人卫8版-DNA的生物合成

目录 生物化学与分子生物学 目录 第十四章 DNA的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ) 目录 复制 (replication) 是以 DNA为模板的 DNA 合成，是基因组的复制过程。在这个过程中， 亲代 DNA作为合成模板，按照碱基配对原则 合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸 聚合反应。 复制 亲代 DNA 子代 DNA 目录 本章主要内容： DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物 DNA复制过程 真核生物 DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式 DNA复制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication 第 一 节 目录 半保留复制 (semi-conservative replication) 双向复制 (bidirectional replication) 半不连续复制 (semi-discontinuous replication) DNA复制的主要特征 目录 一、 DNA以半保留方式进行复制 DNA生物合成时 ， 母链 DNA解开为两 股单链 ， 各自作为模板 (template)按碱基配 对规律 ， 合成与模板互补的子链 。 子代细 胞的 DNA， 一股单链从亲代完整地接受过 来 ， 另一股单链则完全从新合成 。 两个子 细胞的 DNA都和亲代 DNA碱基序列一致 。 这种复制方式称为 半保留复制 。 半保留复制 的概念 : 目录 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 : 全保留式 半保留式 混合式 密度梯度实验 : 实验结果支持 半保留复制 的设想。 含 15N-DNA的细菌 培养于普 通培养液 第一代 继续培养于 普通培养液 第二代 梯度离心结果 目录 按半保留复制方式 ， 子代 DNA与亲代 DNA 的 碱基序列一致 ， 即子代保留了亲代的全部遗 传信息 ， 体现了遗传的 保守性 。 半保留复制的意义 : 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但 不是绝对的 。 目录 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母链 DNA 复制过程中形成 的复制叉 子代 DNA 目录 原核生物基因组是环状 DNA， 只有一个 复制起 点 （ origin） 。 复制从起点开始 ， 向两个方向 进行解链 ， 进行的是单点起始 双向复制 。 二、 DNA复制从起点向两个方向延伸 复制中的放射自显影图象 A. 环状双链 DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点 (termination, ter) ori ter A B C 目录 真核生物每个染色体有多个起始点 ， 是多复 制子的复制 。 习惯上把两个相邻起始点之间 的距离定为一个 复制子 (replicon) 。 复制子是 独立完成复制的功能单位 。 5 3 ori ori ori ori 5 3 5 3 ori ori ori ori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制 3 目录 三、 DNA复制反应呈半不连续特征 3 5 3 5 解链方向 领头链 (leading strand) 后随链 (lagging strand) 目录 顺着解链方向生成的子链 ， 复制是连续进行的 ， 这股链称为 领头链 (leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反 ， 不 能顺着解链方向连续延长 ， 这股不连续复制的 链称为 后随链 (lagging strand) 。 复制中的不连 续片段称为 岡崎片段 (okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制 ， 就是复 制的半不连续性 。 目录 DNA复制的酶学和拓扑学变化 第 二 节 The Enzymology and Topology of DNA Replication 目录 参与 DNA复制的物质 : 底物 (substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶 (polymerase): 依赖 DNA的 DNA聚合酶 ， 简写为 DNA-pol； 模板 (template): 解开成单链的 DNA母链； 引物 (primer): 提供 3-OH末端使 dNTP可以依次 聚合； 其他的 酶和蛋白质因子 。 目录 (dNMP)n + dNTP (dNMP) n+1 + PPi RNA引物 RNA引物 子代 DNA 目录 聚合反应的特点 : DNA 新链生成需 RNA引物 和 模板 ； 新链的延长只可沿 5 3方向进行 。 目录 一、 DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称： 依赖 DNA的 DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称： DNA-pol 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 : 5 3外切酶活性 : ? 能切除突变的 DNA片段。 