Chapter2蛋白质3蛋白质分离技术课件

Chapter 2 Chapter 2 蛋白质蛋白质Chapter 2 蛋白质蛋白质2.1 2.1 蛋白质的概念、重要性及分类蛋白质的概念、重要性及分类2.2 2.2 氨基酸氨基酸2.3 2.3 蛋白质的结构蛋白质的结构2.4 2.4 蛋白质的结构和功能的关系蛋白质的结构和功能的关系2.5 2.5 蛋白质的性质蛋白质的性质2.6 2.6 蛋白质的提取、分离和纯化蛋白质的提取、分离和纯化2.6 蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化 研究一个新的蛋白质首先要从它的研究一个新的蛋白质首先要从它的基本基本性质性质作为突破口，然后作为突破口，然后根据它的基本性质进根据它的基本性质进行分离纯化行分离纯化，最终用，最终用纯品纯品对其进行分析鉴定。对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质对蛋白质的基本性质进行的分析鉴定的基本性质进行的分析鉴定。研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。到纯的蛋白质样品。(1)(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；胞；(2)2)分离和纯化过程都必须分离和纯化过程都必须0 04 4的低温的低温下进行。下进行。蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化1蛋蛋白白质质的的分分离离步步骤骤(1)(1)生物组织的生物组织的机械破碎机械破碎。常用的方法有。常用的方法有研磨研磨法、超声波法、冻融法和酶解法法、超声波法、冻融法和酶解法等。等。(2)(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提抽提。水溶性蛋白用水溶性蛋白用中性缓冲溶液中性缓冲溶液抽提；抽提；酸性蛋白用酸性蛋白用稀碱性溶液稀碱性溶液抽提；抽提；脂溶性蛋白用脂溶性蛋白用表面活性剂表面活性剂抽提等。抽提等。(3)(3)粗提粗提:离心除去固体杂质后，可通过盐析、离心除去固体杂质后，可通过盐析、沉淀法、凝胶滤法、超过滤等处理，得到蛋白沉淀法、凝胶滤法、超过滤等处理，得到蛋白质粗制品。质粗制品。(4)(4)精制精制：可用层析法、电泳法等进行精制。：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)(5)成品成品加工加工：测定蛋白质的性质并干燥成成：测定蛋白质的性质并干燥成成品。品。2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法透析是利用透析是利用蛋白质分子不能透过半透蛋白质分子不能透过半透膜膜，而使它与，而使它与其它小分子化合物其它小分子化合物，如，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及水等分离。以及水等分离。常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸、火棉纸和其它合成材料。膜有纸、火棉纸和其它合成材料。膜有玻璃纸玻璃纸或或高分子合成材料高分子合成材料，截止分，截止分子量一般为子量一般为1 1万万。（1）透析法（）透析法（dialysis)透析法透析法2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。网状结构。凝胶层析介质：凝胶层析介质：SephadexSephadex-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G10-G200G10-G200SepharoseSepharose-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2 2B,4B,6BB,4B,6BSephacrylSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400S100,S200,S300,S400 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 凝胶过滤原理凝胶过滤原理 当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。出入凝胶珠的内外。大分子大分子小分小分子子 凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶排阻凝胶排阻示意图解示意图解凝胶过滤层析凝胶过滤层析 蛋蛋白白质质分分子子一一般般有有两两种种形形状状，一一种种是是球球形形分分子子，另另一一种种是是线线性性分分子子。