吸光光度分析法Spectrophotometry

第 十 二 章 吸 光 光 度 分 析 法Spectrophotometry 本章学习要求1. 了解溶液颜色与光吸收的关系2. 了解吸光光度法的基本概念和 特点，掌握吸收曲线的特点， 了解其应用3. 掌握LambertBeer定律的原 理和应用,掌握吸光系数a和摩 尔吸光系数 ,了解 Lambert Beer定律的偏离情况 4. 掌握显色反应的特点,掌握 显色条件和测量条件的选 择5. 掌握吸光光度法的应用,了 解吸光光度法的仪器， 吸 收 光 谱 分 析 Analysis of Absorption Spectroscopy 吸 光 光 度 法 是 以 物 质 对 光 的选 择 性 吸 收 为 基 础 的 分 析 方法 . 本 章 主 要 讨 论 可 见 光 区 (400-750 nm) 的 吸 光 光 度 法 11.1 基 本 概 念1.物 质 对 光 的 选 择 吸 收n单 色 光 具 有 同 一 波 长 的 光 为 单 色 光 . n复 合 光 由 不 同 波 长 光 组 成 的 混 合 光 称 为 复 合 光 。 n互 补 光 透 射 光 与 吸 收 光 组 成 白 光 ， 故 称 为 互 补 色 光 n物 质 的 颜 色 对 不 同 波 长 的 光 选 择 性 吸 收n溶 液 的 颜 色 被 吸 收 光 色 的 互 补 色 n 硫 酸 铜 溶 液 ， 吸 收 黄 光 呈 现 蓝 色 . 青 蓝白 光绿 青蓝紫红橙 黄光 的 互 补 色 示 意 图n 高 锰 酸 钾 溶 液 ， 吸 收 绿 光 , 呈 现 紫 色 。 2. 吸 收 曲 线 absorption spectrum 照 射 到 溶 液 的 入 射 光 有一 部 分 被 溶 液 吸 收 ,另一 部 分 透 过 溶 液 .入 射 光 强 度 I0透 射 光 强 度 I吸 收 光 强 度 I a I0= I + Ia I0 I溶 液 透 光 度 T transmittance T = I / I0吸 光 度 A absorbance A= - lg T = lg I0 / I Al作 图 得 吸 收 曲 线(吸 收 光 谱 ) 溶 液 对 不 同 波 长 的 光 吸 收 具 有 选 择 性 ， KMnO4溶 液 最 大 吸 收 波 长 lmax= 525nm。 物 质 的 吸 收 曲 线 是 一 种 特 征 曲 线 。 不 同浓 度 溶 液 的 吸 收 曲 线 形 状 相 似 ， 最 大 吸 收波 长 不 变 。 在 最 大 吸 收 波 长 附 近 ， 吸 光 度 测 量 的 灵敏 度 最 高 。 这 一 特 征 可 作 为 定 量 分 析 选 择入 射 光 波 长 的 依 据 。 11.2 光 吸 收 定 律1.Lambert-Beer定 律 一 束 平 行 单 色 光 通 过 有 色 溶 液 时 ，溶 液 的 吸 光 度 A与 液 层 厚 度 b和 溶 液浓 度 c的 乘 积 成 正 比 。 -Lambert -Beer定 律 A=KbcK比 例 常 数 ,与 溶 液 性 质 , T, l有 关 K值 随 c的 单 位 不 同 而 不 同 , 液 层 厚 度 以 cm为 单 位 .c /gL-1 A=abc a 吸 光 系 数 absorption coefficient 单 位 : Lg-1 cm-1 c/molL-1 A= e bce 摩 尔 吸 光 系 数 molar absorptivity 单 位 : Lmol -1 cm-1 e molar absorptivity e 表 示 吸 光 物 质 浓 度 为 1mol/l,液 层 厚 度 为 1cm时 溶 液 的 吸 光 度 . e 值 越 大 ， 溶 液 的 吸 光 能 力 越 强 ， 显 色 反 应 的 灵 敏 度 越 高 . e 是 吸 光 物 质 在 特 定 波 长 下 的 特 征 常 数 e 值 是 选 择 显 色 反 应 的 重 要 依 据 . Ex.浓 度 为 0.51mg/ml的 Cu2+溶 液 ,用 双环 己 酮 草 酰 二 腙 光 度 法 测 定 .在600nm波 长 处 用 2cm比 色 皿 测 得A=0.297.求 e , a. 1123 1146 16 3Cu cmgl100.30.21051.0 297.0 cmmoll109.10.2100.8 297.0 lmol100.855.63 1051.0: 2 a Ce解 e aM 2. Lambert-Beer定 律 的 偏 离按 照 Lambert-Beer定 律Ac 有 线 性 关 系 : A=e bc但 有 时 会 发 生 偏 离 ,特 别 在 浓 度 较 大 时 , 偏 离 更 大 .