分析方法的验证

分 析 方 法 的 验 证 内 容 提 要n 法 规 要 求n 分 析 方 法 验 证 的 作 用 、 适 用 范 围 及 一 般 原 则n 哪 些 检 验 项 目 需 要 方 法 验 证 ？n 方 法 验 证 内 容 有 哪 些 ？n 方 法 确 认n 再 验 证 n 分 析 方 法 验 证 流 程n 验 证 文 件 法 规 要 求n 第 十 二 条 质 量 控 制 的 基 本 要 求 ：（ 四 ） 检 验 方 法 应 经 过 验 证 或 确 认 ；n 第 二 百 二 十 三 条 检 验 应 有 物 料 和 不 同 生 产 阶 段 产 品的 书 面 检 验 操 作 规 程 ， 阐 述 所 用 方 法 、 仪 器 和 设 备 。检 验 结 果 应 有 记 录 。1. 企 业 应 确 保 药 品 按 照 注 册 批 准 的 方 法 进 行 全 项 检 验 。2. 符 合 下 列 情 形 之 一 的 ， 应 对 检 验 方 法 进 行 验 证 ： (1) 采 用 新 的 检 验 方 法 ； (2) 检 验 方 法 需 变 更 的 ； (3) 采 用 中 华 人 民 共 和 国 药 典 及 其 它 法 定 标 准 未 收载 的 检 验 方 法 ； (4) 法 规 规 定 的 其 它 需 要 验 证 的 检 验 方 法 。3. 对 不 需 要 进 行 验 证 的 检 验 方 法 ， 企 业 应 对 检 验 方 法 进行 确 认 ， 以 确 保 检 验 数 据 准 确 、 可 靠 。 分 析 方 法n 分 析 方 法 是 为 完 成 检 验 项 目 而 设 定 和 建 立 的 测试 方 法 ， 它 详 细 描 述 了 完 成 分 析 检 验 的 每 一 步骤 。n 分 析 方 法 可 采 用 化 学 分 析 方 法 和 仪 器 分 析 方 法 。这 些 分 析 方 法 各 有 特 点 ， 同 一 分 析 方 法 可 用 于不 同 的 检 验 项 目 ， 但 验 证 内 容 会 有 不 同 。 例 如采 用 高 效 液 相 色 谱 法 用 于 药 品 的 鉴 别 和 杂 质 定量 检 验 应 进 行 不 同 要 求 的 方 法 验 证 。 前 者 重 点要 求 验 证 专 属 性 ， 而 后 者 则 需 要 重 点 验 证 专 属性 、 准 确 度 和 定 量 限 。 分 析 方 法 验 证 的 作 用n 只 有 经 过 验 证 的 分 析 方 法 才 可 以 可靠 有 效 地 用 于 控 制 药 品 质 量 ， 因 此方 法 验 证 是 制 订 质 量 标 准 的 基 础 适 用 范 围n 适 用 于 ： 物 料 ， 中 间 产 品 ， 过 程 控 制 和 成 品 的 理 化 分 析 方 法 的 验 证 . 清 洁 验 证 方 法 的 验 证 n 不 适 用 于 化 学 药 品 的 微 生 物 方 法 方 法 验 证 的 一 般 原 则n 通 常 情 况 下 ， 分 析 方 法 需 进 行 方 法 验 证 。但 外 观 、 崩 解 时 限 、 密 度 、 重 量 、 pH 值 、硫 酸 盐 、 灰 分 、 装 量 等 不 需 进 行 方 法 验证 。 n 方 法 验 证 的 内 容 应 根 据 检 验 项 目 的 要 求 ，结 合 所 采 用 分 析 方 法 的 特 点 确 定 。 n 同 一 分 析 方 法 用 于 不 同 的 检 验 项 目 会 有不 同 的 验 证 要 求 。 哪 些 检 验 项 目 需 要 方 法 验 证 ？需 验 证 的 检 验 项 目 分 为 四 类 ： n 鉴 别 试 验 n 杂 质 的 限 度 检 查 n 杂 质 的 定 量 测 定 n 含 量 测 定 哪 些 检 验 项 目 需 要 方 法 验 证 ？n 鉴 别 的 目 的 在 于 判 定 被 分 析 物 是 目 标 化 合 物 ，而 非 其 它 物 质 。 故 应 具 有 较 强 的 专 属 性 和 耐 用性 。