生物制药工艺技术基础

二 、 动 物 细 胞 工 程 制 药 技 术 基 础（ 一 ） 动 物 细 胞 的 获 得 供 生 产 生 物 技 术 药 物 的 动 物 细 胞 有 3类 ； 1、 原 代 细 胞 原 代 细 胞 是 直 接 取 自 动 物 组 织 器 官 ， 经 过 分 散 、消 化 制 得 的 细 胞 悬 液 。 2、 二 倍 体 细 胞 系 原 代 细 胞 经 过 传 代 、 筛 选 、 克 隆 ， 从 而 由 多 种 细胞 成 分 的 组 织 中 挑 选 强 化 具 有 一 定 特 性 的 细 胞 株 。 其 特 点 是 ： 染 色 体 组 织 仍 然 是 2n的 模 型 ； 具 有 明 显 贴 壁 依 赖 和 接 触 抑 制 的 特 性 ： 具 有 有 限 的 增 殖 能 力 ， 一 般 可 连 续 传 代 培 养 50代 ； 无 致 癌 性 。 二 倍 体 细 胞 通 常 由 胚 胎 组 织 中 获 取 。 3、 转 化 细 胞 系 这 类 细 胞 常 常 因 染 色 体 的 断 裂 而 变 成 异 倍 体 ， 从而 失 去 了 正 常 细 胞 的 特 点 ， 而 获 得 无 限 繁 殖 的 能 力 。这 种 转 化 进 程 可 以 是 自 发 的 ， 也 可 以 通 过 人 为 的 方 法进 行 的 转 化 。 另 外 ， 从 动 物 肿 瘤 组 织 中 建 立 的 细 胞 系 也 是 转 化细 胞 ， 转 化 细 胞 具 有 无 限 生 命 力 ， 倍 增 时 间 较 短 ， 培养 条 件 要 求 较 低 ， 适 于 大 规 模 生 产 培 养 。（ 二 ） 动 物 细 胞 培 养 条 件 营 养 、 pH 及 温 度 是 细 胞 生 长 所 要 求 的 重 要 条 件 ，培 养 细 胞 的 最 适 温 度 为 37 0.5 ， 偏 离 此 温 度 ，细 胞 的 正 常 生 长 及 代 谢 将 会 受 到 影 响 。 细 胞 培 养 的 最适 pH 7.2 7.4间 。 细 胞 生 长 代 谢 离 不 开 气 体 ， 培 养 瓶 中 的 O2与 CO2 ，是 以 保 证 细 胞 体 内 代 谢 活 动 的 进 行 ， 但 作 为 代 谢 产 物CO 2 在 培 养 环 境 中 还 有 调 节 pH 的 作 用 ， CO2培 养 箱可 以 维 持 一 定 比 例 的 CO2 ， 使 培 养 环 境 中 的 氢 离 子 浓度 保 持 恒 定 。 在 保 证 细 胞 渗 透 压 的 情 况 下 ， 培 养 液 里 的 成 分 要满 足 细 胞 进 行 代 谢 所 需 要 的 各 种 组 成 ， 如 各 种 必 需 氨基 酸 和 非 必 需 氨 基 酸 、 维 生 素 、 碳 水 化 合 物 及 无 机盐 类 等 ， 只 有 满 足 了 这 些 基 本 条 件 ， 细 胞 才 能 在 体 外正 常 存 活 、 生 长 。 另 外 ， 在 单 克 隆 抗 体 实 验 培 养 中 加 入 一 些 饲 养 细胞 ， 或 在 换 液 时 留 一 些 原 培 养 液 ， 也 有 利 于 细 胞 生 长 。 各 种 合 成 培 养 基 给 细 胞 培 养 提 供 了 方 便 ， 但 单 纯采 用 合 成 培 养 基 ， 细 胞 还 不 能 很 好 地 增 殖 ， 甚 至 细 胞不 贴 壁 生 长 ， 因 此 使 用 时 常 要 添 加 5 10 小 牛 血清 ， 对 杂 交 瘤 细 胞 的 培 养 添 加 胎 牛 血 清 要 达 l0 20 ， 其 使 用 有 几 方 面 ： 提 供 细 胞 生 长 所 需 的 条 件 生 长 因 子 和 激 素 。 提 供 细 胞 贴 壁 所 需 的 贴 附 因 子 和 伸 展 因 子 ； 提 供 识 别 金 属 、 激 素 、 维 生 素 和 脂 类 的 结 合 蛋白 ； 提 供 细 胞 生 长 所 需 的 脂 肪 酸 和 微 量 元 素 。 为 适 应 大 规 模 细 胞 培 养 ， 发 展 高 技 术 生 物 制 品 ，近 代 还 大 力 研 究 无 血 清 培 养 基 。 无 血 清 培 养 基 具 有 以 下 优 点 ： 提 高 了 细 胞 培 养 的 可 重 复 性 ， 避 免 了 由 于 血 清批 之 间 差 异 的 影 响 ； 减 少 了 由 血 清 带 来 的 病 毒 、 真 菌 和 支 原 体 等 微生 物 污 染 的 危 险 ； 供 应 充 足 、 稳 定 ； 细 胞 产 品 易 于 纯 化 ； 避 免 了 血 清 中 某 些 因 素 对 某 些 细 胞 的 毒 性 ； 减 少 了 血 清 中 蛋 白 对 某 些 生 物 测 定 的 干 扰 ， 便于 实 验 结 果 的 分 析 。 无 血 清 培 养 基 是 以 合 成 培 养 基 为 基 础 加 入 各 种 细胞 生 长 所 需 的 添 加 因 子 ， 有 利 于 细 胞 生 长 的 因 子 和微 量 元 素 等 。 （ 三 ） 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 方 法 动 物 细 胞 培 养 的 方 法 ， 一 般 可 根 据 培 养 细 胞 的 种类 分 为 原 代 细 胞 培 养 和 传 代 细 胞 培 养 ； 又 可 根 据 培 养基 的 不 同 分 为 液 体 培 养 和 固 体 培 养 ； 还 可 根 据 培 养 容器 和 方 式 的 不 同 分 为 静 止 培 养 、 旋 转 培 养 、 搅 拌 培 养 、微 载 体 培 养 、 中 空 纤 维 培 养 、 固 定 床 或 流 化 床 培 养 等 。 但 从 生 产 实 际 看 ， 动 物 细 胞 的 大 规 模 培 养 主 要 可分 为 悬 浮 培 养 、 贴 壁 培 养 和 贴 壁 悬 浮 培 养 。 