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性 : 目录 （一）原核生物有 3种 DNA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录 原核生物的 DNA聚合酶 可能不可能可能基因突变后的致死性 无无有5 3 核酸外切酶活性 20？400分子数 / 细胞 多亚基不对称 二聚体 ？单肽链组成 250120109分子量 ( kD ) DN A - pol II IDN A - pol IIDN A - pol I 无无有 ？ ？ 目录 个核心酶 1个 -复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚 基） 1对 -亚基（可滑动 的 DNA夹子） DNA聚合酶 全酶结构 全酶结构包括： 目录 亚基 （ 130 000）主要功能是合成 DNA 亚基 具有 35外切酶活性（复制保真性 所必需） 亚基可增强其活性 亚基 可能起组装作用 核心酶由 、 和 亚基组成： 两侧的 亚基发挥夹稳 DNA模板链，并使酶沿模 板滑动的作用 目录 2个 -亚基 分别和 1个核心酶相互作用 ， 其 柔性连接区可以确保在复制叉 1个全酶分子的 2个核心酶能够相对独立运动 ， 分别负责合成 前导链和后随链 。 功能： 有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用 -复合物由 6种亚基组成： 、 、 、 、 、 目录 功能： DNA-pol （ 109kD） 对复制中的错误进行校读，对复制和修复 中出现的空隙进行填补。 目录 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 /Klenow 片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N 端 C 端 木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是实验室合成 DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。 目录 DNA-pol （ 120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生 损伤的 DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因 此认为，它参与 DNA损伤的应急状态修复。 目录 （二）常见的真核细胞 DNA聚合酶有 5种 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 参与低保真度的复制 。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。 在线粒体 DNA复制中起催化作用。 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录 真核生物和原核生物 DNA聚合酶的比较 E.Coli 真核细胞 功能 填补复制中的 DNA空隙， DNA修复和重组 复制中的校对， DNA修复 DNA修复 线粒体 DNA合成 前导链合成 DnaG 引物酶 后随链合成 目录 真核生物的 DNA聚合酶 填补引物 空隙，切 除修复， 重组 延长子 链的主 要酶， 解螺旋 酶活性 线粒体 DN A 复 制 低保 真度 的复 制 起始引 发，引 物酶活 性 功能 +- 3 5 核酸外切 酶活性 高高高？中5 3 聚合活性 25.512.514.04.016.5分子量（ kD ） DN A - pol 复 制 制性 高高高？中 ） 目录 二、 DNA聚合酶的碱基选择和校对功 能实现复制的保真性 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能 准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。 目录 遵守严格的碱基配对规律； 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时有即时校对功能。 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制： 目录 （一）复制的保真性依赖正确的碱基选择 利用“错配”实验发现， DNA pol 对核苷酸的 参入（ incorporation）具有选择功能。 DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力， 因此实现其选择功能。 目录 （二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨 认切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶 (exonuclease)是指能从核酸链的 末端把核苷酸依次水解出来的酶 ， 外切酶是 有方向性的 。 目录 A： DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活 性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。 DNA pol 的校读功能 目录 三、复制中的解链伴有 DNA 分子 拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。 