n 杂 质 检 查 主 要 用 于 控 制 主 成 分 以 外 的 杂 质 ， 如无 机 杂 质 ， 有 机 杂 质 等 。 杂 质 检 查 分 为 限 度 检 (侧 重 专 属 性 、 检 测 限 和 耐用 性 )和 定 量 测 定 (强 调 专 属 性 、 准 确 度 、 精 密度 、 线 性 、 范 围 、 定 量 限 和 耐 用 性 ) 。 n 含 量 测 定 对 准 确 度 要 求 较 高 ， 因 此 应 验 证 专 属性 、 准 确 度 和 线 性 等 要 求 。 方 法 验 证 内 容 有 哪 些 ？验 证 项 目 鉴 别 杂 质定 性 杂 质定 量 含 量测 定专 属 性 + + + +线 性 - - + +范 围 - - + +准 确 度 - - + +精 密 度 -重 复 性 - - + +精 密 度 -中 间 精密 度 - - + +检 测 限 - + - - 定 量 限 - - + -耐 用 性 + + + + 专 属 性n 专 属 性 系 指 在 其 他 成 分 (如 ： 杂 质 、 降 解产 物 、 等 )可 能 存 在 下 ， 采 用 的 方 法 能 正确 测 定 出 被 测 物 的 特 性 。 n 通 常 , 鉴 别 反 应 、 杂 质 检 查 、 含 量 测 定 均应 考 察 其 专 属 性 。 如 一 种 方 法 不 够 专 属 ，可 由 其 它 分 析 方 法 予 以 补 充 。 例 如 检 测具 有 旋 光 特 性 的 活 性 物 质 , 除 采 用 高 效 液相 色 谱 法 外 ,还 应 增 加 旋 光 度 的 检 查 。 专 属 性n 鉴 别 试 验 -含 被 测 成 分 的 供 试 品 呈 正 反应 ， 而 不 含 被 测 成 分 的 供 试 品 以 及 结 构相 似 或 组 分 中 的 有 关 化 合 物 ， 应 均 呈 负反 应 。 专 属 性 （ 杂 质 和 含 量 测 定 ）n 方 法 1： 在 杂 质 可 获 得 的 情 况 下 ， 可 向 试 样 中加 入 一 定 量 的 杂 质 ， 考 察 杂 质 与 共 存 物 质 能 得到 分 离 和 检 出 （ 考 察 测 定 结 果 是 否 受 干 扰 ）n 方 法 2： 在 杂 质 或 降 解 产 物 不 能 获 得 的 情 况 下 ，专 属 性 可 通 过 测 定 含 有 杂 质 或 降 解 产 物 的 试 样 ，与 另 一 个 已 验 证 的 方 法 或 药 典 方 法 比 较 结 果 。 或 对 试 样 用 强 光 照 射 ， 高 温 ， 高 湿 ， 酸 （ 碱 ）水 解 或 氧 化 的 方 法 进 行 加 速 破 坏 ， 以 研 究 可 能的 降 解 产 物 和 降 解 途 径 ， 并 比 对 破 坏 前 后 检 出的 杂 质 个 数 。 必 要 时 进 行 峰 纯 度 检 查 。 线 性n 线 性 是 定 量 测 定 的 基 础 ， 涉 及 定 量 测 定 的 项 目 ，如 杂 质 定 量 测 定 和 含 量 测 定 均 需 验 证 线 性 。 n 验 证 方 法 可 用 一 贮 备 液 经 精 密 稀 释 ， 或 分 别 精 密 称 样 ，制 备 一 系 列 供 试 样 品 的 方 法 进 行 测 定 ， 至 少 制备 5个 浓 度 （ 通 常 选 取 50%、 80%、 100%、120%、 150%） 。 每 一 个 浓 度 的 样 品 3份 ， 以应 信 测 得 的 响 应 号 作 为 被 测 物 浓 度 的 函 数 作 图 ，观 察 是 否 呈 线 性 ， 用 最 小 二 乘 法 进 行 线 性 回 归 。 范 围n 指 能 达 到 一 定 精 密 度 、 准 确 度 和 线 性 的测 试 方 法 所 适 用 的 高 低 限 浓 度 或 量 的 区间 。