酶联免疫吸附双抗体夹心法

酶联 免疫吸附双 抗体夹 心法 测 定血清 中甲胎蛋白含量 Your company slogan LOGO一、实 验 目的 1 掌握酶联 免疫吸附实 验 （ELISA）的原理2 熟悉酶联 免疫吸附实 验 的操作方法 Your company slogan LOGO二 、 实 验 原 理1971年 瑞 典 学 者 Engvail和 Perlmann,荷 兰 学 者Van Weerman和 Schuurs分 别 报 道 将 免 疫 技 术 发展 为 检 测 体 液 中 微 量 物 质 的 固 相 免 疫 测 定 方 法 ，即 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。 ELISA现 在已 成 为 目 前 分 析 化 学 领 域 中 的 前 沿 课 题 ， 它 是一 种 特 殊 的 试 剂 分 析 方 法 ， 是 在 免 疫 酶 技 术( immunoenzymatic techniques ) 的 基 础 上发 展 起 来 的 一 种 新 型 的 免 疫 测 定 技 术 。 Your company slogan LOGO Your company slogan LOGOELISA的 三 条 基 本 原 理 Your company slogan LOGO双 抗 体 夹 心 法 Your company slogan LOGO双 抗 体 夹 心 法 图 示双 抗 体 夹 心 法 测 抗 原+ - E E EE E E E E E Your company slogan LOGO三 、 实 验 仪 器 &试 剂v仪 器 全 自 动 酶 标 仪 、 全 自 动 酶 标 洗 板 机 Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO四 、 实 验 步 骤获 得 AFP未 标 定 抗 体 将 AFP抗 体 与 固 相载 体 连 接 形 成 固 相 抗 体 洗 涤 除 去 未 结 合 的抗 体 及 杂 质 加 入 封 闭 蛋 白 溶 液 以 封 闭 载 体表 面 残 留 的 蛋 白 结 合 位 点 洗 涤 并 除 去 未 结 合 的 封 闭 蛋 白 加 血 清 形 成固 相 抗 体 抗 原 复 合 物 Your company slogan LOGO洗 涤 除 去 其 他未 结 合 的 物 质 加 HRP酶 标 抗 体 生 成抗 体 待 测 抗 原 酶 标 记 抗 体的 复 合 物 彻 底 洗 涤 未 结 合 的 HRP酶 标 抗 体 加 底 物 四 甲 基 联 苯 胺 (TMB)进 行 酶 催 化 反 应 根 据 颜 色 反 应 的 程 度进 行 AFP的 定 量 测 定 Your company slogan LOGO详 细 步 骤1. 标 准 品 的 稀 释 与 加 样 ： 在 酶 标 包 被 板 上 设 标 准 品 孔 10 孔 ， 在 第 一 、 第二 孔 中 分 别 加 标 准 品 100 l， 然 后 在 第 一 、 第 二 孔 中 加 标 准 品 稀 释 液 50 l， 混 匀 ； 然 后 从 第 一 孔 、 第 二 孔 中 各 取 100 l 分 别 加 到 第 三 孔 和 第 四 孔 ，再 在 第 三 、 第 四 孔 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50 l， 混 匀 ； 然 后 在 第 三 孔 和 第 四孔 中 先 各 取 50 l 弃 掉 ， 再 各 取 50 l 分 别 加 到 第 五 、 第 六 孔 中 ， 再 在 第五 、 第 六 孔 中 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50ul， 混 匀 ； 混 匀 后 从 第 五 、 第 六 中 各取 50 l 分 别 加 到 第 七 、 第 八 孔 中 ， 再 在 第 七 、 第 八 孔 中 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50 ， 混 匀 后 从 第 七 、 第 八 孔 中 分 别 取 50 l 加 到 第 九 、 第 十 孔 中 ，再 在 第 九 第 十 孔 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50 l， 混 匀 后 从 第 九 第 十 孔 中 各 取50 l 弃 掉 。 （ 稀 释 后 各 孔 加 样 量 都 为 50 l， 浓 度 分 别 为 （ 1800ng/L ，1200ng/L， 600ng/L， 300ng/L， 150ng/L） 。 Your company slogan LOGO2. 