1、 悬 浮 培 养 顾 名 思 义 ， 所 谓 悬 浮 培 养 即 让 细 胞 自 由 地 悬 浮 于 培养 基 内 生 长 增 殖 。 它 适 用 于 一 切 种 类 的 非 贴 壁 依 赖 性细 胞 （ 悬 浮 细 胞 ） ， 也 适 用 于 兼 性 贴 壁 细 胞 。 该 培 养 方 法 的 优 点 是 操 作 简 便 ， 培 养 条 件 比 较 均一 ， 传 质 和 传 氧 较 好 ， 容 易 扩 大 培 养 规 模 ， 在 培 养 设各 的 设 计 和 实 际 操 作 中 可 借 鉴 许 多 有 关 细 菌 发 酵 的 经验 。 目 前 在 生 产 中 用 于 悬 浮 培 养 的 设 备 主 要 是 通 气 搅拌 罐 式 生 物 反 应 器 和 气 升 式 生 物 反 应 器 。 2、 贴 壁 培 养 贴 壁 培 养 是 必 须 让 细 胞 附 在 某 种 基 质 上 生 长 繁 殖的 培 养 方 法 ： 它 适 用 于 一 切 贴 附 依 赖 性 细 胞 （ 贴 壁 细胞 ） ， 也 适 用 于 兼 性 贴 壁 细 胞 。 该 方 法 优 点 是 适 用 的 细 胞 种 类 广 （ 因 为 生 产 中 所 使用 的 细 胞 绝 大 多 数 是 贴 壁 细 胞 ） ， 较 容 易 采 用 灌 流 培养 的 方 式 使 细 胞 达 到 高 密 度 ； 不 足 之 处 是 操 作 比 较 麻烦 。 需 要 合 适 的 贴 附 材 料 和 足 够 的 面 积 ， 培 养 条 件 不 易均 一 ， 传 质 和 传 氧 较 差 ， 这 些 不 足 常 常 成 为 扩 大 培 养的 “ 瓶 颈 ” 。 被 普 遍 采 用 的 贴 壁 培 养 方 法 是 固 定 床 式 生 物 反 应 器 ，但 由 于 该 反 应 器 中 传 质 和 传 氧 常 会 出 现 梯 度 式 不 均 一现 象 ， 故 放 大 常 受 到 限 制 。 贴 壁 培 养 扩 大 培 养 时 ， 常 常 需 要 用 酶 将 其 从 基 质 上消 化 下 来 。 它 们 的 作 用 主 要 是 使 细 胞 间 质 和 一 些 促 进细 胞 贴 附 的 蛋 白 因 子 水 解 ， 使 细 胞 从 基 质 分 离 成 单 个细 胞 。 3、 微 载 体 培 养 微 载 体 培 养 是 使 细 胞 贴 附 在 微 小 颗 粒 载 体 上 ， 它 创造 了 相 当 大 的 贴 附 面 积 ， 供 细 胞 贴 附 生 长 、 增 殖 。 载体 体 积 很 小 ， 比 重 较 轻 ， 在 轻 度 搅 拌 下 即 可 使 细 胞 自由 悬 浮 于 培 养 基 内 ， 充 分 发 挥 悬 浮 培 养 的 优 点 。 理 想 的 微 载 体 需 具 备 如 下 一 些 条 件 ： 微 载 体 表 面 性 质 与 细 胞 有 良 好 的 相 容 性 ， 适 用细 胞 附 着 、 伸 展 和 增 殖 ； 微 载 体 的 材 料 无 毒 性 。 不 仅 要 求 对 细 胞 的 生 长 无毒 性 ， 而 且 也 不 会 产 生 影 响 产 品 和 人 体 健 康 的 有 害 因子 ； 微 载 体 的 材 料 是 惰 性 的 ， 不 与 培 养 基 成 分 发 生 化学 变 化 ， 也 不 会 吸 收 培 养 基 中 的 营 养 成 分 ； 微 载 体 的 比 重 在 1.030 1.045g ml， 使 载 体 在 低速 搅 拌 下 就 可 悬 浮 ， 而 在 静 止 时 又 可 很 快 沉 降 ， 便 于换 液 和 收 获 ； 粒 径 在 60 250 m（ 溶 胀 后 ） 之 间 为 好 ， 并 要 尽可 能 地 均 一 ， 差 异 不 大 于 20 m 。 这 样 有 利 于 细 胞 均匀 分 布 在 各 微 载 体 表 面 ； 具 有 良 好 的 光 学 透 明 性 ， 适 用 在 倒 置 显 微 镜 下 观察 细 胞 在 载 体 上 的 生 长 情 况 ； 基 质 的 性 质 最 好 是 软 性 的 ， 避 免 在 搅 拌 中 由 于 载体 互 相 磨 擦 而 损 伤 细 胞 ； 可 耐 120 高 温 ， 便 于 采 用 高 压 蒸 汽 灭 菌 ； 经 简 单 的 适 当 处 理 后 ， 可 反 复 多 次 地 使 用 ； 原 料 充 分 ， 制 作 简 便 ， 价 廉 。 （ 五 ） 动 物 细 胞 的 种 质 保 存 动 物 细 胞 种 质 保 存 的 形 式 有 组 织 块 、 细 胞 悬 浮 物 及细 胞 单 层 培 养 物 等 。 保 存 方 式 有 常 温 、 低 温 及 超 低 温冰 冻 法 3种 。 目 前 超 低 温 冰 冻 法 是 保 存 种 质 细 胞 最 有 效 和 最 重 要的 方 法 。 常 温 法 是 将 特 定 种 质 形 式 保 存 于 20 30 的 方 法 ，如 人 肾 及 猴 肾 细 胞 单 层 于 25 30 可 保 存 1个 月 以 上 ，人 二 倍 体 细 胞 单 层 可 保 存 两 周 ， 中 间 换 液 可 保 存 30d以上 ， 若 生 长 液 中 小 牛 血 清 减 至 0.5 l ， 于 37 培 养并 有 规 律 地 更 换 培 养 基 ， 则 可 长 期 保 存 。 低 温 法 是 将 特 定 种 质 形 式 保 存 于 4 的 方 法 ， 如 原代 猴 肾 细 胞 悬 浮 于 4 生 长 液 中 ， 可 保 存 3周 。 超 低 温 冰 冻 法 系 将 种 质 细 胞 保 存 于 70 以 下 冰箱 或 液 氮 中 的 保 存 方 法 。 在 此 条 件 下 ， 种 质 可 长 期 保存 。 但 是 本 法 需 用 保 护 剂 ， 常 用 的 保 护 剂 有 二 甲 亚 砜（ DMSO） 及 甘 油 等 。 