修改第四章植物离体快速繁殖

第 四 章 植 物 离 体 快 速 繁 殖 第 一 节 植 物 快 速 繁 殖 的 概 述一 、 植 物 快 速 繁 殖 的 概 念 植 物 快 速 繁 殖 就 是 利 用 细 胞 的 全 能 性 理 论 及 细 胞 的再 生 特 性 ， 在 组 织 培 养 条 件 下 ， 加 速 繁 殖 材 料 的 个 体 生 产 ，提 高 繁 殖 系 数 ， 使 其 在 较 短 的 时 间 繁 殖 较 多 植 株 的 方 法 (它 是一 种 微 型 操 作 过 程 ， 称 为 微 繁 )。 二 、 植 物 快 速 繁 殖 的 意 义（ 一 ） 有 效 保 持 植 物 优 良 品 种 的 特 性 ；（ 二 ） 生 产 无 病 毒 的 种 苗 ， 防 止 品 种 退 化 ；（ 三 ） 快 速 繁 殖 新 优 品 种 ， 加 速 优 良 品 种 的 推 广 ；（ 四 ） 节 约 耕 地 ， 节 约 留 种 成 本 ， 提 高 农 产 品 的 产 出 率 ；（ 五 ） 便 于 流 通 与 运 输 ；（ 六 ） 珍 稀 物 种 保 存 ； 第 二 节 植 物 快 速 繁 殖 再 生 途 径 利 用 植 物 组 织 培 养 技 术 进 行 快 速 繁 殖 时 ， 植 物 的 根 、 茎 、叶 、 叶 柄 、 花 器 官 、 孢 子 等 均 可 作 为 外 植 体 进 行 离 体 培 养 ， 通过 下 列 再 生 途 径 诱 导 分 化 产 生 小 植 株 。 （ 一 ） 器 官 途 径1. 器 官 型 植 物 的 茎 尖 部 分 是 分 化 组 织 区 ， 即 产 生 植 物 地 上 与 地 下 部分 的 全 能 性 区 域 。 存 在 于 叶 腋 间 的 腋 芽 在 正 常 情 况 下 均 能 发 育成 枝 条 。 游离细胞或原生质体侧芽分化诱导生根茎尖嫩枝叶片茎段直接成芽胚状体诱导生根愈伤组织芽愈伤组织胚状体萌发植株 再生植株 2. 器 官 发 生 型 器 官 发 生 型 诱 导 途 径 即 外 植 体 脱 分 化 形 成 愈 伤 组 织 再 分 化出 器 官 的 方 式 。 将 离 体 组 织 或 器 官 在 培 养 基 上 进 行 培 养 时 ， 形 成愈 伤 组 织 。 将 愈 伤 组 织 转 移 到 适 宜 的 培 养 基 上 继 续 培 养 ， 这 些 愈伤 组 织 细 胞 将 发 生 生 理 代 谢 上 的 改 变 ， 经 分 裂 逐 步 产 生 分 生 细 胞团 和 分 生 组 织 ， 再 进 一 步 分 化 出 具 有 根 、 茎 、 叶 的 完 整 植 株 ， 这种 从 愈 伤 组 织 再 生 出 小 植 株 的 过 程 叫 再 分 化 。 幼根外植体愈伤组织脱分化植物体生长点植株分离幼茎 3. 原 球 茎 型 由 茎 尖 或 腋 芽 培 养 分 化 成 原 球 茎 ， 最 早 是 1960年 法 国 的Morel发 现 虎 头 兰 的 茎 尖 培 养 中 形 成 扁 平 的 小 球 体 与 其 种 子 胚 发育 的 球 茎 非 常 相 似 ， 叫 原 球 茎 。 在 建 兰 的 茎 尖 或 侧 芽 培 养 中 发 现其 上 长 出 白 色 的 圆 球 突 起 ， 将 它 切 成 小 块 又 会 长 出 绿 色 莲 座 叶 状的 原 球 茎 ， 再 切 割 这 种 原 球 茎 成 为 一 个 无 性 繁 殖 系 ， 将 它 置 入 植物 激 素 仅 加 10%椰 乳 的 培 养 基 中 ， 即 可 分 化 出 茎 、 叶 和 根 。 4. 