目录 （一）多种酶参与 DNA解链和稳定单链状态 理顺 DN A 链拓扑异构酶 ( gyrA , B) 稳定已解开的单链单链 DN A 结合蛋白 SSB 催化 RN A 引物生成引物酶D naG ( dna G ) 运送和协同 Dna BD naC ( dna C ) 解开 DN A 双链解螺旋酶D naB ( dna B ) 辨认起始点D naA ( dna A ) 蛋白质（基因） 通用名 功能 原核生物复制起始的相关蛋白质 目录 E. Coli 基因图 目录 解螺旋酶 (helicase) 利用 ATP供能，作用于 氢键，使 DNA双链解开成为两条单链。 引物酶 (primase) 复制起始时催化生成 RNA 引物的酶。 单链 DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状 态并保护单链的完整 。 目录 10 8 局部解链后 （二） DNA拓扑异构酶改变 DNA超螺旋状态 复制过程正超螺旋的形成： 目录 解链过程中正超螺旋的形成 目录 既能水解 、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶 拓扑异构酶 拓扑异构酶分类： 拓扑异构酶作用特点： 目录 拓扑异 构酶 切断 DNA双链中 一股 链，使 DNA 解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口， DNA变为松弛状态 。 反应 不需 ATP。 拓扑异 构酶 切断 DNA分子 两股 链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用 ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。 作用机制： 目录 拓扑酶的作用方式： 目录 四、 DNA连接酶连接复制中产生的 单链缺口 连接 DNA链 3-OH末端和相邻 DNA链 5-P 末端 ， 使二者生成磷酸二酯键 ， 从而把两段相 邻的 DNA链连接成一条完整的链 。 DNA连接酶 (DNA ligase)作用方式： P O O- O- O HO 5 P O O- O- O 3 3 5 DNA连接酶 ATP ADP 5 3 5 3 DNA连接酶的作用： 目录 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的 作用 。 在 DNA修复 、 重组及剪接中也起缝合缺 口作用 。 也是基因工程的重要工具酶之一 。 功能： 目录 提供核糖 3-OH 提供 5-P 结果 DNA聚合酶 引物或延长中的 新链 游离 dNTP 去 PPi (dNTP)n+1 连接酶 复制中不连续的两条单链 不连续 连续链 拓扑酶 切断、整理后的两链 改变拓扑状态 DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化 3,5-磷酸二酯键生成的比较 目录 原核生物 DNA复制过程 The Process of DNA Replication in Prokaryotes 第 三 节 目录 起始是复制中较为复杂的环节，在此过程 中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引 发体，形成复制叉并合成 RNA引物。 需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。 2. 形成引发体，合成引物，提供 3-OH末端。 一、 复制的起始 目录 E.coli复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA- -TTATACACA- -TTTGGATAA- -TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列 5 3 5 3 （一） DNA的解链 目录 原核生物的复制起始部位及解链 目录 目录 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶 SSB 3 5 3 5 （二）引物合成和引发体形成 含有解螺旋酶、 DnaC蛋白、引物酶和 DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。 目录 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链 RNA分子。 引物 目录 引发体和复制叉的生成 目录 目录 二、 DNA链的延长 复制的延长指在 DNA-pol催化下 ， dNTP以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上 ， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 。 5 3 5 dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTP dATP dCTP OH 3 3 DNA-pol 目录 领头链的合成： 领头链的子链沿着 53 方向可以连续地延长。 后随链的合成 目录 在复制叉同时合成前导链和后随链 复 制 过 程 简 图 目录 目录 原核生物基因是环状 DNA，双向复制的复制片段 在复制的终止点 (ter)处汇合。 