《RNA转录》PPT课件

生 物 化 学多 媒 体 课 件 试 用 版杭 医 第 十 一 章( RNA Biosynthesis, Transcription )RNA的 生 物 合 成 转 录Biochemistry DepartmentDepartment of Basic Medical SciencesHangzhou Normal UniversityGuyisheng 2021-5-28 2 转 录 (transcription) 是 生 物 体 以 DNA为模 板 合 成 RNA的 过 程 。 转录 RNADNA 2021-5-28 3 RNA的 合 成 方 式 在 生 物 界 ， RNA合 成 有两 种 方 式 ： 一 是 DNA指导 的 RNA合 成 ， 此 为 生物 体 内 的 主 要 合 成 方 式。 另 一 种 是 RNA指 导 的RNA合 成 ， 此 种 方 式 常见 于 病 毒 。 转 录 产 生 的 初 级 转 录 本是 RNA前 体 （ RNA precursor） ， 需 经 加工 过 程 （ processing）方 具 有 生 物 学 活 性 。 复 制 和 转 录 的 区 别复 制 转 录模 板 两 股 单 链 模 板 链原 料 dNTP NTP酶 DNA聚 合 酶 RNA聚 合 酶产 物 子 代 双 链 DNA mRNA、 tRNA、 rRNA配 对 A-T、 G-C A-U、 T-A、 G-C引 物 有 无方 式 半 保 留 复 制 不 对 称 转 录加 工 不 需 复 制 后 加 工 转 录 后 需 要 加 工 2021-5-28 5 n 参 与 转 录 的 物 质 ：原 料 : NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模 板 : DNA酶 : RNA聚 合 酶 (RNA polymerase, RNA-pol)其 他 蛋 白 质 因 子 2021-5-28 6 DNA双 链 在 转 录 过 程 中 只 有 一 条 链 中 的 其中 某 一 活 化 基 因 片 段 起 作 用 ， 该 链 称 模 板 链（ template strand） ， 又 称 有 意 义 链 或 Watson链 ； 与 其 互 补 的 链 称 为 编 码 链 （ coding strand）， 又 称 反 义 链 或 Crick链 。 一 、 转 录 模 板转 录 生 成 的 RNA链 与 编 码 链 的 碱 基 序 列 相 似 ，以 U取 代 T第 一 节 原 核 生 物 的 转 录 模 板 和 酶Templates & Enzymes in Prokaryotic Transcription 2021-5-28 7 模 板 链 与 编 码 链5GCAGTACATGTC 33 c g t g a t g t a c a g 55GCAGUACAUGUC 3NAla Val His Val C 编 码 链模 板 链mRNA蛋 白 质转 录翻 译 2021-5-28 8 DNA分 子 上 转 录 出 RNA的 区 段 ， 称 为 结 构 基 因(structural gene)。不 对 称 转 录 ： 某 一 确 定 活 化 基 因 的 转 录 ， 只 能 以 DNA双 链的 一 条 链 作 为 模 板 ， 这 种 现 象 称 为 不 对 称 转录 （ asymmetric transcription） 。两 重 含 义 ： 一 是 指 双 链 DNA只 有 一 股 单 链 用 作 模 板 。 二 是 指 同 一 单 链 上 可 以 交 错 出 现 模 板 链 和编 码 链 。 2021-5-28 953 35模 板 链编 码 链 编 码 链模 板 链 结 构 基 因转 录 方 向 转 录 方 向n 不 对 称 转 录 2021-5-28 10 二 、 RNA聚 合 酶 (DNA dependent RNA polymerase, DDRP, RNA-pol)（ 一 ） RNA聚 合 酶 能 直 接 启 动 RNA链 的 合 成 DNA依 赖 的 RNA聚 合 酶 催 化 合 成 RNA； RNA合 成 的 化 学 机 制 与 DNA依 赖 的 DNA聚 合 酶 催 化 DNA合 成 相 似 。 ( NMP ) n + NTP ( NMP ) n+1 + PPiRNA 延 长 的 RNA 2021-5-28 11 DNA聚 合 酶 在 启 动 DNA链 延 长 时 需 要 引 物存 在 ， 而 RNA聚 合 酶 不 需 要 引 物 就 能 直 接启 动 RNA链 的 延 长 。 