球 茎 芽 型 不 同 发 育 阶 段 的 球 茎 都 是 茎 或 枝 条 的 变 态 形 式 。 由 非茎 尖 或 侧 芽 的 外 植 体 不 经 脱 分 化 的 愈 伤 组 织 ， 直 接 从 圆 球 茎分 化 出 芽 和 根 器 官 的 方 式 叫 球 茎 芽 型 。 5. 块 茎 型 块 茎 是 膨 大 的 地 下 茎 ， 其 表 面 有 芽 眼 。 当 花 叶 芋 的叶 片 或 叶 柄 接 种 在 培 养 基 上 ， 先 形 成 类 似 愈 伤 组 织 的 小 硬 突起 ， 并 逐 渐 形 成 粒 状 的 芋 块 。 随 着 小 芋 块 的 增 大 ， 分 化 出 的芽 也 越 密 集 并 形 成 许 多 小 苗 ， 在 小 苗 基 部 与 芋 块 交 接 处 分 化出 白 色 的 根 ， 与 正 常 块 茎 切 块 繁 殖 的 幼 苗 相 同 ， 即 首 先 形 成有 分 化 能 力 的 块 茎 （ 芋 块 ） ， 然 后 在 块 茎 上 分 化 出 小 芋 块 ，再 在 其 上 分 化 出 芽 和 根 ， 最 后 生 长 发 育 成 小 植 株 。 6. 鳞 茎 型 百 合 的 鳞 茎 切 块 接 种 在 不 同 激 素 配 比 的 修 改 的 MS培 养基 上 ， 鳞 片 基 部 近 轴 面 或 在 边 缘 直 接 形 成 带 根 的 小 鳞 茎 。 而卷 丹 鳞 片 的 顶 部 、 中 部 和 基 部 均 能 诱 导 分 化 出 小 鳞 茎 。 华 西贝 母 的 二 、 三 年 生 幼 嫩 鳞 片 ， 可 不 经 过 愈 伤 组 织 直 接 形 成 小瘤 状 或 叶 状 体 ， 再 将 其 切 块 及 时 移 入 修 改 的 ER培 养 基 上 ， 二 、三 个 月 后 诱 导 出 与 自 然 界 条 件 下 生 长 相 同 的 贝 母 鳞 茎 。 7. 根 茎 型 该 途 径 主 要 应 用 于 蕨 类 植 物 中 。 蕨 类 具 有 横 向 的 茎 及直 立 的 短 根 茎 ， 为 组 织 培 养 的 最 佳 外 植 体 ， 通 过 根 状 茎 上 产生 的 蕨 叶 及 根 ， 迅 速 发 育 形 成 再 生 植 株 。 8. 微 小 短 枝 扦 插 型 用 微 小 短 枝 扦 插 在 培 养 基 上 ， 添 加 外 源 的 细 胞 分 裂素 ， 促 使 具 有 顶 芽 的 或 没 有 顶 芽 的 休 眠 芽 启 动 生 长 ， 形 成 微型 的 多 枝 多 芽 的 丛 状 结 构 。 经 几 个 月 ， 将 丛 生 芽 的 一 个 枝 条转 接 继 代 ， 重 复 芽 -苗 的 增 殖 培 养 ， 从 而 迅 速 获 得 无 数 的 嫩 枝 。 9. 孢 子 型 用 成 熟 或 未 成 熟 的 孢 子 进 行 培 养 。 它 包 括 花 药 培 养和 花 粉 培 养 。 花 药 培 养 属 器 官 培 养 的 范 畴 ， 一 定 发 育 时 期 的花 药 在 适 当 条 件 下 ， 通 过 胚 发 生 途 径 和 器 官 发 生 途 径 形 成 单倍 体 植 株 。 花 粉 培 养 （ 及 游 离 小 孢 子 培 养 ） 属 细 胞 培 养 的 范畴 ， 通 过 人 工 培 养 离 体 花 粉 或 小 孢 子 ， 改 变 其 形 成 花 粉 管 和精 子 的 发 育 途 径 ， 诱 导 形 成 单 倍 体 植 株 。 （ 二 ） 胚 状 体 发 生 途 径 证 实 高 等 植 物 细 胞 存 在 全 能 性 的 最 惊 人 事 实 是 由 培 养 的植 物 体 细 胞 可 以 诱 导 分 化 形 成 胚 状 体 ， 并 随 后 经 过 原 胚 、 球形 胚 、 心 形 胚 、 鱼 雷 胚 、 子 叶 胚 共 个 时 期 的 类 胚 途 径 ， 发育 成 完 整 的 植 株 。 通 常 产 生 胚 状 体 的 途 径 有 ：（ 1） 直 接 胚 状 体 发 生 -从 外 植 体 的 某 些 部 位 直 接 诱 导 出 胚 状 体 。 （ 2） 间 接 胚 状 体 发 生 （ 愈 伤 组 织 分 化 出 胚 状 体 ） -在 此 过 程 中 ，首 先 是 外 植 体 细 胞 感 受 培 养 刺 激 ， 诱 导 形 成 愈 伤 组 织 ； 接 着 愈 伤 组织 细 胞 胚 性 化 ； 第 三 阶 段 是 胚 性 细 胞 形 成 胚 状 体 。（ 3） 从 悬 浮 培 养 的 细 胞 中 诱 导 -培 养 细 胞 在 液 体 培 养 及 中 ， 先产 生 胚 性 细 胞 团 ， 再 形 成 胚 状 体 。（ 4） 由 花 粉 产 生 的 单 倍 体 胚 状 体 。（ 5） 由 原 生 质 体 产 生 胚 状 体 。 类型方式特点事例器官型腋芽萌发,以芽增殖芽,扩大繁殖系数繁殖系数高,遗传稳定,是快繁的主要方式甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等器官发生型通过脱分化形成愈伤组织,再分化出苗可获得与母株相同的小植株,系数低,用于分化研究烟草、油菜等胚状体发生型从愈伤组织或直接从子叶下胚轴花药培养中产生系数高,首先证明细胞的全能性甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 原 球 茎 型 由 茎 尖 或 腋 芽 产 生 原球 茎 遗 传 稳 定 ,原 球 茎 可 作为 繁 殖 系 母 体 兰 花球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生 圆 球 形球 茎 芽 ,一 端 出 根 另 一端 出 芽 遗 传 稳 定 ,球 茎 芽 可 直接 放 入 土 中 种 植 观 赏 海 棠块 茎 型 叶 片 叶 柄 上 形 成 粒 状芋 块 ,进 一 步 分 化 出 根和 芽 块 茎 芽 可 作 为 繁 殖 母 体 ,不 断 切 割 繁 殖 移 栽 ,成活 率 高 花 叶 芋鳞 茎 型 鳞 片 近 轴 面 或 边 缘 直接 形 成 带 根 的 小 鳞 茎 在 试 管 内 形 成 小 鳞 茎 需要 较 长 的 时 间 百 合 、 郁 金 、贝 母 等 孢 子 型 用 成 熟 或 未 成 熟 的 孢子 进 行 培 养 孢 子 繁 殖 最 困 难 的 是 表面 消 毒 ,萌 发 时 间 长 地 钱 、 狼 尾 蕨等根 茎 型 蕨 类 的 横 向 茎 或 直 立的 短 根 茎 为 外 植 体 培养 根 状 茎 上 产 生 蕨 叶 及 根 ,繁 殖 速 度 比 孢 子 型 快 肾 蕨 、 裂 叶 肾蕨 、 波 士 顿 蕨等微 枝 扦 插 型 带 芽 的 小 插 条 在 试 管内 进 行 无 菌 扦 插 为 木 本 植 物 进 行 快 速 繁殖 的 主 要 方 式 葡 萄 、 杨 树 等 第 三 节 常 见 问 题 及 克 服 措 施 污 染 、 褐 化 、 玻 璃 化 是 组 织 培 养 过 程 中 的 最 主 要 问 题一 、 污 染 及 控 制 污 染 问 题 是 植 物 快 繁 过 程 中 常 见 的 而 且 也 必 须 给 予 高 度 重 视的 一 个 问 题 ， 许 多 试 管 苗 因 污 染 率 过 高 而 导 致 成 本 较 高 ， 经 济 效 益不 佳 。 