线线性性蛋蛋白白质质分分子子与与球球形形分分子子比比较较，同同样样大大小小分分子子量量的的蛋蛋白白质质，线线性性分分子子体体积积大大流流速速快快，球球形形分分子子体体积积小小流流速速慢慢。因因此此，在在凝凝胶胶色色谱谱柱柱中中无无论论是是球球形形分分子子还还是是线线性性分分子子都都可可进进行行分分离离，但球形分子比线性分子的分离度好。但球形分子比线性分子的分离度好。此法是利用此法是利用离子交换剂离子交换剂作为柱层析支持物，将带有作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为离子交换树脂可以分为阳离子阳离子交换树脂（如羧甲基交换树脂（如羧甲基纤维素等），纤维素等），阴离子阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。纤维素等）。带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的用不同浓度的阳离子洗脱液阳离子洗脱液，如，如NaClNaCl溶液进行溶液进行梯度洗脱，通过梯度洗脱，通过Na+Na+的离子交换作用，或是改变的离子交换作用，或是改变流动相的流动相的PHPH值值，或是同时采用这两种方法，可，或是同时采用这两种方法，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析离子交换层析2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法离离子子交交换换层层析析这是一种这是一种高效分离纯化蛋白高效分离纯化蛋白的方法。其原理的方法。其原理是不同是不同的蛋白质分子的蛋白质分子对于固定化在载体上的对于固定化在载体上的特殊配基特殊配基具有具有不同的识别不同的识别和和结合能力结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配配基基，然后应用化学方法将该，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接配基与载体共价连接。将这种将这种连接有配基的载体连接有配基的载体装入层析柱中，当含有装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液或高盐溶液洗脱。配体洗脱液或高盐溶液洗脱。亲和层析亲和层析2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法+CCC配基配基蛋白质蛋白质1.配基固相化配基固相化2.亲和吸附亲和吸附固固体体载载体体3.解吸附解吸附在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为相反的电极移动，这种现象称为电泳电泳。带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v v）取决于电场强度取决于电场强度(E)E)，所带的净电荷所带的净电荷(q)q)以及与以及与介质的摩擦系数介质的摩擦系数(f)f)。常用的电泳方法有常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳聚焦电泳、双向电泳等。等。2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-SDS-聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳，也称泳，也称为为十二十二烷烷基酸基酸钠钠-聚聚丙丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳(sodium(sodium dodecyldodecyl sulphate-sulphate-polyacrylamidepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)gel electrophoresis,SDS-PAGE)。主主要用于蛋白要用于蛋白质亚质亚基分子量的基分子量的测测定。定。(1)(1)原理：原理：a.a.蛋白质分子状态蛋白质分子状态在在自自然然状状态态下下蛋蛋白白质质通通过过二二硫硫键键聚聚合合形形成成高高度度折折叠叠的的生生物物大大分分子子，在在水水溶溶液液中中，由由于于氨氨基基酸酸残残基基的的解解离离作作用用使使蛋蛋白白质质分分子子形形成成带带有有一一定定净电净电荷的分子。在荷的分子。在电场电场下向自身下向自身电电荷相反的方向移荷相反的方向移动动。b.b.