甘 油 使 用 浓 度 为 5 20 ， DMSO使 用 浓 度 为 5 12.5 。 DMSO因 起 作 用 更 快 ， 毒 性 及 黏 度 更 低 ，膜 透 性 更 高 ， 抗 冻 伤 能 力 更 强 而 应 用 最 多 ， 细 胞 在DMSO中 30s左 右 即 达 到 内 外 平 衡 ， 但 在 甘 油 中 2h才能 平 衡 。 在 深 冻 过 程 中 ， 先 配 制 含 8 l0 DMSO、 15 20 小 牛 血 清 及 适 量 NaHCO3的 保 护 液 ， 再 将 细胞 培 养 物 消 化 与 分 散 ， 离 心 收 集 细 胞 ， 按 5 106个 细胞 ml浓 度 添 加 保 护 液 ， 按 lml 支 分 装 于 安 瓿 中 ，0 4 放 置 2 4 h， 移 至 70 冰 箱 中 或 置 于 液 氮 中保 存 。 保 冻 细 胞 在 继 代 培 养 前 需 复 苏 ， 复 苏 时 将 安 瓿取 出 ， 包 裹 4层 纱 布 浸 入 40 水 中 ， 除 去 纱 布 后 再 浸入 水 中 融 化 40s， 混 匀 后 立 即 接 种 l 2（ 100ml培 养瓶 ） ， 并 按 1 2ml4ml8ml缓 慢 而 依 次 加 入 生 长液 ， 最 终 加 至 20ml。 若 保 护 液 含 DMSO可 直 接 用 于 接 种 ， 但 其 浓 度 应 降至 l 以 下 。 若 保 护 液 含 甘 油 ， 则 应 离 心 除 去 甘 油 ，以 防 影 响 细 胞 增 殖 ， 加 生 长 液 后 可 通 过 台 酚 蓝 染 色 法计 算 活 细 胞 数 ， 然 后 用 于 培 养 。 （ 六 ） 单 克 隆 抗 体 技 术 l、 单 克 隆 抗 体 的 制 备 原 理 B细 胞 群 受 抗 原 刺 激 后 能 产 生 针 对 抗 原 决 定 簇 的 特异 性 抗 体 ， 一 个 机 体 可 产 生 多 达 100万 种 特 异 性 不 同的 抗 体 。 但 一 个 B细 胞 却 只 能 分 泌 一 种 特 异 性 抗 体 。 每 个 杂交 瘤 细 胞 只 分 泌 一 种 特 异 性 抗 体 ， 培 养 单 个 杂 交 瘤 细胞 ， 使 之 无 性 繁 殖 形 成 细 胞 集 落 （ 称 之 为 克 隆 ） 。 同一 个 克 隆 的 杂 交 瘤 细 胞 基 因 相 同 ， 合 成 并 分 泌 的 特 异性 抗 体 质 地 均 一 。 这 种 抗 体 称 之 为 单 克 隆 抗 体 。 淋 巴 细 胞 杂 交 瘤 技 术 是 将 在 体 外 不 能 长 期 生 存 的免 疫 淋 巴 细 胞 与 在 体 外 能 迅 速 增 殖 的 骨 髓 瘤 细 胞 在 聚乙 二 醇 （ PEG ） 作 用 下 融 合 而 产 生 杂 交 瘤 细 胞 。 所 得 的 杂 交 瘤 细 胞 承 袭 了 两 组 亲 代 细 胞 的 遗 传 性 ，既 保 存 了 骨 髓 瘤 细 胞 在 体 外 迅 速 增 殖 传 代 的 能 力 ， 又继 承 了 免 疫 淋 巴 细 胞 合 成 与 分 泌 抗 体 和 淋 巴 因 子 的 能力 。 T淋 巴 细 胞 主 司 细 胞 免 疫 ， 分 泌 淋 巴 因 子 。 已 知 有40多 种 淋 巴 因 子 。 T细 胞 与 骨 髓 瘤 细 胞 融 合 可 产 生 能分 泌 淋 巴 因 子 的 T细 胞 杂 交 瘤 细 胞 。 B细 胞 主 司 体 液 免 疫 ， 能 分 泌 特 异 性 免 疫 球 蛋 白（ 抗 体 ） ， B细 胞 与 骨 髓 瘤 细 胞 融 合 则 产 生 能 分 泌 特异 性 抗 体 的 B细 胞 杂 交 瘤 细 胞 。 单 克 隆 抗 体 有 特 异 性 强 、 免 疫 滴 度 高 、 质 地 均 一 、反 应 灵 敏 、 可 标 准 化 等 特 点 ， 还 可 进 行 工 业 化 大 生 产 。 单 克 隆 抗 体 可 用 于 疾 病 诊 断 、 体 内 显 像 定 位 检 查 、体 内 治 疗 或 靶 向 治 疗 、 食 品 与 环 境 监 测 以 及 天 然 蛋 白与 基 因 工 程 产 品 的 提 纯 等 。 世 界 各 国 已 制 备 万 种 单 克隆 抗 体 。 现 已 有 百 余 种 诊 断 试 剂 和 数 种 治 疗 剂 投 放 市场 。 2、 单 克 隆 抗 体 的 工 业 化 生 产 单 克 隆 抗 体 的 生 产 包 括 细 胞 培 养 、 提 纯 和 制 剂 等工 艺 过 程 。（ 1） 杂 交 瘤 细 胞 的 大 规 模 培 养 单 克 隆 抗 体 问 世 后 ， 已 研 究 了 多 种 适 宜 于 大 规 模培 养 杂 交 瘤 细 胞 的 生 物 反 应 器 （ 细 胞 培 养 罐 ） 及 其 培养 基 。 目 前 比 较 成 熟 的 发 酵 罐 有 气 升 式 或 深 层 发 酵 罐 ，中 空 纤 维 培 养 罐 ， 微 囊 或 滴 珠 发 酵 罐 。 牛 淋 巴 液 大 规 模 培 养 技 术 （ mass culturing technique， MCT） 也 是 较 成 熟 的 适 合 于 杂 交 瘤 细 胞大 规 模 培 养 的 方 法 。 用 牛 淋 巴 液 体 外 循 环 法 生 产 单 克 隆 抗 体 的 步 骤 ： 在 无 菌 条 件 下 ， 自 牛 颈 部 引 出 牛 胸 导 管 、 淋 巴管 至 无 菌 室 ； 使 淋 巴 细 胞 与 淋 巴 液 分 开 ； 将 滤 出 的 细 胞 与 部 分 淋 巴 液 送 回 牛 静 脉 管 内 ，无 细 胞 淋 巴 液 经 超 滤 后 进 入 培 养 罐 进 行 循 环 ， 并 按 比例 加 入 培 养 液 （ 培 养 液 应 通 过 一 层 微 孔 半 透 膜 过 滤 后再 进 入 培 养 罐 ） 。 