一 般 而 言 ， 工 厂 化 生 产 试 管 苗 的 污 染 率 应 控 制 在 %以 内 。 (一 )污 染 的 类 型 1、 细 菌 污 染 菌 斑 呈 粘 液 状 物 ， 常 在 接 种 1-2天 后 出 现 。 2、 真 菌 污 染 污 染 部 分 长 有 不 同 颜 色 的 霉 菌 ， 常 在 接 种 10天 左 右 后 出 现 。 细菌污染真菌污染 (一 )污 染 的 控 制1、 材 料 带 菌 与 控 制 。 原 因 ： 选 用 的 外 植 体 因 过 大 等 原 因 本 身 带 有 病 菌 ， 或 继 代 培养 的 材 料 本 身 带 有 病 菌 。 控 制 方 法 ： 彻 底 灭 菌 ， 特 别 是 对 于 有 绒 毛 的 外 植 体 ； 初 代 接种 时 使 用 大 小 适 宜 的 外 植 体 ； 在 继 代 的 培 养 中 ， 每 次 继 代 之 前 都要 对 继 代 的 材 料 进 行 仔 细 检 查 ， 凡 是 污 染 的 材 料 应 予 以 丢 弃 或 进行 重 新 灭 菌 。 2、 接 种 污 染 与 控 制 。 原 因 ： 第 一 是 由 于 超 净 工 作 台 滤 出 的 空 气 中 带 菌 超 标 造 成的 ， 属 于 这 种 情 况 要 及 时 修 理 或 更 换 超 净 工 作 台 ； 第 二 是 由 于 交叉 污 染 造 成 的 ， 要 求 接 种 者 操 作 细 心 ， 接 种 用 的 镊 子 不 要 与 酒 精灯 、 台 面 等 接 触 ， 一 旦 接 触 应 立 即 进 行 消 毒 处 理 ， 同 时 各 瓶 材 料接 完 时 要 对 镊 子 、 剪 刀 等 用 具 进 行 消 毒 ； 第 三 是 由 接 种 者 呼 吸 、工 作 态 度 等 原 因 造 成 的 。 控 制 方 法 ： 要 求 操 作 人 员 端 正 工 作 态 度 ， 自 身 做 到 尽 量 少 带菌 ， 在 接 种 时 应 用 酒 精 棉 擦 手 ， 穿 上 无 菌 的 白 大 衣 ， 带 上 口 罩 和帽 子 3、 培 养 过 程 感 染 与 控 制 。原 因 ： 在 材 料 培 养 的 过 程 中 ， 环 境 中 病 菌 多 、 湿 度 大 、 温 度高 。控 制 方 法 ： 要 经 常 进 行 清 洁 卫 生 ， 对 培 养 空 间 定 期 进 行 消 毒处 理 ， 及 时 清 除 污 染 材 料 ， 转 移 继 代 材 料 。 4、 培 养 基 的 污 染 与 控 制 。原 因 ： 培 养 基 中 的 细 菌 特 别 是 内 源 菌 污 染 是 培 养 基 污 染 的 重 要 原因 之 一 。控 制 方 法 ： 在 培 养 基 中 加 入 抑 菌 剂 ， 较 理 想 的 抑 菌 剂 是 2 mg/L的庆 大 霉 素 和 0.3 的 丙 酸 钠 。高 压 灭 菌 锅 故 障 造 成 高 压 灭 菌 不 彻 底 ， 会 造 成 大 规 模 的 污 染 二、初代培养外植体的褐变及控制 褐变是组织培养过程中最常见的现象，被列为植物组织培养的三大难题之一，主要发生在初代培养阶段。外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。 固体培养中，发生褐变与未发生褐变的比较 （ 一 ） 褐 变 的 主 要 原 因1 植 物 品 种 ：（ 1） 植 物 种 类 与 品 种 不 同 ， 即 基 因 型 不 同 ， 其 褐 化 的 难 易 不 同 。