还原剂的解聚作用还原剂的解聚作用 在在蛋蛋白白溶溶液液和和分分离离凝凝胶胶介介质质中中加加入入还还原原剂剂-巯巯基基乙乙醇醇(-mercaptoethanolmercaptoethanol)或或二二硫硫苏苏糖糖醇醇(DithiothretiolDithiothretiol,DTT)DTT)。蛋蛋白白质质分分子子在在还还原原剂剂作作用用下下二二硫硫键键被被还还原原，将将多多聚聚体体或或单单链链折折叠叠的的蛋蛋白白质质分分子子的的二二硫硫键打开，形成长短不一的单链亚基。键打开，形成长短不一的单链亚基。c.SDSc.SDS的包裹作用的包裹作用 SDSSDS分分子子中中含含有有大大量量的的带带负负电电的的磺磺酸酸基基。蛋蛋白白质质分分子子解解聚聚后后形形成成的的氨氨基基酸酸侧侧链链与与SDSSDS结结合合，在在SDSSDS的的重重量量达达到到蛋蛋白白重重量量的的3-43-4倍倍时时蛋蛋白白质质分分子子表表面面完完全全被被SDSSDS包包裹裹，形形成成带带负负电电荷荷的的蛋蛋白白质质亚亚基基分分子子，称之为蛋白质称之为蛋白质-SDS-SDS复合物复合物(protein-SDS micelles)(protein-SDS micelles)。由由于于蛋蛋白白质质-SDS-SDS复复合合物物所所带带负负电电荷荷远远大大于于蛋蛋白白质质分分子子自自身身有有的的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。d.d.聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质质-SDS-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。开。(2)2)操作过程操作过程制胶制胶 加样加样 电泳电泳 固定固定 染色染色 脱色脱色 计算计算(3)3)结果处理结果处理a.a.电泳图谱电泳图谱1 2 3b b.标准曲线标准曲线绘绘制制标标准准曲曲线线：以以标标准准蛋蛋白白质质分分子子量量的的对对数数log(M)log(M)为为纵纵坐坐标标，RfRf值值为横坐标，绘制标准曲线。为横坐标，绘制标准曲线。mRlgMr兔肌动蛋白牛血清白蛋白兔磷酸化酶牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制剂鸡蛋清溶菌酶c.c.未知蛋白分子量计算：未知蛋白分子量计算：将未知蛋白的将未知蛋白的RfRf值查到值查到log(M)log(M)值，便可知其分子量。计算分子量。值，便可知其分子量。计算分子量。(4)4)影响因素影响因素 影影响响SDS-SDS-复复合合物物形形成成的的主主要要因因素素。SDS-SDS-电电泳泳成成败败关关之之一一，是是在在制制备备样样品品的的过过程程中中，蛋蛋白白质质与与SDSSDS结结合合的的程程度度直直接接影影响响电电泳泳分分离离效效果。影响结合的因素主要有三个果。影响结合的因素主要有三个:A.A.溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度单体的浓度 SDSSDS在在水水溶溶液液中中以以单单体体和和SDSSDS复复合合物物混混合合存存在在的的，能能与与蛋蛋白白质质结结合合的的只只能能是是单单体体。单单体体的的浓浓度度与与SDSSDS总总浓浓度度，温温度度和和离离子子强强度度有有关关。在在一一定定温温度度和和离离子子强强度度下下，SDSSDS处处于于一一饱饱和和值值，即即单单体体浓浓度度不不再再随随SDSSDS中中浓浓度度增增加加而而增增加加。为为了了使使SDSSDS与与蛋蛋白白质质结结合合充充分分，SDSSDS和和蛋蛋白白质结合的重量比一般是质结合的重量比一般是4:14:1或或3:13:1。B.B.样品缓冲液离子强度样品缓冲液离子强度 因因为为SDSSDS结结合合到到蛋蛋白白质质分分子子上上的的量量取取决决于于平平衡衡时时SDSSDS单单体体浓浓度度，而而不不是是总总浓浓度度，只只有有在在较较低低的的离离子子强强度度溶溶液液中中，SDSSDS单单体体才才具具有有较较高高的的平平衡衡浓浓度度，所所以以样样品品缓缓冲冲液液应应选选用用低低离离子子强强度度，通通常常是是10-10-100mmol/l100mmol/l之间。之间。C.C.二硫键是否完全打开二硫键是否完全打开 只只有有蛋蛋白白质质分分子子中中的的二二硫硫键键完完全全被被打打开开，蛋蛋白白质质分分子子完完全全解解聚聚，SDSSDS充充分分与与亚亚基基分分子子结结合合，才才能能准准确确测测定定出出亚亚基基分分子子量量。二二硫硫键键完完全全被被打打开开要要取取决决于于巯巯基基乙乙醇醇的的质质量量和和使使用用的的剂剂量量。若若蛋蛋白白质质分分子子的的二二硫硫键键只只是是部部分分被被打打开开，这这是是测测出出的的分分子子量量是是蛋蛋白白质质分分子子和和亚亚基基分分子的混合物。子的混合物。等电聚焦电泳等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF）a.