n 对 于 原 料 药 的 含 量 测 定 ， 范 围 应 为 测 试浓 度 的 80%120%n 杂 质 测 定 ， 范 围 应 为 测 试 浓 度 的50%120%。 准 确 度n 准 确 度 系 指 用 该 方 法 测 定 的 结 果 与 真 实值 或 参 考 值 接 近 的 程 度 。 一 般 用 回 收 率表 示 。 准 确 度 应 在 规 定 的 范 围 内 测 试 。 准 确 度 -原 料 药 含 量 测 定n 方 法 1： 用 已 知 纯 度 的 对 照 品 或 供 试 品 进 行 测定 。 n 方 法 2： 用 本 法 所 得 结 果 与 已 知 准 确 度 的 另 一方 法 测 定 的 结 果 进 行 比 较 n 如 ： 测 定 含 量 的 准 确 度 , 按 标 示 量 的 80%, 100%和 120%配 制 三 个 浓 度 的 溶 液 ， 每 个 浓 度各 分 别 制 备 3份 供 试 品 溶 液 ， 进 行 测 定 。 根 据测 定 结 果 与 配 制 浓 度 计 算 出 平 均 回 收 率 以 及 相对 标 准 偏 差 。 准 确 度 -杂 质 定 量 测 定n 方 法 1： 可 向 原 料 药 加 入 已 知 量 杂 质 进 行测 定 。 n 方 法 2： 如 果 不 能 得 到 杂 质 或 降 解 产 物 ，可 用 本 法 测 定 结 果 与 另 一 成 熟 的 方 法 进行 比 较 ， 如 药 典 方 法 或 经 过 验 证 的 方 法 精 密 度n 精 密 度 系 指 在 规 定 的 测 试 条 件 下 ， 同 一均 匀 供 试 品 ， 经 多 次 取 样 测 定 所 得 结 果之 间 的 接 近 程 度 。 n 精 密 度 一 般 用 偏 差 、 标 准 偏 差 或 相 对 标准 偏 差 表 示 精 密 度 验 证 方 法n 精 密 度 可 从 重 复 性 、 中 间 精 密 度 、 重 现性 三 个 层 次 考 察 n 重 复 性 ： 在 相 同 条 件 下 ， 由 同 一 个 分 析人 员 测 定 所 得 结 果 的 精 密 度 。n 验 证 方 法 ： 设 计 3个 不 同 浓 度 ， 每 个 浓 度各 分 别 制 备 3份 供 试 品 溶 液 ， 进 行 测 定 3次 ， 或 将 相 当 于 100 的 浓 度 水 平 的 供 试品 溶 液 ， 用 至 少 测 定 6次 的 结 果 进 行 评 价 。 精 密 度 验 证 方 法n 中 间 精 密 度 ： 在 同 一 个 实 验 室 ， 不 同 时间 由 不 同 分 析 人 员 用 不 同 设 备 测 定 结 果之 间 的 精 密 度 。 n 验 证 方 法 ： 同 一 批 样 品 每 位 分 析 员 准 备六 份 进 行 测 量 ， 计 算 两 人 之 间 平 均 值 的差 异 精 密 度 验 证 方 法n 重 现 性 :在 不 同 实 验 室 之 间 由 不 同 分 析 人员 测 定 结 果 之 间 的 精 密 度 。n 一 般 实 验 室 不 进 行 此 项 考 察 。 只 有 当 分析 方 法 将 被 法 定 标 准 采 用 时 ， 才 进 行 重现 性 试 验 。 检 测 限 和 定 量 限n 检 测 限 :被 测 物 能 被 检 测 出 的 最 小 值 。 (杂质 限 度 检 查 时 应 验 证 )n 定 量 限 :被 测 物 能 被 准 确 测 定 的 最 小 量 ，其 测 定 结 果 应 具 有 一 定 准 确 度 和 精 密 度 。(杂 质 定 量 检 查 时 应 验 证 ) 检 测 限 和 定 量 限n 非 仪 器 分 析 目 视 法 ： 用 已 知 浓 度 的 被 测 物 ， 试验 出 能 被 可 靠 地 检 测 出 的 最 低 浓 度 或 量 。 n 信 噪 比 法 ： 用 于 能 显 示 基 线 噪 音 的 分 析 方 法 ，即 把 已 知 低 浓 度 试 样 测 出 的 信 号 与 空 白 样 品 测出 的 信 号 进 行 比 较 ， 计 算 出 能 被 可 靠 地 检 测 出的 最 低 浓 度 或 量 。 