（ 2） 植 体 体 内 的 单 宁 类 、 色 素 类 、 多 种 羟 酚 类 化 合 物 的 含 量 高 ，则 容 易 导 致 褐 化 。 （ 3） 一 般 木 本 较 草 本 的 易 褐 化 ， 多 年 生 的 较 一 年 生 的 易 褐 化 。 *核 桃 的 单 宁 含 量 很 高 ， 组 织 培 养 难 度 大 ； 即 使 形 成 愈 伤 组 织 ，还 会 因 为 褐 化 而 死 亡 ；*在 红 豆 杉 愈 伤 组 织 的 细 胞 培 养 过 程 中 ， 由 于 多 酚 氧 化 酶 被 氧 化为 醌 类 物 质 ， 这 些 醌 类 物 质 呈 现 红 褐 色 ， 能 抑 制 很 多 代 谢 酶 的 活 性 ，产 生 褐 化 现 象 ， 影 响 了 植 物 组 织 的 正 常 生 长 ， 甚 至 死 亡 。 2 生 理 状 态 ： 通 常 植 物 体 幼 龄 部 位 采 取 的 外 植 体 褐 化 较 轻 ， 而 老 龄 部位 采 取 的 外 植 体 褐 化 较 重 ， 幼 龄 外 植 体 材 料 褐 变 较 轻 与 其 酚类 化 合 物 含 量 少 有 关 。 一 般 来 说 ,随 着 年 龄 和 组 织 木 质 化 程度 增 加 而 褐 变 加 强 ;外 植 体 受 伤 程 度 也 影 响 褐 变 。 3 培 养 基 成 分 培 养 基 中 浓 度 过 高 的 无 机 盐 会 使 某 些 观 赏 植 物 的 褐 变 程 度增 加 ， 此 外 ， 细 胞 分 裂 素 的 水 平 过 高 4 培 养 条 件 不 当 如 果 光 照 过 强 、 温 度 过 高 、 培 养 时 间 过 长 等 ， 均 可 使 多 酚氧 化 酶 的 活 性 提 高 ， 从 而 加 速 被 培 养 的 外 植 体 的 褐 变 程 度 。 （ 二 ） 褐 变 的 控 制 为 了 提 高 组 织 培 养 的 成 苗 率 ， 必 须 对 外 植 体 的 褐 变 现象 加 以 控 制 ， 以 减 轻 褐 变 现 象 的 发 生 。1 选 择 合 适 的 外 植 体 对 于 某 一 特 定 的 快 速 繁 殖 对 象 ， 一 般 来 说 ， 最 好 选 择生 长 处 于 旺 盛 的 外 植 体 ， 可 以 使 褐 变 现 象 明 显 减 轻 。 2 培 养 条 件 ：（ 1） 一 般 液 体 培 养 基 上 加 滤 纸 桥 和 半 固 体 培 养 基 能 减 轻 褐化 。（ 2） 低 盐 培 养 基 尤 其 是 Mn2+、 Cu2+ 浓 度 降 低 能 减 轻 褐 化 。（ 3） 部 分 细 胞 分 裂 素 如 BA、 KT等 能 促 进 酚 类 化 合 物 的 合 成 ，刺 激 多 酚 氧 化 酶 的 活 性 ， 因 此 降 低 BA、 KT的 用 量 能 减 轻 褐 化 。 （ 4） 利 用 2,4-D和 IAA可 延 缓 多 酚 合 成 ， 减 轻 褐 化 的 产 生 ，但 外 植 体 在 高 浓 度 的 2,4-D下 培 养 时 间 过 长 ， 愈 伤 组 织 变 得松 软 、 呈 水 渍 状 ， 失 去 分 化 能 力 。 （ 5） 降 低 培 养 基 中 的 pH值 控 制 酚 氧 化 酶 活 性 和 底 物 利 用 率 ，因 为 这 种 酶 在 pH=6.5时 活 性 最 强 。 （ 6） 改 变 氧 化 -还 原 势 常 用 的 还 原 剂 有 维 生 素 C、 柠 檬 酸 、巯 基 乙 醇 、 谷 胱 甘 肽 、 二 硫 苏 糖 醇 、 半 胱 氨 酸 等 。 