原 因 :1)非 单 色 光 2)化 学 因 素 :离 解 、 缔 合 、 异 构 化 等 A c0 11.3 吸 光 光 度 分 析 的 方 法 和 仪 器1.测 定 方 法 1). 目 视 比 色 法 2).分 光 光 度 法 定 量 方 法n 标 准 曲 线 法n 标 准 比 较 法 As/Ax=Cs/Cx A cAx cx0 光 度 分 析 的 标 准 曲 线 2.分 光 光 度 计1.光 源2.单 色 器 3.吸 收 池 4.检 测 系 统3.分 光 光 度 法 的 优 点 灵 敏 度 高 . 10 -510-6mol/l 准 确 度 好 . RE =25% 简 便 ,快 速 ,成 本 低 ,应 用 广 . 例 :用 浓 度 为 0.100mg Mn/ml的 KMnO4标 准 溶 液 .以 1cm比 色 皿 在 520nm波长 处 测 得 该 溶 液 吸 光 度 A为 0.500,今取 含 Mn未 知 液 10.00ml,氧 化 为MnO4-后 ,定 容 至 50.00ml,在 相 同 条 件下 测 得 A=0.300.求 未 知 液 Mn的 浓 度 . 解 : 0.500/0.300=0.100/cxcx=0.0600 mg/mlc未 =0.0600 50.00/10.00 =0.300 mg/ml 11.4 显 色 反 应 和 显 色 条 件1.显 色 反 应 1.灵 敏 度 高 . CuNH 3 e 6201.2 102 Cu双 硫 腙 e 5335.0 104 2.选 择 性 好 3.显 色 产 物 组 成 恒 定 ,性 质 稳 定 . 4.显 色 产 物 与 显 色 剂 色 差 大 ,显 色 时 颜 色 变 化 明 显 .试 剂 空 白 值 小 . 2.显 色 条 件 1)显 色 剂 的 用 量 （ 由 实 验 确 定 ） M + R = MR (被 测 组 分 ) (显 色 剂 ) (有 色 化 合 物 )R过 量 ,反 应 完 全 , MR稳 定 ,A值 稳 定 . A AAC R C R C Ra b a b0 0 0A与 C R关 系 图 2)酸 度大 多 数 显 色 剂 是 有 机 弱 酸 (碱 ),显 色 反 应 受 酸度 影 响 . M + R MR M(OH)n HROH- H+显 色 反 应 最 适 宜 的 酸 度 由 实 验 确 定 磺 基 水 杨 酸 与 Fe3+在 不 同 条 件 下 形 成 具有 不 同 组 成 和 颜 色 的 配 位 化 合 物 : pH 23 Fe(ssal)+ pH 47 Fe (ssal)2- pH 810 Fe(ssal)33- pH12 Fe(OH)3 黄 色橙 色紫 色沉 淀 3) 温 度 、 时 间 适 宜 的 显 色 时 间 和 温 度 由 实 验 确 定 A t 11.5 吸 光 度 测 量 条 件 的 选 择 1.入 射 光 波 长1)通 常 选 择 lmax2) lmax处 有 干 扰 时 ,选 择 干 扰 最 小 ,吸 光 度 尽 可 能 大 的 波 长 进 行 测量 . 2.参 比 溶 液 (空 白 溶 液 )在 测 定 时 用 空 白 溶 液 调 节 仪 器 A=0(T =100%),以 消 除 溶 液 中 其 它 物 质 的 干 扰 ,抵 消 比 色 皿对 光 反 射 、 吸 收 .1)溶 剂 空 白 试 液 、 试 剂 、 显 色 剂 均 无 色 (无 吸 收 ) 则 可 用 溶 剂 如 纯 水 作 参 比 溶 液 . 2)试 剂 空 白 试 液 无 色 , 显 色 剂 或 其 它 试 剂 有 色 (有 吸收 ), 则 应 选 试 剂 空 白 .3)试 液 空 白 试 剂 、 显 色 剂 均 无 色 (无 吸 收 ),试 液 中其 它 组 分 有 色 , 则 应 采 用 不 加 显 色 剂 的 试液 作 参 比 溶 液 .n选 择 参 比 溶 液 的 总 原 则 是 :使 试 液 的 吸 光度 能 真 正 反 映 待 测 组 分 的 浓 度 . 3.吸 光 度 读 数 范 围n任 何 型 号 的 分 光 光 度 计 均 有 一 定 的 读 数误 差 ,这 是 由 于 光 源 不 稳 定 ,读 数 不 准 确 等因 素 造 成 的 .n一 定 型 号 的 分 光 光 度 计 透 光 度 读 数 误 差是 一 常 数 .