基本定律光吸收的基本定律一一 朗伯比尔定律朗伯比尔定律 (一一)朗伯比尔定律朗伯比尔定律 透射比定义：透射比定义：T 取值为取值为0.0%100.0%全部吸收全部吸收全部吸收全部吸收T=0.0%T=0.0%全部透射全部透射全部透射全部透射T=100.0%T=100.0%东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（1 1）入射光为平行单色光且垂直照射；）入射光为平行单色光且垂直照射；朗伯朗伯-比尔定律的成立的前提比尔定律的成立的前提（2 2）吸收物质为均匀非散射体系；）吸收物质为均匀非散射体系；（3 3）吸光质点之间无相互作用；）吸光质点之间无相互作用；（4 4）辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，）辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。无荧光和光化学现象发生。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课(二二)吸收系数和桑德尔灵敏度吸收系数和桑德尔灵敏度1 1 吸收系数吸收系数东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课最大吸收波长最大吸收波长 max下的摩尔吸收系数下的摩尔吸收系数 max是物质的一个重要特征参数是物质的一个重要特征参数 可用来衡量光度法的灵敏度，可用来衡量光度法的灵敏度，max 越大，越大，测定灵敏度越高，书写时应注明波长测定灵敏度越高，书写时应注明波长东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课2、桑德尔灵敏度、桑德尔灵敏度S 定义为，当光度仪器的检测极限为定义为，当光度仪器的检测极限为A=0.001A=0.001时，单位时，单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量，其单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量，其单位为为gcmgcm-2-2。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课吸光物质的吸光物质的k k越大，其越大，其S S越小，灵敏度越高。越小，灵敏度越高。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（三）标准曲线的绘制及其应用（三）标准曲线的绘制及其应用AC0正偏离正偏离负偏离负偏离标准曲线及其偏离标准曲线及其偏离东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课2 2 非平行入射光引起的偏离非平行入射光引起的偏离 3 3 介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离 胶体和混浊会引起光的散射，吸光度增大。胶体和混浊会引起光的散射，吸光度增大。二、引起偏离朗伯二、引起偏离朗伯-比尔定律的因素比尔定律的因素（一）物理因素（一）物理因素选择性能较好的单色器选择性能较好的单色器 1.1.非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课(二）二）化学因素化学因素1 1 溶液浓度过高引起的偏离溶液浓度过高引起的偏离 浓浓度度过过高高，分分子子或或离离子子之之间间的的相相互互作作用用增增强强，改改变变了了它它们们对对光光的的吸吸收收能能力力，即即改改变变了了吸吸光光系系数。数。2 2 化学反应引起的偏离化学反应引起的偏离 吸光物质会因解离、缔合、形成新的化合物和互变吸光物质会因解离、缔合、形成新的化合物和互变异构的化学反应引起浓度的变化，从而影响对光的异构的化学反应引起浓度的变化，从而影响对光的吸收能力。吸收能力。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课第三节第三节 吸光光度法的仪器吸光光度法的仪器一一 分光光度计的基本部件分光光度计的基本部件（一）光源（一）光源 低压钨灯低压钨灯 612V，4002500nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯 185375nm(二二)单色器单色器 1 1 滤光片滤光片 2 2 棱镜棱镜 3 3 光栅光栅 单色器由入射狭缝、准直镜、色散元件（棱镜或光单色器由入射狭缝、准直镜、色散元件（棱镜或光栅）、聚焦镜和出射狭缝组成。栅）、聚焦镜和出射狭缝组成。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课(三三)吸收池吸收池 比色皿比色皿(四四)检测系统检测系统 硒光电池硒光电池 光光电电管管和和光光电电倍倍增管增管(五五)信号显示系统信号显示系统 检检流流计计、微微安安表表、数数字字电电压压表表、函函数数记记录录仪仪、示波器示波器 0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计UV-2450/2550 东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课二二 吸光度的测量原理吸光度的测量原理100203040506070809010000.10.20.30.40.50.60.81.01.5AT/%A A与与T T的关系图的关系图东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课三三 分光光度计的类型分光光度计的类型波长范围：可见分光光度计、紫外可见分光光度波长范围：可见分光光度计、紫外可见分光光度计和红外分光光度计计和红外分光光度计 