使 用 方 法可 以 在 外 植 体 材 料 消 毒 前 快 速 浸 入 其 中 30秒 60秒 ， 浸 泡 时间 不 可 过 长 ， 否 则 外 植 体 褐 变 会 更 加 严 重 ， 因 为 抗 氧 化 剂 对外 植 体 有 一 定 毒 害 作 用 ； 或 用 它 们 浸 湿 滤 纸 并 在 其 上 进 行 外植 体 的 切 割 。 （ 7） 利 用 吸 附 剂 减 低 或 清 除 酚 类 产 物 ， 如 2 3克 /L的 活 性碳 能 吸 收 某 些 酚 类 产 物 ， 5 20克 /L的 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 （ PVP）能 稳 定 单 宁 。 但 吸 附 剂 在 吸 附 有 毒 酚 类 的 同 时 ， 也 要 吸 附 培养 基 中 的 生 长 调 节 剂 。 （ 8） 抑 制 酚 氧 化 酶 的 活 性 ， 常 见 的 是 利 用 鳌 合 剂 鳌 合 铜 离子 降 低 褐 化 ， 如 乙 二 胺 四 乙 酸 （ EDTA） 、 二 乙 基 二 硫 代 氨 基甲 酸 脂 、 二 甲 基 二 硫 代 氨 基 甲 酸 脂 等 。 。 （ 9） 热 激 处 理 。 利 用 多 酚 氧 化 酶 是 一 种 不 耐 热 的 酶 ， 在 45 50 以 上 活 性 迅 速 下 降 的 特 点 ， 将 外 植 体 在 45 50 高 温 预 处理 45分 钟 后 再 接 种 ， 有 效 地 降 低 褐 化 。（ 10） 改 变 糖 的 用 量 和 种 类 。 降 低 培 养 基 中 蔗 糖 的 浓 度 至 1%可 减轻 褐 化 ， 同 时 若 有 些 植 物 的 外 植 体 在 蔗 糖 中 褐 化 严 重 ， 可 用 葡 萄糖 或 山 梨 糖 代 替 以 减 轻 褐 化 。 3 连 续 转 移 培 养 对 容 易 褐 变 的 材 料 可 间 隔 12 24小 时 的 培 养 后 ， 再 转移 到 新 的 培 养 基 上 ， 经 过 连 续 处 理 7 10天 后 ， 褐 变 现 象 便会 得 到 控 制 或 大 为 减 轻 。 三 、 继 代 培 养 中 的 玻 璃 化 现 象 及 控 制（ 一 ） 玻 璃 化 现 象 的 特 点 进 行 离 体 繁 殖 时 ， 有 些 培 养 物 的 嫩 茎 、 叶 片 往 往 会 呈 半透 明 水 迹 状 ， 这 种 现 象 通 常 称 为 玻 璃 化 。 它 的 出 现 会 使 试 管苗 生 长 缓 慢 、 繁 殖 系 数 有 所 下 降 。 出 现 玻 璃 化 的 嫩 茎 不 宜 诱导 生 根 ， 因 此 ， 使 繁 殖 系 数 大 为 降 低 。 大叶冬青 白三七 （ 二 ） 玻 璃 化 现 象 产 生 的 原 因 及 控 制 玻 璃 化 现 象 的 产 生 主 要 是 由 于 培 养 容 器 中 空 气 湿 度 过 高 ，透 气 性 较 差 造 成 的 。 常 通 过 以 下 措 施 加 以 控 制 。1 优 先 培 养 的 种 类 （ 或 品 种 ） 和 外 植 体 :事 先 通 过 预 备 实 验 ， 确定 用 于 组 织 培 养 的 种 类 或 品 种 ， 并 进 一 步 选 择 合 适 的 外 植 体 。 对容 易 发 生 玻 璃 化 的 种 类 或 品 种 ， 要 尽 量 减 少 在 水 中 的 浸 泡 时 间 ，做 到 随 洗 随 灭 ， 漂 洗 后 立 即 接 种 。 