RNA聚 合 酶 和 DNA的 特 殊 序 列 启 动 子(promoter)结 合 后 ， 就 能 启 动 RNA合 成 。 2021-5-28 12 （ 二 ） RNA聚 合 酶 由 多 个 亚 基 组 成 36512 决 定 哪 些 基 因 被 转 录 150618 催 化 功 能 155613 结 合 DNA模 板 70263 辨 认 起 始 点亚 基 分 子 量 功 能大 肠 杆 菌 （ E.coli） RNA 聚 合 酶 ： 4种 亚 基 、 、 、 组 成 的 五 聚 体 蛋 白 质 ， 分 子 量 480 kD。 2021-5-28 13核 心 酶 （ core enzyme） ： 2 能 催 化 NTP按 模 板 的 指 引 合 成 RNA， 在 转 录延 长 全 过 程 中 均 起 作 用 全 酶 （ holoenzyme） ： 2 ， 即 亚 基 + 核 心 酶 亚 基 的 功 能 是 辨 认 转 录 起 始 点 ， 转 录 起 始 阶段 需 要 全 酶 2021-5-28 14 全 酶 (holoenzyme) 转 录 起 始 阶 段转 录 延 长 阶 段 核 心 酶 (core enzyme) 结 合 2021-5-28 15 三 、 RNA聚 合 酶 与 模 板 的 辨 认 结 合 转 录 是 不 连 续 、 分 区 段 进 行 的 。 每 一 转 录 区 段 可 视 为 一 个 转 录 单 位 ， 称为 操 纵 子 (operon)。 操 纵 子 包 括 若 干 个结 构 基 因 及 其 上 游 (upstream)的 调 控 序列 。53 35结 构 基 因调 控 序 列 RNA-polRNA聚 合 酶 结 合 模 板 DNA的 部 位 ， 称 为 启动 子 (promoter)。 2021-5-28 16 启 动 子 （ promotor） ： 调 控 序 列 中 的 启 动 子 是 RNA聚 合 酶 识 别 、 结合 并 开 始 转 录 的 一 段 DNA序 列 。 也 是 控 制 转录 的 关 键 部 位 。 原 核 生 物 以 RNA聚 合 酶 全 酶 结 合 到 DNA的 启动 子 上 而 起 动 转 录 ； 其 中 由 亚 基 辨 认 启 动子 ， 其 他 亚 基 相 互 配 合 。 启 动 子 序 列 按 功 能 的 不 同 可 分 为 三 个 部 位 ，即 起 始 部 位 、 结 合 部 位 、 识 别 部 位 。 2021-5-28 17 起 始 部 位 ： 指 DNA分 子 上 开 始 转 录 的 作 用 位 点 ，该 位 点 有 与 转 录 生 成 RNA链 的 第 一 个 核苷 酸 互 补 的 碱 基 ， 该 碱 基 的 序 号 为 +1。识 别 部 位 ： RNA 聚 合 酶 亚 基 的 识 别 部 位 。 中 心 部位 在 35bp处 ,该 序 列 的 碱 基 富 含 TTGACA。 2021-5-28 18 结 合 部 位 ： 是 DNA分 子 上 与 RNA聚 合 酶 的 核 心 酶 结 合 的部 位 ， 其 长 度 为 7bp， 中 心 部 位 在 10bp处 。 碱 基 序 列 具 有 高 度 保 守 性 ， 富 含 TATAAT序 列 ，故 称 之 为 TATA盒 （ TATA box） ， 又 称 普 里布 诺 序 列 （ Pribnow box） 。 该 序 列 中 富 含 AT碱 基 ， 维 持 双 链 结 合 的 氢 键相 对 较 弱 ， 导 致 该 处 双 链 DNA易 发 生 解 链 ，有 利 于 RNA聚 合 酶 的 结 合 。 2021-5-28 19 RNA 聚合酶保护法 2021-5-28 20开 始 转 录T T G A C AA A C T G T-35 区 (Pribnow box)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 区 1-30-50 10-10-40 -205 3 3 5 RNA-pol辨 认 位 点(recognition site) 5 5RNA聚 合 酶 保 护 区 结 构 基 因3 3n用 RNA聚 合 酶 保 护 法 研 究 转 录 起 始 区 结 合 2021-5-28 21 第 二 节 原 核 生 物 的 转 录 过 程The Process of Transcription in Prokaryote 大 肠 杆 菌 转 录 过 程 包 括 转 录 起 始 、 延 长、 终 止 三 步 。 