加 样 ： 分 别 设 空 白 孔 （ 空 白 对 照 孔 不 加 样 品 及 酶 标 试 剂 ， 其 余 各 步 操 作相 同 ） 、 待 测 样 品 孔 。 在 酶 标 包 被 板 上 待 测 样 品 孔 中 先 加 样 品 稀 释 液 40 l， 然 后 再 加 待 测 样 品 10 l（ 样 品 最 终 稀 释 度 为 5 倍 ） 。 加 样 将 样 品 加 于 酶标 板 孔 底 部 ， 尽 量 不 触 及 孔 壁 ， 轻 轻 晃 动 混 匀 。3. 温 育 ： 用 封 板 膜 封 板 后 置 37 温 育 30 分 钟 。4. 配 液 ： 将 20 倍 浓 缩 洗 涤 液 用 蒸 馏 水 20 倍 稀 释 后 备 用5. 洗 涤 ： 小 心 揭 掉 封 板 膜 ， 弃 去 液 体 ， 甩 干 ， 每 孔 加 满 洗 涤 液 ， 静 置 30 秒 后 弃 去 ， 如 此 重 复 5 次 ， 拍 干 。6. 加 酶 ： 每 孔 加 入 酶 标 试 剂 50 l， 空 白 孔 除 外 。7. 温 育 ： 操 作 同 3。8. 洗 涤 ： 操 作 同 5。9. 显 色 ： 每 孔 先 加 入 显 色 剂 A50 l， 再 加 入 显 色 剂 B50 l， 轻 轻 震 荡 混 匀 ， 37 避 光 显 色 15 分 钟 .10. 终 止 ： 每 孔 加 终 止 液 50 l， 终 止 反 应 （ 此 时 蓝 色 立 转 黄 色 ） 。11. 测 定 ： 以 空 白 空 调 零 ， 450nm 波 长 依 序 测 量 各 孔 的 吸 光 度 （ OD 值 ） 。测 定 应 在 加 终 止液 后 15 分 钟 以 内 进 行 。 Your company slogan LOGO辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP)常 用 底 物 ：(1)邻 苯 二 胺 (OPD)： 反 应 显 橙 黄 色 ， 应 避 光 ， 致 癌 性 。(2)四 甲 基 联 苯 胺 (TMB)： TMB是 一 种 脂 溶 性 较 强 的 基 团 ，由 于 这 种 高 度 的 脂 溶 性 ， 使 其 易 形 成 多 聚 体 ， 在 HRP活 性部 位 产 生 粗 大 的 、 深 蓝 色 沉 淀 物 反 应 后 呈 蓝 色 。 酶 反 应 用HCL或 H2SO4终 止 后 ， TMB产 物 由 蓝 色 呈 黄 色 ， 最 适 吸 收 波长 为 450nm。 Your company slogan LOGO五 、 结 果 分 析以 标 准 物 的 浓 度 为 横 坐 标 ， OD 值 为 纵 坐 标 ， 在 坐 标 纸上 绘 出 标 准 曲 线 ， 根 据 样 品 的 OD 值 由 标 准 曲 线 查 出 相应 的 浓 度 ； 再 乘 以 稀 释 倍 数 ； 或 用 标 准 物 的 浓 度 与 OD 值 计 算 出 标 准 曲 线 的 直 线 回 归 方 程 式 ， 将 样 品 的 OD 值代 入 方 程 式 ， 计 算 出 样 品 浓 度 ， 再 乘 以 稀 释 倍 数 ， 即 为样 品 的 实 际 浓 度 。 Your company slogan LOGO六 、 思 考 题试 验 中 哪 些 因 素 可 能 会 对 实 验 结 果 造 成 影 响 ？（ 一 ） 固 相 载 体（ 二 ） 抗 原 （ 三 ） 试 验 样 品 （ 四 ） 结 合 物 (五 ） 洗 涤 剂 与 稀 释 剂（ 六 ） 底 物 （ 七 ） 作 用 时 间 (八 )试 验 的 重 复 性 （ 精 确 度 ） （ 九 ） 对 使 用 仪 器 要 求 Your company slogan LOGO六 、 应 用1.内 分 泌 方 面 已 经 用 于 检 测 雌 性 激 素 、 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 、 黄 体 素、 胰 岛 素 、 皮 质 醇 、 促 甲 状 腺 素 和 孕 酮 等2.在 血 液 学 方 面 可 用 于 检 查 凝 固 因 子 （ 如 第 凝 固 因 子 ） 、 红 细胞 抗 原 及 结 合 球 蛋 白 （ Hapto Globin） 等 1.在 寄 生 虫 病 方 面 ， 它 用 于 对 疟 原 虫 、 阿 米 巴 、 利 日 曼 原 虫 、 锥虫 、 血 吸 虫 、 旋 毛 虫 病 等 血 清 学 诊 断 ， 这 对 人 医 和 兽 医 都 很 重 要。2.在 病 原 微 生 物 方 面 已 用 于 检 查 链 球 菌 、 沙 门 氏 菌 、 布 氏 杆 菌 、结 核 杆 菌 、 麻 疯 杆 菌 、 霍 乱 弧 菌 等 的 抗 体 ， 还 可 用 于 破 伤 风 抗 毒素 和 霍 乱 弧 菌 抗 毒 素 的 测 定 以 及 检 测 斑 疹 伤 寒 立 克 次 氏 体 感 染 后 的 抗 体 。 Your company slogan LOGO