ori ter E.coli 82 32 ori ter SV40 50 0 三、复制的终止 目录 5 5 5 RNA酶 OH P 5 DNA-pol dNTP 5 5 P ATP ADP+Pi 5 5 DNA连接酶 子链中的 RNA引物被取代 目录 目录 目录 真核生物 DNA生物合成 过程 The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes 第 四 节 目录 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉 前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生 DNA聚 合酶 /转换； 切除冈崎片段 RNA引物的是核酸酶 RNAse H 和 FEN1等。 真核生物与原核生物 DNA复制的差异： 目录 哺乳动物的 细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 细胞能否分裂 ， 决定于进入 S期及 M期这两个关 键点 。 G1S 及 G2M 的调节 ， 与蛋白激酶活 性有关 。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子 而实施调控作用 。 目录 真核生物每个染色体有多个起始点 ， 是多复制 子复制 。 复制有时序性 ， 即复制子以分组方式 激活而不是同步起动 。 复制的起始需要 DNA-pol （ 引物酶活性 ） 和 pol （ 解螺旋酶活性 ） 参与 。 还需拓扑酶和复 制因子 (replication factor, RF)。 一、真核生物复制的起始与原核基本相似 目录 酵母复制起点为 自主复制序列（ autonomously replicating sequences， ARS） ： 酵母染色体含有多个复制起点。 元件 A(富含 A/T的共有序列 )：结合一个特异的蛋白质 复合物 复制起点识别复合物 (ORC)。 3个序列 (B1、 B2和 B3)可以增加复制起点的效率，其 中 B2的 9个碱基与上述 ARS共有序列相同。 酵母复制起始点 目录 增 殖 细 胞 核 抗 原 （ proliferation cell nuclear antigen， PCNA） 在复制起始和延长中起关键作 用 。 PCNA为同源三聚体 ， 具有与 E.coli DNA 聚 合酶 的 亚基相同的功能和相似的构象 ， 即形 成闭合环形的可滑动 DNA夹子 ， 在 RFC的作用下 PCNA结合于引物模板链；并且 PCNA使 pol获 得持续合成能力 。 PCNA水平也是检验细胞增殖 的重要指标 。 目录 拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正 超螺旋 Tol 和 Tol DNA双螺旋解链，参与组装引发体 DNA解旋酶 连接冈崎片段 DNA连接酶 核酸酶，切除 RNA引物 RNAse H 核酸酶，切除 RNA引物 FEN1 DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 Pol / 合成 RNA-DNA引物 Pol /引发酶 有依赖 DNA的 ATPase活性，结合于引物 -模板链，激活 DNA聚合酶， 促使 PCNA结合于引物 -模板链 RFC 激活 DNA聚合酶和 RFC的 ATPase活性 PCNA 单链 DNA结合蛋白，激活 DNA聚合酶，使解旋酶容易结合 DNA RPA 功 能 蛋白质 真核 DNA复制叉主要蛋白质的功能 目录 DNA-pol 和 pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活 性 。 在复制叉及引物生成后 ， DNA-pol 通过 PCNA的协同作用 ， 逐步取代 pol ， 在 RNA引物 的 3-OH基础上连续合成领头链 。 随从链引物也 由 pol 催化合成 。 然后由 PCNA协同 ， pol 臵换 pol ， 继续合成 DNA子链 。 二、真核生物复制的延长发生 DNA 聚合酶 /转换 目录 前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生 DNA聚合酶 /转换的原因是 Pol 不具备 持续合成能力 。 DNA聚合酶 /转换的 关键蛋白是 RFC。 DNA聚合酶 /转换 目录 真核 DNA聚 合酶转换和 后随链合成 目录 3 5 5 3 领头链 3 5 3 5 亲代 DNA 后随链 引物 核小体 三、真核生物 DNA合成后立即组装成核小体 目录 染色体 DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端 DNA子链上最后复制的 RNA引物， 去除后留下空隙。 四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题 目录 切除引物的两种机制 目录 前导链 产生 完整 的子染色单体。 后随链 3端留下 缩短的 未复制的 ssDNA区 。 5 3 3 5 5 3 3 5 + 5 3 3 3 3 5 5 目录 端粒（ telomeres） 由富含 TG的重复序列组成。 人的端粒重复序列为 5-(TnGn)x-3。 这些重复序列多为双链，但每个染色体的 3端比 5端长，形成单链 ssDNA。这一特殊结构可解决 染色体末端复制问题。 目录 端粒酶 (telomerase) 端粒酶 RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成： 目录 端粒酶（ telomerase） 是一种核糖核蛋白（ RNP）， 由 RNA和蛋白质组成。 端粒酶以自己的 RNA组分作为模板，以染色体的 3 端 ssDNA（后随链模板） 为引物，将端粒序列添加 于染色体的 3端。这些新合成的 DNA为单链 。 目录 端粒酶催化作用的爬行模型 目录 真核所有染色体 DNA复制仅仅出现在细胞 周期的 S期 ，而且只能复制一次。 