2021-5-28 22 一 、 转 录 起 始 需 要 RNA聚 合 酶 全 酶 转 录 起 始 不 需 引 物 ， 两 个 与 模 板 配 对 的 相邻 核 苷 酸 ， 在 RNA-pol催 化 下 生 成 磷 酸 二酯 键 直 接 连 接 起 来 。 转 录 生 成 的 第 一 个 核苷 酸 总 是 GTP或 ATP ,以 GTP更 为 常 见 。 转 录 起 始 复 合 物 ： RNA聚 合 酶 的 全 酶 、DNA模 板 和 四 磷 酸 二 核 苷 酸 （ pppGpN-OH 3） 三 者 结 合 在 一 起 的 复 合 体 。 2. DNA双 链 局 部 解 开 ， 形 成 开 放 转 录 复 合 体(open transcription complex) ；1. RNA聚 合 酶 全 酶 (2)与 模 板 结 合 ， 形 成 闭合 转 录 复 合 体 (closed transcription complex) ；3. 在 RNA聚 合 酶 作 用 下 发 生 第 一 次 聚 合 反 应 ， 形成 转 录 起 始 复 合 物 ：RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3转 录 起 始 复 合 物 :5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppin 转 录 起 始 过 程 ： 2021-5-28 24 第 一 个 磷 酸 二 酯 键 生 成 后 ， 亚 基 即 从转 录 起 始 复 合 物 上 脱 落 ， 核 心 酶 连 同 四磷 酸 二 核 苷 酸 ， 继 续 结 合 于 DNA模 板 上， 酶 沿 DNA链 前 移 ， 进 入 延 长 阶 段 。 2021-5-28 25 n E.coli的 转 录 起 始 和 延 长 2021-5-28 26 二 、 原 核 生 物 的 转 录 延 长 时 蛋 白 质的 翻 译 也 同 时 进 行1. 亚 基 脱 落 ， RNApol聚 合 酶 核 心 酶 变 构， 与 模 板 结 合 松 弛 ， 沿 着 DNA模 板 前 移 ； 2. 在 核 心 酶 作 用 下 ， NTP不 断 聚 合 ， RNA链 不 断 延 长 。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi 转 录 空 泡 (transcription bubble)：RNA-pol （ 核 心 酶 ） DNA RNA 2021-5-28 28 转 录 空 泡 的 形 成 ： 转 录 空 泡 （ transcription bubble） ： 也 称 转 录复 合 物 ， 是 由 RNA聚 合 酶 的 核 心 酶 、 DNA模 板和 转 录 产 物 RNA三 者 结 合 在 一 起 的 复 合 体 。 RNA 聚 合 酶 亚 基 辨 认 启 动 子 识 别 部 位 。 在这 一 区 段 ， 酶 与 模 板 的 结 合 很 松 弛 ， 酶 随 即 移向 启 动 子 的 结 合 部 位 ， 并 跨 入 了 转 录 起 始 点 ，开 始 转 录 。 第 一 个 磷 酸 二 酯 键 生 成 后 ， 亚 基 从 转 录 起始 复 合 物 上 脱 落 ， 形 成 转 录 空 泡 。 核 心 酶 沿 模板 DNA前 移 ， 进 入 延 长 阶 段 。 n 转 录 延 长 ： 53 DNAn 原 核 生 物 转 录 过 程 中 的 羽 毛 状 现 象核 糖 体RNARNA聚 合 酶在 同 一 DNA模 板 上 ， 有 多 个 转 录 同 时 在 进 行 ；转 录 尚 未 完 成 ， 翻 译 已 在 进 行 。 这 种 形 状 说 明 ： 2021-5-28 31 依 赖 Rho 因 子 的 转 录 终 止 非 依 赖 Rho因 子 的 转 录 终 止 三 、 原 核 生 物 转 录 终 止 分 为 依 赖 (Rho)因子 与 非 依 赖 因 子 两 大 类n 依 据 是 否 需 要 蛋 白 质 因 子 的 参 与 ， 原核 生 物 转 录 终 止 分 为 ： 2021-5-28 32 因 子 是 由 相 同 亚 基 组 成 的 六 聚 体 蛋白 质 ， 亚 基 分 子 量 46kD。 因 子 能 结 合 RNA， 又 以 对 poly C的结 合 力 最 强 。 因 子 还 有 ATP酶 活 性 和 解 螺 旋 酶(helicase)的 活 性 。 （ 一 ） 依 赖 因 子 的 转 录 终 止n 因 子 ： 2021-5-28 33 n 因 子 的 作 用 原 理 ： 2021-5-28 34 目 前 认 为 ， 因 子 终 止 转 录 的 作 用 是 ：与 RNA转 录 产 物 结 合 ， 结 合 后 因 子 和RNA聚 合 酶 都 可 发 生 构 象 变 化 ， 从 而 使RNA聚 合 酶 停 顿 ， 解 螺 旋 酶 的 活 性 使DNA/RNA杂 化 双 链 拆 离 ， 利 于 产 物 从转 录 复 合 物 中 释 放 。 2021-5-28 35 因 子 DNARNARNA聚 合 酶 2021-5-28 36 （ 二 ） 非 依 赖 Rho因 子 的 转 录 终 止DNA模 板 上 靠 近 终 止 处 ， 有 些 特 殊 的碱 基 序 列 ， 转 录 出 RNA后 ， RNA产 物 形 成特 殊 的 结 构 来 终 止 转 录 。 RNA产 物 3 端 往 往 形 成 茎 环 结 构 ， 该结 构 阻 碍 RNA聚 合 酶 前 移 。 茎 环 结 构 后 有 一 串 寡 聚 U。 寡 聚 U有 利 于RNA不 再 依 附 DNA模 板 链 而 脱 出 。 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA UUUU. UUUU.近 终 止 区 的 转 录 产 物 形 成 发 夹 (hairpin)结 构是 非 依 赖 因 子 终 止 的 普 遍 现 象 。 2021-5-28 38n 茎 环 结 构 使 转 录 终 止 的 机 理 ： 使 RNA聚 合 酶 变 构 ， 转 录 停 顿 ； 使 转 录 复 合 物 趋 于 解 离 ， RNA产 物 释 放 。5pppG 5 3 35RNA-pol 2021-5-28 39 第 三 节 真 核 生 物 的 转 录 过 程The Process of Transcription in Eukaryote 真 核 生 物 的 转 录 过 程 比 原 核 复 杂 。 二 者的 转 录 起 始 过 程 有 较 大 区 别 ， 转 录 终 止也 不 相 同 。一 、 真 核 生 物 有 三 种 RNA聚 合 酶RNA聚 合 酶 （ RNA Pol ）RNA聚 合 酶 （ RNA Pol ）RNA聚 合 酶 （ RNA Pol ） 2021-5-28 40 真 核 生 物 的 RNA聚 合 酶种 类 I II III转 录 产 物 45s-rRNA hnRNA 5s-rRNA、 tRNA、 snRNA对 鹅 膏 蕈碱 的 反 应 耐 受 极 敏 感 中 度 敏 感 酶 图 2021-5-28 41 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 的 结 构 比 原 核 生 物 复 杂， 所 有 真 核 生 物 的 RNA聚 合 酶 都 有 两 个 不 同的 大 亚 基 和 十 几 个 小 亚 基 . RNA聚 合 酶 由 12个 亚 基 组 成 ， 其 最 大 的 亚基 称 为 RBP1。 RNA聚 合 酶 最 大 亚 基 的 羧 基 末 端 有 一 段 共有 序 列 (consensus sequence)为 Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的 重 复 序 列 片 段 ， 称 为 羧 基 末 端结 构 域 (carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD对 于 维 持 细 胞 的 活 性 是 必 需 的 。 2021-5-28 42 二 、 转 录 起 始 需 要 启 动 子 、 RNA聚 合 酶和 转 录 因 子 的 参 与（ 一 ） 转 录 起 始 前 的 上 游 区 段 具 有启 动 子 核 心 序 列 不 同 物 种 、 不 同 细 胞 或 不 同 的 基 因 ， 转 录起 始 点 上 游 可 以 有 不 同 的 DNA序 列 ， 但 这些 序 列 都 可 统 称 为 顺 式 作 用 元 件 (cis-acting element)。 真 核 生 物 的 转 录 起 始 上 游 区 段 比 原 核 生 物 多 样 化 转 录 起 始 时 ， RNA-pol不 直 接 结 合 模 板 ， 其 起 始过 程 比 原 核 生 物 复 杂 。 