一 般 以 信 噪 比 为 3： 1时 相 应浓 度 或 注 入 仪 器 的 量 确 定 检 测 限 。 对 于 定 量 限典 型 信 噪 比 为 10:1。 耐 用 性n 耐 用 性 系 指 测 定 条 件 有 小 的 变 动 时 ， 测定 结 果 不 受 影 响 的 承 受 程 度 。 n 一 般 开 始 研 究 分 析 方 法 时 ， 就 应 考 虑 其耐 用 性 。 经 试 验 ， 应 说 明 小 的 变 动 能 否符 合 系 统 适 用 性 试 验 要 求 ， 以 确 保 方 法有 效 。 如 果 通 过 耐 用 性 研 究 发 现 分 析 方法 对 某 个 或 某 些 测 试 条 件 敏 感 或 要 求 苛刻 ， 则 建 议 在 方 法 中 予 以 写 明 。 耐 用 性n 典 型 影 响 耐 用 性 的 变 动 因 素 n 1. 被 测 溶 液 的 稳 定 性 n 2. 液 相 色 谱 法 (HPLC)中 的 典 型 影 响 耐 用性 的 变 动 因 素 （ 流 动 相 的 组 成 、 流 动 相的 pH值 、 不 同 品 牌 或 不 同 批 号 的 同 类型 色 谱 柱 、 柱 温 、 流 速 等 ） 耐 用 性 -溶 液 的 稳 定 性 研 究 n 溶 液 的 稳 定 性 研 究 ： 用 来 证 明 样 品 溶 液 和 标 准 品溶 液 在 规 定 的 储 存 条 件 下 在 一 定 时 间 内 保 持 稳 定 。n 如 果 方 法 中 没 有 规 定 有 效 期 ， 样 品 溶 液 和 标 准 品溶 液 需 进 行 稳 定 性 研 究 。 n 研 究 方 法 ： 配 制 好 的 样 品 溶 液 和 标 准 品 溶 液 ， 在室 温 或 其 他 条 件 下 （ 如 冰 箱 2-8 C ） 储 存 适 当 的时 间 。 每 个 间 隔 点 ， 用 新 鲜 配 制 的 标 准 品 溶 液 做对 照 ， 测 定 储 存 的 样 品 溶 液 和 标 准 品 溶 液 。 n 测 定 结 果 与 初 始 结 果 进 行 比 较 ， 符 合 接 受 标 准 便可 确 认 样 品 溶 液 和 标 准 品 溶 液 在 规 定 的 储 存 条 件下 在 规 定 储 存 时 间 是 稳 定 的 。 耐 用 性 （ HPLC ）n HPLC中 的 变 动 因 素 （ 及 变 化 范 围 ） n 流 动 相 的 组 成 ： 有 机 相 的 5%, 如 :cAMP规定 流 动 相 缓 冲 溶 液 与 乙 腈 的 比 例 为 85:15, 那 么允 许 使 用 90:10 至 80:20范 围 的 比 例 . n 流 动 相 的 pH值 ： 0.5, 如 果 已 知 pH值 为 关 键影 响 因 素 , 变 化 范 围 会 更 小 。 n 色 谱 柱 ： 如 可 能 ， 推 荐 使 用 同 一 品 牌 的 填 料 可由 不 同 供 应 商 填 充 的 色 谱 柱 。 可 通 过 回 顾 实 验分 析 次 数 或 方 法 研 究 确 定 色 谱 柱 的 质 量 。 n 柱 温 ： 5 耐 用 性n %Difference=100-100 Rm/Rsn 其 中 ： Rm改 变 条 件 后 的 含 量 结 果 ；n Rs标 准 条 件 获 得 的 含 量 结 果 。n 原 料 药 含 量 差 异 不 得 大 于 1.5%。 什 么 时 候 需 要 方 法 确 认 ？n 适 用 于 药 典 方 法 和 其 他 已 验 证 的 法 定 标 准 。 因为 药 典 方 法 和 其 他 法 定 标 准 被 认 为 是 验 证 过 的分 析 方 法 ， 不 需 要 验 证 ， 但 需 要 通 过 方 法 确 认来 证 明 方 法 在 该 实 验 室 条 件 下 的 适 应 性 。 