五、真核生物染色体 DNA在每个细胞周 期中只能复制一次 目录 前复制复合物在 G1期形成而在 S期被激活 真核细胞 DNA复制的起始分两步进行，即 复 制基因的选择 和 复制起点的激活。 复制基因（ replicator） 是指 DNA复制起始 所 必需的 全部 DNA序列 。 目录 复制基因的选择 出现于 G1期 ，基因组的每个复 制基因位点均组装 前复制复合物（ pre- replicative complex， pre-RC） 。 复制起点的激活 出现于细胞进入 S期 以后，这一 阶段将 激活 pre-RC，募集若干复制基因结合蛋 白和 DNA聚合酶，并起始 DNA解旋。 在原核细胞中，复制基因的识别与 DNA解 旋、募集 DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞 中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在 每个细胞周期中仅复制一次。 目录 ORC至少募集两种解旋酶加载 蛋白 Cdc6和 Cdt1。 复制起点识别复合物（ origin recognition complex， ORC） 识别并结合复制基因。 三种蛋白质一起募集真核细胞 解旋酶 Mcm2-7。 前复制复合物（ pre-RC）的形成 目录 pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其它复制因子 并起始复制，复制因子包括 3种 DNA聚合酶。 DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先 Pol 和 Pol 结合，然后是 Pol /引发酶。 在 S期 ， pre-RC被蛋白激酶（ Ddk和 Cdk）磷 酸化，从而被激活。 目录 pre-RC的激活 和组装真核 DNA复制叉 目录 （ 1）激活 pre-RC，以起始 DNA复制； （ 2）抑制形成新的 pre-RC。 CDK控制 pre-RC的形成和激活 真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激 酶 （ cyclin-dependent kinases， CDK） 严格控制 pre-RC的形成和激活 。 Cdk功能： 目录 在每个细胞周期过程中 ， 仅有一次机会形成 pre-RC， 也仅有一次机会激活 pre-RC。 pre-RC在被激活后即解体 ， 所暴露的复制基 因可形成新的 pre-RC并迅速结合 ORC。 但在 S、 G2和 M期 ， 高活性的 Cdk抑制 pre-RC的其它组分 结合 ORC。 只有当染色体分离和细胞分裂完成时 ， Cdk的活性消失 ， 新的 pre-RC才能形成 。 目录 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways 第五节 目录 双链 DNA是大多数生物的遗传物质 。 某些 病毒的遗传物质是 RNA。 原核生物的质粒 ， 真核生物的线粒体 DNA， 都是染色体外 存在的 DNA。 这些非染色体基因组 ， 采用 特殊的方式进行复制 。 目录 逆转录酶 (reverse transcriptase) 逆转录 (reverse transcription) 逆转录 酶 一、逆转录病毒的基因组 RNA以逆 转录机制复制 RNA DNA 目录 逆转录病毒细胞内的逆转录现象 : RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链 DNA 逆转录酶 双链 DNA 目录 RNA病毒在细胞内复制成双链 DNA的 前病毒 (provirus)。 前病毒保留了 RNA病毒全部遗传信 息 ， 并可在细胞内独立繁殖 。 在某些情况下 ， 前 病毒基因组通过 基因重组 (recombination)， 参加 到细胞基因组内 ， 并随宿主基因一起复制和表达 。 这种重组方式称为 整合 (integration)。 前病毒 独立繁殖或整合 ， 都可成为致病的原因 。 目录 逆转录酶催化的 cDNA合成 目录 分子生物学研究可应用逆 转录酶，作为获取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法 称为 cDNA法。 以 mRNA为模板，经逆转 录合成的与 mRNA碱基序列互 补的 DNA链。 试管内合成 cDNA: cDNA complementary DNA 逆转录酶 A AA A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 目录 二、逆转录的发现发展了中心法则 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究 中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物， RNA同 样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了 20世纪初已注 意到的病毒致癌理论。 目录 三、真核生物线粒体 DNA按 D环方式复制 目录 dNTP DNA-pol D环复制 (D-loop replication) 是线粒体 DNA (mitochondrial DNA， mtDNA) 的复制形式。 三、真核生物线粒体 DNA按 D环方式复制 目录 D-环复制时需合成引物 。 mtDNA为双链 ， 第一 个引物以内环为模板延伸 。 至第二个复制起始点 时 ， 又合成另一个反向引物 ， 以外环为模板进行 反向的延伸 。 最后完成两个双链环状 DNA的复 制 。 复制中呈字母 D形状而得名 。 D环复制的特点是复制起始点不在双链 DNA同一 位点 ， 内 、 外环复制有时序差别 。