2021-5-28 43 顺 式 作 用 元 件 ：n 一 个 典 型 的 真 核 生 物 基 因 上 游 序 列 :5 3调 控 序 列 TATA盒 InrYYAN YYTA-30 +1TATAAA真 核 生 物 编 码 基 因 两 侧 的 DNA序 列 ， 可 影 响自 身 基 因 的 表 达 活 性【 DNA分 子 上 具 有 可 影 响 （ 调 控 ） 转 录 的 各种 组 分 】 2021-5-28 44 顺 式 作 用 元 件 包 括 启 动 子 、 启 动 子 上 游 元件 (upstream promoter elements 或 promoter-proximal elements)等 近 端 调 控 元件 和 增 强 子 (enhancer)等 远 隔 序 列 。 起 始 点 上 游 多 数 有 共 同 的 TATA序 列 ， 称为 Hognest盒 或 TATA盒 (TATA box)。 通 常认 为 这 就 是 启 动 子 的 核 心 序 列 。 2021-5-28 45 许 多 RNA聚 合 酶 II识 别 的 启 动 子 具 有 保 守 的共 有 序 列 ： 位 于 转 录 起 始 点 附 近 的 起 始 子(intiator， Inr) 。 启 动 子 上 游 元 件 是 位 于 TATA盒 上 游 的 DNA序 列 ， 多 在 转 录 起 始 点 约 -40 -100nt的 位 置， 比 较 常 见 的 是 GC盒 和 CAAT盒 。 增 强 子 是 能 够 结 合 特 异 基 因 调 节 蛋 白 ， 促进 邻 近 或 远 隔 特 定 基 因 表 达 的 DNA序 列 。 2021-5-28 46转 录 起 始 点TATA盒CAAT盒GC盒增 强 子 n 顺 式 作 用 元 件 (cis-acting element)AATAAA切 离 加 尾转 录 终 止 点修 饰 点外 显 子翻 译 起 始 点 内含子 OCT-1 OCT-1： ATTTGCAT八 聚 体 2021-5-28 47 n 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 转 录 的 基 因 及其 转 录 起 始 上 游 序 列 2021-5-28 48 （ 二 ） 转 录 因 子能 直 接 、 间 接 辨 认 和 结 合 转 录 上 游 区 段DNA的 蛋 白 质 ， 现 已 发 现 数 百 种 ， 统 称 为反 式 作 用 因 子 (trans-acting factors)。 反 式 作 用 因 子 中 ， 直 接 或 间 接 结 合 RNA聚合 酶 的 ， 则 称 为 转 录 因 子 (transcriptional factors, TF)。 参 与 RNA-pol 转 录 的 TF 蛋 白 激 酶 活 性 ， 使 CTD磷酸 化TF H ATPase57（ ） 34（ ）TF E 解 螺 旋 酶30， 74TF F 促 进 RNA-pol 结 合 及 作为 其 他 因 子 结 合 的 桥 梁33TF B 稳 定 TF D-DNA复 合 物12， 19， 35TF A 辅 助 TBP-DNA结 合TAF* 结 合 TATA盒TBP* 38TF D 功 能亚 基 组 成 ， 分 子 量 (kD)转 录 因 子 蛋 白 激 酶 活 性 ， 使 磷酸 化 （ ） （ ） 解 螺 旋 酶， 促 进 结 合 及 作为 其 他 因 子 结 合 的 桥 梁 稳 定 复 合 物， ， 辅 助 结 合结 合 盒 功 能亚 基 组 成 ， 分 子 量转 录 因 子 2021-5-28 50 RNA聚 合 酶 II与 启 动 子 的 结 合 、 启 动 转 录 需要 多 种 蛋 白 质 因 子 的 协 同 作 用 。 通 常 包 括 ： 可 诱 导 因 子 或 上 游 因 子 与 增 强 子 或 启 动 子 上 游元 件 的 结 合 ； 通 用 转 录 因 子 在 启 动 子 处 的 组 装 ； 辅 激 活 因 子 和 /或 中 介 子 在 通 用 转 录 因 子 /RNA聚 合 酶 II复 合 物 与 可 诱 导 因 子 、 上 游 因 子 之 间的 辅 助 和 中 介 作 用 。 因 子 和 因 子 之 间 互 相 辨 认 、 结 合 ， 以 准 确 地 控制 基 因 是 否 转 录 、 何 时 转 录 。 