杂 交 瘤 细 胞 培 养 产 生 的 单 克 隆 抗 体 培 养 液 的 20通 过 另 一 端 的 半 透 膜 流 出 培 养 罐 ， 每 日 收 获 单 克 隆 抗体 ， 其 他 80 再 循 环 。 （ 2） 单 抗 的 分 离 纯 化 无 论 用 动 物 腹 水 ， 还 是 用 发 酵 罐 生 产 单 克 隆 抗 体 ，产 品 的 分 离 纯 化 均 十 分 重 要 。 目 前 常 用 的 方 法 有 超 滤法 、 盐 析 法 ， 离 子 交 换 层 析 法 、 等 电 聚 焦 层 析 法 、 葡萄 球 菌 蛋 白 A层 析 法 、 HPLC、 DEAF C层 析 法 、 葡聚 糖 或 琼 脂 糖 法 等 。（ 3） 单 克 隆 抗 体 的 制 剂 技 术 即 将 纯 化 的 单 克 隆 抗 体 制 备 成 诊 断 试 剂 或 新 药 。常 用 于 制 备 单 克 隆 抗 体 制 剂 的 物 质 有 高 聚 物 、 脂 质 体 、聚 乙 二 醇 、 细 胞 膜 等 。 导 向 高 聚 物 是 表 面 包 裹 着 特异 单 克 隆 抗 体 的 高 聚 物 小 珠 ， 可 用 于 移 植 ， 癌 症 治 疗和 体 内 定 位 诊 断 。 三 、 植 物 细 胞 工 程 制 药 技 术 基 础（ 一 ） 植 物 组 织 和 细 胞 培 养 的 基 本 概 念 1、 植 物 组 织 细 胞 无 菌 培 养 技 术 类 型 植 物 组 织 和 细 胞 是 指 在 无 菌 和 人 工 控 制 的 营 养（ 培 养 基 ） 及 环 境 条 件 （ 光 照 、 温 度 等 ） 下 ， 研 究 植物 的 细 胞 、 组 织 和 器 官 以 及 控 制 其 生 长 发 育 的 技 术 。 植 物 无 菌 培 养 技 术 有 以 下 几 类 ： 幼 苗 及 较 大 植 株 的 培 养 ， 即 为 “ 植 物 培 养 ”（ plant culture） ； 从 植 物 各 种 器 官 的 外 植 体 增 殖 而 形 成 的 愈 伤 组织 的 培 养 叫 做 “ 愈 伤 组 织 培 养 ” ； 能 够 保 持 较 好 分 散 性 的 离 体 细 胞 或 较 小 细 胞 团的 液 体 培 养 ， 称 为 “ 悬 浮 培 养 ” ； 离 体 器 官 的 培 养 ， 如 茎 尖 、 根 尖 、 叶 片 、 花 器官 各 部 分 原 基 或 未 成 熟 的 花 器 官 各 部 分 以 及 未 成 熟果 实 的 培 养 ， 称 为 “ 器 官 培 养 ” ； 未 成 熟 或 成 熟 的 胚 胎 的 离 体 培 养 ， 则 为 “ 胚 胎培 养 ” 。 2、 悬 浮 培 养 悬 浮 培 养 是 指 在 液 体 培 养 基 中 ， 能 够 保 持 良 好 分散 性 的 细 胞 和 小 的 细 胞 聚 集 体 的 培 养 。 在 此 培 养 条 件下 组 织 水 平 较 低 。 3、 细 胞 培 养 细 胞 培 养 是 指 利 用 单 个 细 胞 进 行 液 体 或 固 体 培 养 ，诱 导 其 增 殖 及 分 化 。 其 目 的 是 为 了 得 到 单 细 胞 无 性繁 殖 系 。 4、 分 生 组 织 培 养 分 生 组 织 培 养 又 称 生 长 锥 培 养 ， 是 指 在 人 工 培 养基 上 培 养 茎 端 分 生 组 织 细 胞 。 分 生 组 织 如 茎 尖 分 生 组织 的 部 位 仅 限 于 顶 端 圆 锥 区 ， 其 长 度 不 超 过 1mm。 研 究 表 明 ， 通 过 组 织 培 养 技 术 进 行 植 物 的 快 速 繁殖 试 验 往 往 并 没 有 利 用 这 么 小 的 外 植 体 ， 而 是 利 用较 大 的 茎 尖 组 织 ， 通 常 包 括 l 2个 原 基 。 5、 外 植 体 组 织 培 养 外 植 体 是 指 用 于 植 物 组 织 （ 细 胞 ） 培 养 的 器 官 或组 织 （ 的 切 段 ） ， 植 物 的 各 部 位 如 根 、 茎 、 叶 、 花 、果 、 穗 、 胚 珠 、 胚 乳 、 花 药 和 花 粉 等 均 可 作 为 外 植 体进 行 组 织 培 养 。6、 器 官 形 成 培 养 器 官 形 成 一 般 是 指 在 组 织 培 养 或 悬 浮 培 养 中 芽 、 根或 花 等 器 官 的 分 化 与 形 成 。 或 者 在 先 形 成 的 小 根 基 部迅 速 形 成 愈 伤 组 织 ， 然 后 再 形 成 芽 ； 或 者 在 不 同 部 位分 别 形 成 芽 和 根 之 后 ， 再 形 成 维 管 组 织 而 将 二 者 连 成一 个 轴 ， 最 后 形 成 小 植 株 。 如 果 在 培 养 过 程 中 小 植 株 的 发 生 途 径 与 正 常 的 受精 卵 发 育 方 式 极 为 近 似 时 ， 通 常 称 为 “ 胚 胎 形 成 ” 。 当 在 体 细 胞 或 花 药 培 养 中 培 养 物 是 小 孢 子 这 样 的 单倍 体 细 胞 ， 其 所 形 成 的 胚 胎 结 构 叫 做 “ 胚 状 体 ” 或“ 不 定 胚 ” 。（ 二 ） 植 物 组 织 和 细 胞 培 养 所 用 的 培 养 基 培 养 基 实 际 上 是 植 物 离 体 器 官 、 组 织 或 细 胞 等 的“ 无 菌 土 壤 ” ， 其 特 点 是 营 养 成 分 力 可 调 控 性 。 植 物 组 织 和 细 胞 培 养 所 用 培 养 基 种 类 较 多 。 但 通常 都 含 有 无 机 盐 、 碳 源 、 有 机 氮 源 、 植 物 生 长 激 素 、维 生 素 等 化 学 成 分 。 应 用 最 广 的 是 MS培 养 基 和 LS培养 基 。 