（ 0.2 % 2 %）n在 不 同 的 透 光 度 读 数 范 围 内 引 起 的 浓 度相 对 误 差 是 不 同 的 .n由 Lambert-Beer定 律 可 推 导 出 浓 度 相 对误 差 公 式 . ccTTTcc TT Tcc 时 的可 计 算 不 同若 透 光 度 测 量 绝 对 误 差浓 度 相 对 误 差%,5.0: lg434.0 T=36.8%时 ,A=0.434, c/c有 极 小 值 T很 小 或 很 大 时 , c/c都 较 大 .T=65%20%, A=0.190.7. c/c2%光 度 测 量 时 ,吸 光 度 应 控 制 在 合 适 的 范 内 : A=0.20.7 减 小 浓 度 测 量 的 相 对 误 差 , 提 高 准 确 度 4.控 制 吸 光 度 范 围 的 方 法1.改 变 比 色 皿 的 厚 度2.改 变 试 液 的 浓 度 (称 样 量 、 稀释 倍 数 等 )3.示 差 法 例 1:Fe(phen)32+溶 液 的e =1.1 104Lmol-1 cm-1, 在 lmax处 ,用 2cm比 色 皿 测 得 溶 液 吸 光 度A=2. 若 T=0.5%, 1)求 c/c. 2)怎 样 才 能 使 A=0.20.7? 解 :2) 溶 液 浓 度 不 变 ,改 变 比 色 皿 厚 度 : 选 0.5cm比 色 皿 ,则 A=0.5. 或 比 色 皿 厚 度 不 变 ,改 变 溶 液 浓 度 : 稀 释 310倍 . (称 量 减 少 到 m/3 m/10) A=0.70.2 例 2.若 上 题 中 比 色 皿 厚 度 为 0.5cm,欲 使 测 量 误 差 最 小 ,溶 液 的 浓 度 应为 多 少 ? 144 lmol109.7 5.0101.1 434.0 A 0.434 : x xc bce解 11.6 吸 光 光 度 法 的 应 用 1.单 一 组 分 的 测 定 1).钼 蓝 法 测 磷n土 壤 营 养 诊 断 测 磷n肥 料 、 谷 物 种 子 、 果 品 中 磷 的 测 定n血 清 中 磷 的 测 定n水 体 中 磷 的 测 定 PO43-+12MoO42-+27H + =H 7 P(Mo2O7) 6+12H 2O钼 蓝 法 反 应 灵 敏 度 高 ,显 色 快 ,但 稳 定 性 差 .钼 锑 抗 法 稳 定 性 好 .灵 敏 度 高 ,Vc溶 液 须新 鲜 配 制 . SnCl2 钼 蓝C H + =0.40.8mol/l,室 温 ,10min 2)邻 菲 罗 林 法 测 Fe2+Fe2+3phen=Fe(phen)32+ lgK=21.3 盐 酸 羟 胺 还 原 Fe3+,可 测 全 Fe 4Fe3+2NH 2OH = 4Fe2+N2O+H 2O+4H + 3)双 硫 腙 法 测 金 属 离 子Cu2+、 Pb2+、 Zn2+、 Cd2+、 H g2+ pH =45 测 Zn2+ pH =89 测 Pb2+ 2.示 差 法 测 高 含 量 组 分 原 理 示 差 法 采 用 比 试 液 浓 度 cx梢低 的 标 准 溶 液 cs作 参 比 溶 液 , (cs cx). 调 节 仪 器 A=0(T=100%),然 后 测 试液 的 吸 光 度 .该 吸 光 度 为 试 液 与 参 比 溶液 吸 光 度 之 差 A.称 为 相 对 吸 光 度 Ar. Ar =A = e b(cx-cs) = e bc定 量 方 法 :标 准 曲 线 法 标 准 比 较 法示 差 法 可 提 高 测 定 的 准 确 度 0 1000 10050Tx =5% Ts=10%示 差 光 度 法 标 尺 扩 展 原 理 3.多 组 分 分 析 1.吸 收 曲 线 不 重 叠 , 可 分 别 测 定 。2.吸 收 曲 线 相 互 重 叠 ： yyxx yyxx bcbcA bcbcA 2222 1111 : eel eel 处处 4.光 度 滴 定 spectrophotometric titration 光 度 滴 定 法 是 根 据 滴 定过 中 溶 液 的 吸 光 度 的 变 化来 确 定 终 点 的 滴 定 分 析 法 . 例 :在 745nm处 测 EDTA滴 Bi3+,Cu2+ 混 合 液 的 吸 光 度 值 .Bi3+,Cu2+ EDTA BiY ,Cu2+ EDTA CuYCu终 点Bi终 点A V/ml 在 745nm时 Bi3+,Cu2+,EDTA, BiY均无 吸 收 .到 第 一 计 量 点 前 A不 变 . 第 一 计 量 点 后 ,随 EDTA加 入 ,形 成CuY在 此 波 长 处 CuY有 吸 收 ,A值 不 断增 大 .到 终 点 后 再 加 EDTA, A不 变 .由滴 定 曲 线 得 到 两 个 确 定 的 终 点 . 灵 敏 度 高 ,准 确 度 好 ,对 于 平 衡 常数 小 的 反 应 也 可 以 测 定 .