仪器结构：单光束、双光束和双波长仪器结构：单光束、双光束和双波长东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计比值比值光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示光束分裂器光束分裂器东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课第四节第四节 分光光度法分析条件的选择分光光度法分析条件的选择一一 显色反应及其条件的选择显色反应及其条件的选择（一）（一）显色反应和显色剂显色反应和显色剂MnMn2+2+-MnO-MnO4-4-;Fe ;Fe2+2+将被测组分转变成有色化合物的反应称为将被测组分转变成有色化合物的反应称为显色反应显色反应，能与被测组分反应使之生成有色物质的试剂称为能与被测组分反应使之生成有色物质的试剂称为显色剂显色剂。1 1 显色反应显色反应 氧化还原反应和络合反应氧化还原反应和络合反应东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课1 1 选择性要好。选择性要好。选择光度分析的显色剂和显色反应时应注意以下选择光度分析的显色剂和显色反应时应注意以下几点几点:2 2 灵敏度要高。灵敏度要高。3 3 对比度要大。对比度要大。有色物质与显色剂两者的最大吸收波长的有色物质与显色剂两者的最大吸收波长的 差别要大（差别要大（60nm)60nm)。4 4 有色化合物要稳定，组成要恒定。有色化合物要稳定，组成要恒定。5 5 显色反应的条件要易于控制。显色反应的条件要易于控制。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课2 2 显色剂显色剂 无机显色剂无机显色剂 和和 有机显色剂。有机显色剂。灵敏度：灵敏度：增大有机分子的共轭体系（生色团）和在显增大有机分子的共轭体系（生色团）和在显色分子中引入取代基（助色团）可增大显色反应的灵敏度。色分子中引入取代基（助色团）可增大显色反应的灵敏度。有机显色剂有机显色剂东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（二）（二）显色反应条件的选择显色反应条件的选择1 1 显色剂的用量显色剂的用量ACRab(1)ACRa(2)ACR(3)试液吸光度与显色剂浓度的关系曲线试液吸光度与显色剂浓度的关系曲线东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（3 3）对络合物组成和颜色的影响。对络合物组成和颜色的影响。三价铁和水杨酸三价铁和水杨酸 pH 4,1:1 pH 9,1:3 pH 9,1:3 黄色络合物黄色络合物2 2 溶液的酸度溶液的酸度酸度的影响：酸度的影响：（1 1）对被测物质存在状态的影响。对被测物质存在状态的影响。金属离子的水解。金属离子的水解。（2 2）对显色剂浓度和颜色的影响。对显色剂浓度和颜色的影响。影响显色剂各形体的浓度和络合物之间颜色的对比度。影响显色剂各形体的浓度和络合物之间颜色的对比度。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课3 3 时间和温度时间和温度温度：温度影响络合物的稳定性、显色反应时间。温度：温度影响络合物的稳定性、显色反应时间。4 4 有机溶剂和表面活性剂有机溶剂和表面活性剂 有机溶剂可降低有色络合物的解离度，从而提有机溶剂可降低有色络合物的解离度，从而提高显色反应的灵敏度。高显色反应的灵敏度。表面活性剂的加入可提高显色反应的灵敏度，表面活性剂的加入可提高显色反应的灵敏度，增加有色络合物的稳定性。增加有色络合物的稳定性。时间：显色时间和稳定时间。时间：显色时间和稳定时间。A-t ;A-T A-t ;A-T东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课5 5 共存离子的干扰共存离子的干扰（1 1）控制酸度控制酸度 4-(5-4-(5-氯氯-2-2-吡啶吡啶)偶氮偶氮-1,3-1,3-二氨基苯测定二氨基苯测定CoCo2+2+,Cu Cu2+2+,Ni,Ni2+2+，Cr Cr3+3+FeFe3+3+可用络合法和氧化法消除。可用络合法和氧化法消除。用用SCNSCN-测测CoCo2+2+时，时，Fe Fe3+3+的干扰可用的干扰可用F F-的络合效应消除。的络合效应消除。用铬天箐用铬天箐S S法测定法测定AlAl3+3+时，时，Fe Fe3+3+的干扰可用抗坏血酸的干扰可用抗坏血酸 的还原作用消除。的还原作用消除。（2 2）加入掩蔽剂加入掩蔽剂 掩蔽剂有络合剂、氧化剂和还原剂。掩蔽剂有络合剂、氧化剂和还原剂。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课二二 吸光光度法的测量误差及测量条件的选择吸光光度法的测量误差及测量条件的选择对于普通分光光度计：对于普通分光光度计：T T是一定的（绝对误差）是一定的（绝对误差）（0.002-0.01)0.002-0.01)（一）（一）仪器测量误差仪器测量误差仪器测量误差指在测量吸光度和透射比时所产生的误差。仪器测量误差指在测量吸光度和透射比时所产生的误差。