MS培 养 基 含 两 类 成 分 ： 无 机 元 素 ， 如 N、 P、 K、 Ca、 Fe、 Mg、 Cu、Mn、 Zn、 B、 Ho、 I等 ； 有 机 元 素 ， 如 维 生 素 B1、 B6 、 烟 酸 、 肌 醇 、 氨基 酸 、 蔗 糖 等 ， 在 培 养 基 中 ， 一 些 必 需 元 素 ， 如 N、 P、 K、 Ca、Mg等 的 加 入 与 否 及 其 浓 度 的 高 低 与 组 分 的 相 对 浓 度对 培 养 基 结 果 都 有 重 大 影 响 。 在 植 物 组 织 培 养 过 程 中 激 素 的 作 用 非 常 重 要 ， 如果 没 有 激 素 存 在 ， 细 胞 就 不 能 快 速 分 裂 甚 至 不 分 裂 。 组 织 培 养 的 优 势 就 在 于 让 植 物 细 胞 快 速 分 裂 ， 在短 期 内 产 生 大 量 细 胞 ， 从 而 实 现 快 速 繁 殖 的 目 的 。 其次 激 素 对 于 组 织 的 器 官 和 胚 状 体 形 成 起 着 重 要 而 明 显的 调 节 作 用 。 其 中 影 响 最 显 著 的 是 生 长 素 和 细 胞 分 裂素 。 有 时 也 使 用 赤 霉 素 （ G A） 、 脱 落 酸 （ ABA） 、乙 烯 以 及 其 他 人 工 合 成 的 生 长 调 节 物 质 。 其 中 生 长 素 包 括 ： 吲 哚 乙 酸 （ IAA） 、 萘 乙 酸（ NAA） 、 2， 4 二 氯 乙 氧 苯 酸 （ 2， 4 D） 、 吲 哚丁 酸 （ IBA） 。 细 胞 分 裂 素 包 括 ： 激 动 素 （ KT） 、 6 苄 基 腺 嘌呤 （ 6 BA） 、 玉 米 素 （ ZT） 等 。 一 般 认 为 形 成 的 器 官 的 类 型 受 培 养 基 中 这 两 种 激素 的 相 对 浓 度 的 控 制 ， 较 高 浓 度 的 生 长 素 有 利 于 根的 形 成 而 抑 制 芽 的 形 成 ； 相 反 ， 较 高 浓 度 的 细 胞 分裂 素 则 促 进 芽 的 形 成 而 抑 制 根 的 形 成 。（ 三 ） 培 养 材 料 与 培 养 方 式 植 物 的 根 、 茎 、 叶 、 花 、 果 实 、 种 子 、 髓 等 组 织或 器 官 都 可 用 来 诱 导 愈 伤 组 织 。 在 实 际 工 作 中 往 往 是 在 生 长 活 跃 的 部 位 取 材 ， 进 行愈 伤 组 织 的 培 养 ， 此 时 可 以 进 行 各 种 培 养 基 的 选 择 ，经 过 一 段 时 间 的 培 养 ， 可 以 选 择 出 适 当 的 培 养 基 作 为以 后 培 养 的 基 本 培 养 基 。 等 愈 伤 组 织 长 大 后 ， 转 移到 液 体 培 养 基 中 进 行 振 荡 ， 分 离 细 胞 。 一 般 愈 伤 组 织 不 会 很 好 地 分 散 成 理 想 的 单 细 胞 悬浮 液 ， 大 多 为 50 200个 细 胞 组 成 的 细 胞 团 。 上 述 培 养 出 来 的 细 胞 悬 浮 液 是 异 源 的 ， 为 了 进 一步 得 到 均 一 的 无 性 细 胞 ， 可 以 在 这 种 悬 浮 培 养 基 的 基础 上 ， 当 细 胞 分 散 程 度 和 迅 速 生 长 达 到 一 定 阶 段 后 ，利 用 平 板 培 养 技 术 进 行 细 胞 无 性 系 分 离 。 即 细 胞 悬 浮 液 通 常 通 过 双 层 不 锈 钢 网 或 尼 龙 网 除去 细 胞 聚 集 体 ， 将 滤 过 的 细 胞 液 与 选 定 的 琼 脂 培 养 基在 35 左 右 下 混 合 ， 浇 到 培 养 皿 上 使 其 形 成 一 薄 层 ，当 琼 脂 冷 却 凝 固 后 ， 细 胞 就 比 较 均 匀 地 分 布 并 固 定 在琼 脂 培 养 基 中 。 此 方 法 也 称 单 细 胞 培 养 。 在 做 平 板 培养 基 时 一 个 关 键 的 问 题 是 细 胞 密 度 应 以 10 3/ml为 宜 。 小 规 模 培 养 可 选 择 大 小 适 当 的 三 角 瓶 （ 502000ml） ， 里 面 有 选 定 的 培 养 基 ， 把 筛 选 好 的 细 胞 株接 入 以 后 ， 旋 转 培 养 （ 50 l50r min） ， 4周 后 可 进行 继 代 培 养 。 若 采 用 固 体 培 养 ， 在 培 养 基 中 加 入 0 7 0 9 琼 脂 。 大 规 模 培 养 方 式 主 要 是 液 体 悬 浮 培 养 法 ， 培 养 容器 用 桨 式 搅 拌 罐 、 空 气 气 升 式 反 应 器 。 为 了 保 证 细 胞 系 的 生 产 稳 定 ， 已 研 究 了 多 种 适 宜的 培 养 方 式 ， 简 介 如 下 ： （ 1） 二 步 法 从 许 多 植 物 细 胞 培 养 与 次 生 产 物 的 形成 来 看 ， 生 物 合 成 作 用 往 往 在 细 胞 生 长 的 后 期 ， 据 此提 出 二 步 培 养 法 。 第 一 步 培 养 基 称 为 生 长 培 养 基 ， 主要 适 合 于 细 胞 的 生 长 ； 第 二 步 称 为 合 成 培 养 基 ， 用 于次 生 产 物 的 合 成 。 两 种 培 养 基 往 往 有 所 区 别 ， 后 者 通 常 具 有 较 低 含 量的 硝 酸 盐 或 磷 酸 盐 ， 或 两 者 含 量 均 较 低 。 此 外 ， 通 常也 含 有 较 低 的 糖 分 或 少 量 可 利 用 的 碳 源 。 （ 2） 固 定 化 培 养 将 悬 浮 培 养 的 植 物 细 胞 包 埋 于 固 体基 质 中 ， 成 为 一 个 固 定 的 生 物 反 应 系 统 。 包 埋 的 基 质可 为 多 糖 和 多 聚 化 合 物 ， 如 褐 藻 酸 盐 、 琼 脂 （ 糖 ） 、聚 丙 烯 酰 胺 、 角 叉 菜 胶 。 