2 琼 脂 的 调 节 :适 当 提 高 琼 脂 浓 度 ， 其 浓 度 不 低 于 0.8%， 尤其 是 在 高 温 季 节 ， 更 应 使 用 高 纯 度 的 、 固 化 程 度 好 的 琼 脂 。3 碳 源 的 调 节 :增 加 蔗 糖 用 量 ， 避 免 采 用 葡 萄 糖 作 碳 源 。 4 激 素 调 节 :适 当 降 低 细 胞 分 裂 素 BA的 用 量 ， 可 将 BA改 为 2-ip等 其 它 类 型 的 激 素 或 进 行 交 替 使 用 。 在 继 代 培 养 中 ， 采 用附 加 不 同 种 类 和 浓 度 的 激 素 如 KT， IBA等 的 培 养 基 。 5 湿 度 调 节 。 采 用 通 气 性 好 的 封 口 材 料 如 纱 布 、 脱 脂 棉 、滤 纸 、 牛 皮 纸 、 带 有 透 气 孔 的 薄 膜 等 。6 温 度 调 节 。 注 意 避 免 培 养 温 度 的 突 然 升 高 以 及 避 免 变 温培 养 。 另 外 适 宜 温 度 的 热 击 也 可 以 消 除 玻 璃 苗 ， 其 原 因 可 能是 热 击 可 以 降 低 内 源 细 胞 分 裂 素 的 水 平 。7 光 照 调 节 。 一 般 情 况 下 光 照 10 12小 时 ， 光 强 15002000Lux时 就 能 够 满 足 大 多 数 植 物 的 正 常 生 长 和 分 化 。 8 改 变 供 氮 形 式 。 适 当 减 少 铵 态 氮 的 量 而 提 高 硝 态 氮 的 量 ， 同 时提 高 培 养 基 中 的 碳 氮 比 均 可 减 少 玻 璃 化 的 比 例 。 及 时 转 接 ， 以 免 氨积 累 。9 氯 离 子 调 节 。 适 当 降 低 培 养 基 中 的 氯 离 子 浓 度 ， 有 利 于 减 轻 玻璃 化 的 产 生 。 10 尽 量 减 少 创 伤 乙 烯 产 生 。 在 继 代 过 程 中 ， 严 格 选 择 生 长 正 常 、健 壮 的 茎 尖 作 为 继 代 培 养 的 材 料 。 加 快 切 割 速 度 ， 控 制 接 种 密 度 ，尽 量 减 少 创 伤 乙 烯 产 生 ， 并 防 止 乙 烯 过 剩 而 导 致 玻 璃 苗 的 形 成 。11 在 培 养 基 中 可 附 加 聚 乙 烯 醇 (PVA)、 活 性 炭 及 青 霉 素 G钾 等 ， 也可 降 低 玻 璃 苗 的 产 生 。 四、离体快速繁殖的遗传变异及控制 遗传变异在植物的离体快速繁殖中普遍存在，但它又影响快速繁殖的效果。了解遗传变异的发生和控制方法，对快速繁殖有重要的意义。（一）外源激素对性状的影响 一般来说，外源激素在离体快速繁殖过程中容易引起植物性状的变化，因此，原则上尽可能地避免使用外源激素。 (二 ) 继 代 次 数 对 性 状 的 影 响 当 初 代 培 养 的 试 管 苗 在 瓶 内 长 满 到 瓶 塞 ， 或 培 养 基养 分 利 用 完 时 就 要 转 瓶 -继 代 培 养 。 在 此 过 程 中 会 产 生 两种 现 象 ， 即 驯 化 现 象 和 衰 退 现 象 。驯 化 现 象 ： 开 始 继 代 培 养 培 养 的 材 料 ， 需 要 加 入 生 长 调 节 物质 ， 其 后 加 入 少 量 或 不 加 入 就 可 以 生 长 的 现 象 。 驯 化 现 象1、 概 念 ： 植 物 在 开 始 进 行 继 代 培 养 时 需 要 加 入 生 长 调 节 物 质 ，但 随 着 继 代 次 数 的 增 加 ， 少 量 加 入 或 不 加 生 长 调 节 物 质 就 能 生 长的 现 象 。 