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课假定某仪器的dT=0.005透射比读数落在透射比读数落在15%70%（即吸光度为（即吸光度为0.150.80）范围内时，由范围内时，由dT引起的引起的|Er|较小较小东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（二）（二）测量条件的选择测量条件的选择（1 1）测量波长的选择测量波长的选择原则：原则：A A 最大吸收波长最大吸收波长 B B 吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小（2 2）吸光度范围的控制吸光度范围的控制 0.150.80 0.150.80东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课D D 若显色剂和试液都有吸收，或显色剂与试液中共存组分若显色剂和试液都有吸收，或显色剂与试液中共存组分的产物有吸收，可加入适当试剂将被测组分掩蔽起来，然的产物有吸收，可加入适当试剂将被测组分掩蔽起来，然后按测量方法加入显色剂和其它试剂，以此溶液作参比液。后按测量方法加入显色剂和其它试剂，以此溶液作参比液。（3 3）参比溶液的选择参比溶液的选择A 当试样溶液、显色剂和所用其它试剂在测定波长当试样溶液、显色剂和所用其它试剂在测定波长无吸收时，选蒸馏水作参比液无吸收时，选蒸馏水作参比液。B B 当试样中其它组分有吸收，显色剂无吸收且不与其当试样中其它组分有吸收，显色剂无吸收且不与其 它组分作用，选择不加显色剂的试样作参比液。它组分作用，选择不加显色剂的试样作参比液。C C 若显色剂或其它试剂对入射光有吸收，应选试剂空若显色剂或其它试剂对入射光有吸收，应选试剂空 白作参比液。白作参比液。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课 用锰标准溶液制作标准曲线时，用蒸馏水作参比液；用锰标准溶液制作标准曲线时，用蒸馏水作参比液；用用KIOKIO4 4 氧化显色法测定含钴试样中的锰时：氧化显色法测定含钴试样中的锰时：测定试样时，应选用不加显色剂的试液作参比液。测定试样时，应选用不加显色剂的试液作参比液。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课第五节第五节 吸光光度法的应用吸光光度法的应用一一 定量分析定量分析2 2 示差分光光度法示差分光光度法（一）单组分的测定（一）单组分的测定1 1一般方法一般方法 试样中只有一种组分在测量波长处产试样中只有一种组分在测量波长处产生吸收，采用标准曲线法测定。生吸收，采用标准曲线法测定。用于常量组分的测定。用于常量组分的测定。以一个浓度比待测试液以一个浓度比待测试液c cx x稍低的标准溶液稍低的标准溶液c cs s为参比液，为参比液，也就是把也就是把c cs s溶液的透射比调解为溶液的透射比调解为100100，吸光度为，吸光度为0 0。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课试液的吸光度（示差吸光度）试液的吸光度（示差吸光度）Af东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课常规法常规法TxT0 5 1050100 落在测量误差较落在测量误差较 大大 的范围的范围示差法示差法T0 5 1050100TxT0T0 落在测量误差较落在测量误差较 小小 的范围的范围东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课1 1各测定组分在吸收曲线上都有自己独立的吸收峰，各测定组分在吸收曲线上都有自己独立的吸收峰，彼此完全或部分不重叠，可按单组分方法逐一测定。彼此完全或部分不重叠，可按单组分方法逐一测定。（二）多组分的同时测定（二）多组分的同时测定2 2 如各测定组分的吸收曲线互相重叠，可利用吸光度如各测定组分的吸收曲线互相重叠，可利用吸光度 的加和性解联立方程。的加和性解联立方程。东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课二二 络合物组成和酸碱解离常数的测定络合物组成和酸碱解离常数的测定（一）络合物组成的测定（一）络合物组成的测定摩尔比法适用于解离度较小、络摩尔比法适用于解离度较小、络合比高的合比高的络合物组成的测定。络合物组成的测定。ACR/CMn1 1 摩尔比法摩尔比法东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课2 2 等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法保持溶液中保持溶液中cM+cR为常数，连续改变为常数，连续改变cR和和cM之比之比,配制出一配制出一系列显色溶液。系列显色溶液。等摩尔连续变化法适用于络合比低、等摩尔连续变化法适用于络合比低、稳定性较高的络合物组成的测定。稳定性较高的络合物组成的测定。0AcM/cR+cMAA0东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课（二）酸碱解离常数的测定（二）酸碱解离常数的测定 以一元弱酸为例以一元弱酸为例当共轭酸碱的吸当共轭酸碱的吸收光谱显著不同收光谱显著不同东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课东东 北北 师师 范范 大大 学学 分分 析析 化化 学学 精精 品品 课课 本章小结本章小结1 1 朗伯比尔定律朗伯比尔定律2 2 吸光系数、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度。吸光系数、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度。3 3 吸光分析条件和参比溶液的选择。吸光分析条件和参比溶液的选择。4 4 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 A A 定量分析定量分析 B B 络合物的组成和酸碱解离常数的测定。络合物的组成和酸碱解离常数的测定。