由 于 这 些 支 持 物 胶 体 本 身 的 交 联 方 式 ， 使 之 对 养料 、 水 分 及 气 体 有 一 定 的 通 透 性 ， 在 不 同 程 度 上 维 持细 胞 的 生 物 活 力 ， 从 而 保 证 进 行 生 化 反 应 的 酶 系 和 辅助 因 子 的 存 在 。 基 于 此 原 理 ， 在 细 胞 产 生 次 生 产 物 的 时 期 ， 就 将其 固 定 化 ， 加 以 营 养 介 质 及 底 物 进 行 反 应 ， 将 其 制 成颗 粒 状 ， 注 入 柱 式 反 应 器 ， 就 可 以 进 行 连 续 循 环 反 应 。通 过 固 定 化 细 胞 进 行 连 续 培 养 是 实 现 商 业 化 生 产 的 有效 途 径 。 （ 3） 代 谢 产 物 胞 外 释 放 由 于 大 部 分 有 用 的 次 生 代 谢物 并 不 释 放 到 培 养 基 中 ， 而 是 储 存 于 液 泡 中 ， 传 统 的提 取 药 用 次 生 代 谢 物 的 方 法 始 于 破 碎 细 胞 ， 使 细 胞 只能 一 次 性 的 使 用 。 解 决 储 存 液 泡 中 的 次 生 代 谢 物 使 之释 放 到 胞 外 ， 也 是 通 过 固 定 化 细 胞 进 行 连 续 培 养 要 解决 的 一 个 主 要 问 题 。 已 发 展 出 了 化 学 试 剂 法 、 改 变 离 子 强 度 法 、 pH 扰 动法 、 电 击 法 等 。（ 4） 两 相 培 养 技 术 即 在 培 养 基 中 引 入 第 二 相 ， 细 胞产 物 在 原 培 养 系 统 合 成 后 ， 向 第 二 相 富 集 ， 从 而 减 少了 产 物 的 反 馈 抑 制 ， 不 仅 提 高 了 产 量 ， 而 且 简 化 了 后处 理 。 （ 四 ） 植 物 细 胞 大 规 模 培 养 的 生 物 反 应 器 特 点 反 应 器 的 选 择 取 决 于 生 产 细 胞 的 密 度 、 通 气 量 以及 营 养 成 分 的 分 散 程 度 。 常 用 的 反 应 器 3种 类 型 。 1、 摇 瓶 气 体 和 营 养 成 分 的 均 匀 分 布 通 过 振 荡 而 实 现 搅 拌目 的 。 2、 搅 拌 型 生 物 反 应 器 通 过 不 同 类 型 搅 拌 器 的 灵 活 应 用 有 利 于 植 物 培 养的 高 度 混 合 ， 反 应 器 内 的 温 度 、 溶 氧 以 及 营 养 物 浓 度易 控 制 ， 实 验 结 果 显 示 浆 型 搅 拌 器 适 用 于 植 物 细 胞 培养 。 3 鼓 泡 塔 生 物 反 应 器 与 气 升 式 生 物 反 应 器 这 类 反 应 器 通 过 外 部 循 环 泵 或 压 缩 空 气 作 为 动 力 ，使 反 应 器 内 的 培 养 物 上 下 混 合 。 （ 1） 鼓 泡 塔 生 物 反 应 器 鼓 泡 塔 生 物 反 应 器 是 通 过 反应 器 底 部 的 喷 嘴 及 多 孔 板 而 实 气 体 分 散 。 鼓 泡 塔 生 物 反 应 器 主 要 优 点 是 ： 没 有 运 动 部 件 ，操 作 不 易 染 菌 ， 在 无 机 械 能 输 入 情 况 下 ， 提 供 了 较 高的 热 量 和 质 量 传 递 ； 适 用 于 对 剪 切 敏 感 性 细 胞 的 培 养 ，放 大 相 对 容 易 。 缺 点 是 混 合 不 匀 ， 缺 乏 有 关 反 应 器 内的 非 牛 顿 流 体 的 流 动 与 传 递 特 性 的 数 据 等 。 （ 2） 气 升 式 生 物 反 应 器 气 升 式 生 物 反 应 器 有 内 循 环式 和 外 循 环 式 两 种 类 型 。 其 培 养 物 流 动 性 比 鼓 泡 塔 更为 均 匀 。 气 升 式 生 物 反 应 器 是 植 物 细 胞 培 养 最 合 适的 反 应 器 之 一 ， 可 以 在 低 剪 切 下 达 到 较 好 的 混 合 和 较高 的 氧 传 递 效 果 。 而 且 不 易 污 染 ， 操 作 费 用 也 较 低 。4、 转 鼓 式 生 物 反 应 器 转 鼓 式 生 物 反 应 器 是 通 过 转 动 促 进 反 应 器 内 的 氧及 营 养 物 的 混 合 ， 设 置 挡 板 有 助 于 提 高 氧 的 传 递 ，在 高 密 度 培 养 时 有 高 的 传 氧 能 力 ， 在 高 密 度 培 养 时 ，转 鼓 式 优 于 搅 拌 式 。 其 缺 点 是 难 于 大 规 模 放 大 。 四 、 酶 工 程 制 药 技 术 基 础（ 一 ） 酶 工 程 技 术 酶 工 程 是 酶 学 与 工 程 学 互 相 渗 透 结 合 ， 发 展 形 成的 生 物 技 术 ， 它 研 究 酶 和 应 用 酶 的 特 异 催 化 功 能 ， 并通 过 工 程 化 过 程 将 相 应 原 料 转 化 成 所 需 产 物 的 技 术 。 除 了 第 一 代 酶 酶 制 剂 和 第 二 代 酶 一 固 定 化 酶 的广 泛 应 用 外 ， 第 三 代 酶 ， 即 包 括 辅 助 因 子 再 生 系 统 在内 的 多 酶 反 应 器 也 已 取 得 迅 速 发 展 。 酶 工 程 的 主 要 内 容 包 括 酶 的 生 产 、 分 离 、 纯 化 、酶 的 固 定 化 、 酶 与 固 定 化 酶 的 反 应 器 以 及 酶 与 固 定 化酶 的 应 用 等 。 随 着 生 物 技 术 与 生 物 制 造 业 的 深 入 发 展 ， 当 前 酶 工程 技 术 的 主 要 研 究 方 向 是 ： 酶 的 分 离 、 纯 化 和 工 业 化 生 产 以 及 新 酶 的 发 现 与应 用 ； 酶 和 细 胞 的 固 定 化 技 术 与 酶 反 应 器 （ 包 括 酶 传 感器 ） 的 研 究 ； 基 因 工 程 与 蛋 白 质 工 程 技 术 在 酶 的 分 子 设 计 与 酶生 产 中 的 应 用 ； 有 机 相 中 酶 促 反 应 的 研 究 与 应 用 ； 酶 的 抑 制 剂 ， 激 活 剂 的 开 发 与 应 用 研 究 ； 抗 体 酶 与 核 酶 的 研 究 与 应 用 ； 模 拟 酶 、 合 成 酶 及 酶 分 子 的 人 工 设 计 、 合 成 研究 。 （ 二 ） 固 定 化 酶 的 概 念 和 优 点 固 定 化 酶 是 指 借 助 于 物 理 和 化 学 的 方 法 把 酶 束 缚在 一 定 空 间 内 并 具 有 催 化 活 性 的 酶 制 剂 ， 是 近 代 酶工 程 技 术 的 主 要 研 究 领 域 。 广 义 的 固 定 化 酶 又 包 括 固定 化 酶 和 固 定 化 细 胞 两 类 。（ 三 ） 固 定 化 酶 的 制 备 方 法 酶 的 固 定 化 方 法 有 下 述 4种 ： 吸 附 法 ； 包 埋 法 ； 交 联 法 ； 共 价 键 结 合 法 。 1、 吸 附 法 吸 附 法 分 为 物 理 吸 附 法 和 离 子 吸 附 法 。 用 物 理 吸附 法 制 成 固 定 化 酶 ， 酶 活 力 损 失 很 少 。 但 附 着 在 载 体上 的 酶 ， 易 于 脱 落 ， 实 用 价 值 少 。 离 子 吸 附 法 是 将 酶 与 含 有 离 子 交 换 剂 的 非 水 溶 性 载体 相 结 合 ， 酶 吸 附 于 载 体 上 较 为 牢 固 ， 在 工 业 上 用 途颇 广 。 离 子 吸 附 法 常 用 的 载 体 有 ： 阴 离 子 交 换 剂 ； 阳 离 子 交 换 剂 用 于 物 理 吸 附 法 的 载 体 有 高 岭 土 磷 酸 钙 凝 胶 、 多 孔玻 璃 、 氧 化 铝 、 硅 胶 羟 基 磷 灰 石 、 纤 维 素 、 胶 原 、 淀粉 等 。 2、 包 埋 法 包 埋 法 又 分 为 凝 胶 包 埋 法 及 微 囊 化 包 埋 法 两 类 。 凝 胶 包 埋 法 是 将 酶 或 细 胞 限 制 于 高 聚 物 网 格 中 ；微 囊 化 法 是 将 酶 或 细 胞 定 位 于 不 同 构 型 膜 外 壳 内 。 （ 六 ） 固 定 化 酶 生 物 反 应 器 的 主 要 类 型 反 应 器 的 形 式 很 多 ， 根 据 进 料 和 出 料 的 方 式 ， 可概 括 分 为 间 歇 式 和 连 续 式 两 大 类 ， 后 者 又 有 两 种 基 本形 式 ： 连 续 流 动 搅 拌 罐 式 反 应 器 和 填 充 床 反 应 器 ； 还 有 一 些 衍 生 形 式 ： 连 续 流 动 搅 拌 罐 超 滤 膜 反应 器 、 循 环 反 应 器 和 流 化 床 反 应 器 等 。 第 四 节 生 物 制 药 中 试 放 大 工 艺 设 计 一 、 生 物 制 药 中 试 放 大 工 艺 特 点（ 一 ） 中 试 放 大 实 验 的 目 的 当 实 验 室 研 究 工 作 进 行 到 一 定 阶 段 ， 就 应 考 虑 中试 放 大 ， 以 验 证 实 验 室 工 艺 路 线 的 可 行 性 以 及 在 实 验室 阶 段 难 以 解 决 或 尚 未 发 现 的 问 题 。 通 过 中 试 研 究 要 达 到 三 个 基 本 要 求 ： 建 立 稳 定 的 制 造 规 程 为 正 式 生 产 提 供 多 种 必 要 的工 艺 条 件 与 参 数 ； 为 临 床 前 研 究 与 临 床 实 验 的 评 价 提 供 足 量 的 合 格产 品 ； 拟 定 符 合 G MP要 求 的 制 造 规 程 与 检 定 规 程 ， 保证 有 足 量 的 合 格 受 试 药 物 衡 定 供 应 临 床 实 验 ， 而 且 用于 临 床 前 试 验 和 临 床 试 验 的 受 试 药 物 应 当 具 有 完 全 一样 的 品 质 。 还 要 确 定 采 用 与 临 床 实 验 所 用 药 品 的 相 同 制 造 工艺 ， 以 保 证 在 日 后 生 产 中 的 产 品 与 供 临 床 实 验 所 用 药品 的 品 质 相 同 。 因 为 生 产 工 艺 的 任 何 变 更 都 可 能 潜 在 性 地 改 变 最新 产 品 的 特 性 （ 包 含 有 效 成 分 和 杂 质 的 变 化 ） 。 （ 二 ） 进 入 中 试 应 具 备 的 条 件 实 验 进 行 到 什 么 阶 段 才 能 进 入 中 试 ？ 尚 难 制 定 一个 标 准 。 但 除 了 人 为 因 素 外 ， 至 少 下 列 一 些 内 容 在 进入 中 试 前 应 该 基 本 具 备 。 收 率 稳 定 ， 质 量 可 靠 ； 操 作 条 件 已 经 确 定 ； 产 品 ， 中 间 体 及 原 料 的 分析 方 法 已 经 指 定 ； 生 物 材 料 的 资 源 （ 包 括 菌 种 、 细 胞 株 等 ） 已 确定 并 已 系 统 鉴 定 ； 进 行 过 物 料 平 衡 ， “ 三 废 ” 问 题 己 有 初 步 的 处理 方 法 ； 提 出 中 试 规 模 及 所 需 原 辅 料 的 规 格 和 数 量 ； 提 出 安 全 生 产 的 要 求 。 根 据 上 述 要 求 ， 在 考 察 工 艺 条 件 的 研 究 阶 段 中 ，必 须 注 意 和 解 决 下 列 问 题 。 1、 原 辅 材 料 规 格 的 过 渡 实 验 在 小 试 后 ， 一 般 采 用 的 原 辅 材 料 （ 如 原 料 、 试 剂 、溶 剂 、 纯 化 载 体 等 ） 规 格 较 高 ， 目 的 是 为 了 排 除 原 料中 所 含 杂 质 的 不 良 影 响 ， 从 而 保 证 实 验 结 果 的 准 确 性 。但 是 当 工 艺 各 线 确 定 之 后 ， 在 进 一 步 考 察 工 艺 条 件 时 ，应 尽 量 改 用 大 规 模 生 产 时 容 易 得 到 的 原 辅 材 料 。 