2、 原 因 ： 在 继 代 培 养 中 生 长 调 节 物 质 积 累 。3、 缺 点 ： （ 如 卡 德 利 亚 兰 实 生 苗 在 长 期 加 香 蕉 的 培 养 基 中 继 代 ）（ 1） 只 长 芽 不 长 根 ， 芽 多 而 细 弱 （ 补 加 IAA， 几 次 继 代 后 又 会 长出 根 ） 。（ 2） 发 生 变 异 . 衰 退 现 象 ： 长 期 继 代 培 养 的 材 料 也 会 逐 渐 衰 退 ， 丧 失 形 态 发 生能 力 ， 具 体 表 现 在 生 长 不 良 ， 再 生 能 力 和 增 殖 率 下 降 等 。 研 究 结 果 表 明 ， 继 代 次 数 越 多 ， 植 物 发 生 变 异 的 概 率 就 会 越大 ， 特 别 是 在 增 殖 过 程 中 ， 需 要 添 加 外 源 激 素 的 植 物 。 因 此 ，无 菌 培 养 物 要 定 期 更 换 ， 同 时 ， 增 殖 培 养 时 ， 尽 可 能 减 少 继 代次 数 。 衰 退 现 象1、 概 念 ： 植 物 长 期 进 行 继 代 培 养 后 ， 生 活 能 力 、 形 态 发 生 能 力 、再 生 能 力 都 会 下 降 的 现 象 。2、 原 因 ： 不 详 ， 但 与 下 列 因 素 有 关(1)植 物 种 类 的 差 异 ， 同 一 植 株 不 同 器 官 的 差 异 。3、 繁 殖 能 力 的 差 异 （ 一 般 )是 ： 草 本 植 物 木 本 植 物 ； 被 子 植 物 裸 子 植 物 ； 年 幼 材 料 年 老 材 料 ； 胚 营 养 体 组 织 ； 芽 胚 状 体 愈 伤 组 织 ； （ 2） 培 养 基 和 培 养 条 件 影 响 。 由 于 培 养 基 和 培 养 条 件 是 否 适 当 对 继 代 培 养 的 影 响 很 大 ； 所以 常 常 改 变 培 养 基 和 培 养 条 件 来 保 持 继 代 培 养 ； 例 ： 桃 茎 尖 在 MS中 ， 初 代 培 养 良 好 ， 继 代 后 生 长 不 良 ； 转 入 低氨 态 氮 、 低 钙 ， 增 加 硝 态 氮 、 Mg+、 P培 养 基 中 则 能 继 代 ； 石 斛 茎 尖 或 腋 芽 培 养 ， 在 固 体 培 养 基 中 形 成 原 球 茎 后 ， 继 代培 养 需 要 液 体 培 养 基 进 行 振 荡 培 养 ； （ 3） 、 继 代 培 养 次 数 增 加 继 代 次 数 对 繁 殖 率 的 影 响 因 培 养 材 料 而 异 ； 葡 萄 、 黑 穗 醋 栗 、 月 季 、 倒 挂 金 钟 等 长 期 继 代 仍 能 保 持 原 来的 再 生 能 力 和 繁 殖 率 ；香 蕉 不 定 芽 的 变 异 频 率 ： 继 代 5次 ： 2.14%； 继 代 10次 ： 4.2%； 继 代 20次 ： 100%； 因 此 ， 香 蕉 继 代 培 养 不 能 超 过 1年 ； 蝴 蝶 兰 ： 连 续 培 养 4年 后 ，植 株 退 化 不 能 开 花 ； （ 4） 、 季 节 水 仙 鳞 茎 ： 6、 7月 份 休 眠 ， 生 长 变 慢 ； 8月 休 眠 后 ， 生 长 加 快 ； 百 合 鳞 片 的 分 化 能 力 ： 春 季 秋 季 夏 季 冬 季 （三）无菌培养体系增殖方式的影响 一般来说，离体快速繁殖是在保证遗传稳定性的前提下，实现较短的时间繁殖出较多的植株。而增殖方式对遗传变异的影响较大，因此，在离体快速繁殖过程中，无菌培养体系的增殖方式首选茎芽增殖，其次是不定芽增殖，不宜选择愈伤组织增殖方式。