n 不 适 用 于 ： 实 验 室 日 常 测 试 操 作 步 骤 不 需 要 进行 方 法 确 认 ， 例 如 （ 包 括 但 不 限 于 ） 干 燥 失 重 ，炽 灼 残 渣 ， 各 种 湿 法 化 学 步 骤 如 酸 值 和 简 单 的仪 器 方 法 如 PH计 ， 除 非 有 特 殊 要 求 。 再 验 证n 当 原 料 药 合 成 工 艺 发 生 改 变 时 ， 可 能 引入 新 的 杂 质 ， 杂 质 检 查 方 法 和 含 量 测 定方 法 的 专 属 性 就 需 要 再 进 行 验 证n 当 质 量 标 准 中 某 一 项 目 分 析 方 法 发 生 部分 改 变 时 ， 如 HPLC测 定 含 量 时 ， 检 测 波长 发 生 改 变 ， 则 需 要 相 应 的 验 证 ， 证 明修 订 后 分 析 方 法 的 合 理 性 、 可 行 性 。 再 验 证n 再 验 证 原 则 ： 根 据 改 变 的 程 度 进 行 相 应的 再 验 证 。 当 这 种 改 变 到 达 一 定 程 度 时 ，则 需 要 完 整 的 验 证 。 如 分 析 方 法 完 全 改变 时 ， 则 应 视 为 新 方 法 并 需 要 完 整 的 验证 。n 方 法 再 验 证 是 对 分 析 方 法 的 完 善 过 程 ，应 根 据 实 际 改 变 情 况 进 行 再 验 证 ， 从 而保 证 所 采 用 的 分 析 方 法 的 可 靠 性 。 分 析 方 法 验 证 流 程n 分 析 方 法 验 证 流 程 .doc 验 证 文 件n 验 证 方 案 内 容n 方 法 验 证 的 执 行n 验 证 报 告 的 起 草 与 批 准n 验 证 文 件 的 保 存 验 证 方 案 内 容 n 唯 一 的 方 案 号 . n 分 析 方 法 的 版 本 号 以 及 物 料 /产 品 的 名 称 : n 验 证 的 实 验 项 目 n 验 证 的 原 则 和 目 的 n 验 证 的 参 数 以 及 接 受 标 准 n 验 证 实 验 中 所 用 标 准 品 ， 检 验 样 品 信 息 n 分 析 仪 器 的 相 关 信 息 n 所 用 仪 器 的 信 息 ， 如 已 确 认 的 情 况 下 n 方 案 起 草 者 ， 复 核 人 和 批 准 者 需 签 字 确 认 方 法 验 证 的 执 行进 行 方 法 验 证 前 ， 应 确 认 如 下 条 件 已 符 合 ：n 从 事 分 析 方 法 验 证 的 分 析 师 是 合 格 的 分 析 师 。 n 所 用 分 析 仪 器 已 通 过 验 证 和 校 验 。 n 实 验 必 须 依 据 批 准 的 方 案 进 行 。 n 实 验 过 程 中 任 何 失 败 的 测 试 ， 过 程 中 的 偏 差 或异 常 均 需 复 核 和 评 估 并 查 出 原 因 。 过 程 中 的 偏差 或 异 常 需 通 过 正 式 的 体 系 （ 如 调 查 报 告 ， 验证 报 告 中 偏 差 的 鉴 定 和 批 准 ） 进 行 记 录 和 批 准 . 验 证 报 告 的 起 草 与 批 准n 唯 一 的 报 告 号 . n 相 关 方 案 号 n 分 析 方 法 的 版 本 号 以 及 物 料 /产 品 的 名 称 : n 验 证 的 实 验 项 目 n 验 证 实 验 中 所 用 标 准 品 ， 检 验 样 品 以 及 分 析 仪 器 的 相关 信 息 n 结 果 汇 总 ， 并 与 方 案 中 规 定 的 接 收 标 准 进 行 评 估 n 偏 离 方 案 的 偏 差 汇 总 及 处 理 结 论 n 结 论 ， 需 对 方 法 验 证 是 否 成 功 进 行 正 式 描 述 。 n 报 告 起 草 者 ， 复 核 人 和 批 准 者 需 签 字 确 认 验 证 文 件 的 保 存n 分 析 方 法 验 证 的 方 案 与 报 告 的 存 档 n 方 案 与 报 告 均 集 中 存 档 ， 并 长 期 保 存