为 此 ， 应 考 察 某 些 工 业 规 格 的 原 辅 材 料 所 含 杂 质对 反 应 收 率 和 产 品 质 量 的 影 响 ， 制 定 原 辅 材 料 质 量 标准 ， 规 定 各 种 杂 质 的 允 许 限 度 。 2、 设 备 选 型 与 材 料 质 量 实 验 在 小 试 阶 段 ， 大 部 分 实 验 是 在 小 型 玻 璃 仪 器 中 进行 ， 但 在 工 业 生 产 中 ， 物 料 要 接 触 到 各 种 设 备 材 料 ， 有 时 某 种 材 质 对 某 一 反 应 有 极 大 影 响 ， 甚 至 使 整个 反 应 无 法 进 行 。 故 在 中 试 时 ， 要 对 设 备 材 料 的 质 量及 设 备 的 选 型 进 行 实 验 ， 为 工 业 化 生 产 提 供 数 据 。3、 反 应 条 件 限 度 实 验 反 应 条 件 限 度 实 验 可 以 找 到 最 适 宜 的 工 艺 条 件（ 如 培 养 基 种 类 、 反 应 温 度 、 压 力 、 pH等 ） ， 一 般 均有 一 个 许 可 范 围 。 有 些 反 应 对 工 艺 条 件 要 求 很 严 ， 超过 一 定 限 度 后 ， 就 会 造 成 重 大 损 失 。 在 这 种 情 况 下 ，应 进 行 工 艺 条 件 的 限 度 实 验 ， 以 全 面 掌 握 反 应 规 律 。 4、 原 辅 材 料 ， 中 间 体 及 产 品 质 量 分 析 方 法 研 究 在 生 物 制 药 工 艺 研 究 中 ， 有 许 多 原 辅 材 料 ， 尤 其是 中 间 体 和 新 产 品 均 无 现 成 分 析 方 法 ， 因 此 ， 必 须 研究 它 们 的 鉴 定 方 法 ， 以 便 制 定 简 便 易 行 ， 准 确 可 靠 的检 验 方 法 。5、 下 游 工 艺 的 研 究 在 生 物 制 药 工 艺 中 ， 上 游 工 艺 固 然 十 分 重 要 ， 如基 因 克 隆 、 细 胞 融 合 、 微 生 物 选 育 等 ， 是 生 物 药 物 生产 的 源 泉 ， 下 游 工 艺 包 括 产 品 的 提 取 、 分 离 、 纯 化 ，母 液 处 理 ， 溶 剂 回 收 等 生 化 工 程 操 作 是 产 品 的 收 率 、质 量 及 经 济 效 益 好 坏 的 关 键 所 在 。 因 此 必 须 研 究 尽 量简 化 的 下 游 工 艺 操 作 ， 采 用 新 工 艺 、 新 技 术 和 新 设 备 ，以 提 高 劳 动 生 产 率 ， 降 低 成 本 。 二 、 中 试 放 大 方 法 与 内 容（ 一 ） 中 试 放 大 方 法 中 试 放 大 的 方 法 有 经 验 放 大 法 ， 相 似 放 大 法 和 数学 模 型 放 大 法 。 制 药 工 艺 研 究 中 试 放 大 主 要 采 用 经 验放 大 法 ， 这 是 化 工 科 研 中 采 用 的 主 要 方 法 。 中 试 放 大 程 序 ， 首 先 应 弄 清 楚 中 试 放 大 过 程 中 出现 的 一 些 问 题 ， 是 属 于 原 料 问 题 ， 工 艺 问 题 ， 操 作 问题 ， 还 是 设 备 问 题 。 常 用 的 方 法 是 同 时 进 行 小 试 与 中试 做 对 照 实 验 ， 逐 一 排 除 各 种 变 动 因 素 。 进 行 小 试 的 人 员 参 加 中 试 研 究 对 发 现 与 解 决 中 试出 现 的 问 题 是 有 利 的 。 （ 二 ） 中 试 放 大 内 容 为 了 评 价 生 物 新 药 ， 必 须 生 产 出 足 够 量 的 受 试 药物 供 临 床 前 研 究 和 临 床 试 验 。 在 开 始 临 床 试 验 前 设计 的 工 艺 路 线 十 分 重 要 ， 该 工 艺 必 须 经 过 中 试 放 大 ，并 经 优 化 而 确 定 ， 临 床 前 研 究 与 临 床 试 验 所 用 样 品应 采 用 同 一 工 艺 生 产 ， 尤 其 临 床 实 验 所 用 产 品 的 制造 工 艺 应 与 大 规 模 生 产 最 终 上 市 产 品 的 生 产 工 艺 一致 ， 以 确 保 上 市 产 品 的 有 效 性 与 安 全 性 。 新 药 投 产 后 ， 如 对 生 产 工 艺 需 要 进 行 变 更 ， 应 通过 科 学 实 验 ， 获 得 可 靠 资 料 后 ， 重 新 向 药 品 监 督 管 理部 门 申 报 工 艺 改 进 操 作 与 质 控 标 准 。 中 试 放 大 研 究 总 结 内 容 主 要 有 ： 工 艺 路 线 与 各 步 反 应 方 法 的 最 后 确 定 ； 设 备 材 质 与 型 号 的 选 择 ； 反 应 器 的 规 模 选 择 及 反 应 搅 拌 器 型 式 与 搅 拌 速度 的 考 查 。 生 产 反 应 条 件 的 研 究 ； 工 艺 流 程 与 操 作 方 法 的 确 定 ； 物 料 衡 算 ； 安 全 生 产 与 “ 三 废 ” 防 治 措 施 研 究 ； 原 辅 材 料 、 中 间 体 的 物 理 性 质 和 化 工 常 数 的 测定 ； 原 辅 材 料 、 中 间 体 质 量 标 准 的 制 定 ； 消 耗 定 额 、 原 料 成 本 、 操 作 工 时 与 生 产 周 期 等的 计 算 。 中 试 放 大 完 成 后 ， 根 据 中 试 总 结 报 告 与 生 产 任 务等 可 进 行 基 建 设 计 ， 制 定 定 型 设 备 选 购 计 划 及 非 标 设备 的 设 计 ， 制 造 。 然 后 按 照 施 工 图 进 行 车 间 的 厂 房 建 筑 和 设 备 安 装 。三 全 部 生 产 设 备 和 辅 助 设 备 安 装 完 成 后 ， 如 试 车 合 格 ，生 产 稳 定 ， 即 可 制 定 生 产 工 艺 规 程 ， 交 付 生 产 。