原理原理:通通常常是是指指聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶等等电电聚聚焦焦电电泳泳。它它是是6060年年代代初初建建立立起起来来的的一一种种蛋蛋白白质质分分离离手手段段，现现在在已已经经成成为为单单向向蛋蛋白白质质电电泳泳分分辨辨率率最最高的一种分离技术。高的一种分离技术。它它是是利利用用蛋蛋白白质质分分子子或或其其它它两两性性分分子子的的等等电电点点的的差差异异进进行行电电泳泳分分离离和和分分析析。蛋蛋白白质质在在一一个个稳稳定定的的线线性性pHpH梯梯度度的的凝凝胶胶中中电电泳泳，蛋蛋白白质质朝朝着着与与自自身身电电荷荷相相反反的的方方向向移移动动，在在移移动动的的过过程程中中不不断断被被凝凝胶胶中中的的反反离离子子中中和和，最最后后静静电电荷荷完完全全被被中中和和而而停停止止运运动动，聚聚焦焦在在等等电电点点的位置。的位置。b.b.蛋白质与两性电解质蛋白质与两性电解质(1)(1)蛋白质的等电点蛋白质的等电点 蛋蛋白白质质属属于于一一种种两两性性电电解解质质。在在不不同同的的pHpH环环境境中中所所带带的的正正负负电电荷荷不不同同。若若在在某某特特定定的的pHpH环环境境中中其其净净电电荷荷为为零零，此此时时的的pHpH为为该该蛋蛋白白质的等电点，在电场下不泳动。质的等电点，在电场下不泳动。(2)(2)载体两性电解质：载体两性电解质：在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能：在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能：A 中和功能：中和功能：两两性性电电解解质质的的性性质质在在分分离离系系统统中中形形成成一一个个平平衡衡稳稳定定的的pHpH梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有pHpH缓冲能。缓冲能。B 载电功能：载电功能：两两性性电电解解质质作作为为电电的的载载体体，具具有有运运载载“电电流流”的的能能力力，有良好的导电性能有良好的导电性能水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽等电聚焦等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有时，蛋白质混合物的分离是在具有PHPH梯度的介质梯度的介质中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并“聚焦聚焦”（停留在等于其等电点的（停留在等于其等电点的PHPH梯度处，形成一个很窄的区梯度处，形成一个很窄的区带。它的分辨率很高，可以把人的血清分成带。它的分辨率很高，可以把人的血清分成4040多个区带。多个区带。适于做同工酶的鉴定。适于做同工酶的鉴定。方法方法:制胶制胶 加样加样 电泳电泳 固定固定 染色染色 脱色脱色 计算计算等等电电聚聚焦焦 双双向向电电泳泳（two-dimensional two-dimensional electrophoresiselectrophoresis）双双向向电电泳泳是是等等电电聚聚焦焦电电泳泳和和SDS-PAGESDS-PAGE的的组组合合，即即先先进进行行等等电电聚聚焦焦电电泳泳（按按照照pIpI分分离离），然然后后再再进进行行SDS-PAGESDS-PAGE（按按照照分分子子大大小小），经经染染色色得得到到的的电电泳泳图图是是个个二二维维分分布布的的蛋白质图。蛋白质图。肽的化学合成（了解）肽的化学合成（了解）五、六十年代，世界上，包括我国主五、六十年代，世界上，包括我国主要是从动物器脏获取肽。如：胸腺肽这种要是从动物器脏获取肽。如：胸腺肽这种胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽已处于淘汰状态已处于淘汰状态。世界上有固相合成法、液相合成法生产的世界上有固相合成法、液相合成法生产的肽。用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就肽。用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就有一家。他们主要是购买世界上一些精细化有一家。他们主要是购买世界上一些精细化工厂生产的氨基酸为原料，用工厂生产的氨基酸为原料，用固相合成法固相合成法、液相合成法液相合成法，定向合成某种单肽。属医药原，定向合成某种单肽。属医药原料中间体，其用途主要用于西药配方，以增料中间体，其用途主要用于西药配方，以增强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率。