2021-5-28 51 型 基 因 中 的 四 类 转 录 因 子 转 录 因 子 具 体 组 分 结 合 序 列 功 能 基 本 组 分 TBP,TF A,B,E,G,F和 H TBP结 合TATA盒 转 录 起 始 定 位 ； 转录 起 始 和 延 长 辅 激 活 因 子 TAFs和 中 介 子 在 可 诱 导 因 子 和 上 游因 子 与 基 本 转 录 因 子、 RNA聚 合 酶 结 合 中起 联 结 和 中 介 作 用 上 游 因 子 SP1、 ATF、CTF等 启 动 子 上 游元 件 协 助 基 本 转 录 因 子 ，提 高 转 录 效 率 和 专 一性 可 诱 导 因 子 如 MyoD、HIF-1等 增 强 子 等 远隔 调 控 序 列 时 间 和 空 间 （ 组 织 ）特 异 性 地 调 控 转 录 2021-5-28 52 （ 三 ） 转 录 起 始 前 复 合 物 真 核 生 物 RNA-pol不 与 DNA分 子 直 接 结 合 ，而 需 依 靠 众 多 的 转 录 因 子 。 转 录 起 始 需 形 成 转 录 起 始 前 复 合 物 （ pre-initiation complex, PIC） 。 形 成 PIC的 顺 序 如 下 ：TATA PICTF II D TF II A TF II B TF II ERNA-pol II/TF II D TATA由 RNA-Pol 催 化 转 录 的 PIC形 成 A BPOL-TF F H ETBP TAFTF D- A- B-DNA复 合 物POL-TF F A BTBP TAFTATA H E CTD- PPIC组 装 完 成 ， TF H使 CTD磷 酸 化 2021-5-28 54 nPIC 的形成与转录 2021-5-28 55 （ 四 ） 少 数 几 个 反 式 作 用 因 子 的 搭 配 启 动 特 定基 因 的 转 录 （ 拼 板 理 论 ） 为 了 保 证 转 录 的 准 确 性 ， 不 同 基 因 需 不 同 转录 因 子 。 一 个 基 因 一 般 需 3至 5个 转 录 因 子 。 拼 板 理 论 (piecing theory) ： 几 个 特 定 的 反 式 作 用 因 子 （ 主 要 是 可 诱 导 因 子 和上 游 因 子 ） 之 间 互 相 作 用 ， 再 与 基 本 转 录 因 子 、RNA聚 合 酶 搭 配 而 有 针 对 性 地 结 合 、 转 录 相 应 的基 因 。 可 诱 导 因 子 和 上 游 因 子 常 常 通 过 辅 激 活 因 子 或 中介 子 与 基 本 转 录 因 子 、 RNA聚 合 酶 结 合 ， 但 有 时也 可 直 接 与 基 本 转 录 因 子 、 RNA聚 合 酶 结 合 。 2021-5-28 56 三 、 真 核 生 物 转 录 延 长 过 程 中 没 有转 录 与 翻 译 同 步 的 现 象真 核 生 物 转 录 延 长 过 程 与 原 核 生 物 大 致 相似 ， 但 因 有 核 膜 相 隔 ， 没 有 转 录 与 翻 译 同步 的 现 象 。 RNA-pol前 移 处 处 都 遇 上 核 小 体 。转 录 延 长 过 程 中 可 以 观 察 到 核 小 体 移 位 和解 聚 现 象 。 RNA-Pol RNA-PolRNA-Pol核 小 体转录延长中的核小体移位 转 录 方 向 2021-5-28 58 四 、 真 核 生 物 的 转 录 终 止 和 加 尾 修 饰同 时 进 行真 核 生 物 的 转 录 终 止 ， 是 和 转 录 后 修 饰 密 切 相关 的 。真 核 生 物 mRNA有 聚 腺 苷 酸 (poly A)尾 巴 结 构 ，是 转 录 后 才 加 进 去 的 。转 录 不 是 在 poly A的 位 置 上 终 止 ， 而 是 超 出 数百 个 乃 至 上 千 个 核 苷 酸 后 才 停 顿 。已 发 现 ， 在 读 码 框 架 的 下 游 ， 常 有 一 组 共 同 序列 AATAAA， 再 下 游 还 有 相 当 多 的 GT序 列 。这 些 序 列 称 为 转 录 终 止 的 修 饰 点 。 2021-5-28 59 转 录 终 止 与 加 尾 修 饰 2021-5-28 60 第 四 节 真 核 生 物 RNA的 加 工Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA 真 核 生 物 转 录 生 成 的 RNA分 子 是 初 级RNA转 录 物 (primary RNA transcript)， 几乎 所 有 的 初 级 RNA转 录 物 都 要 经 过 加 工， 才 能 成 为 具 有 功 能 的 成 熟 的 RNA。 加 工 主 要 在 细 胞 核 中 进 行 。 2021-5-28 61 n 几 种 主 要 的 修 饰 方 式 ：1. 剪 接 (splicing) 2. 剪 切 (cleavage)3. 修 饰 (modification) 4. 添 加 (addition) 2021-5-28 62 一 、 真 核 生 物 mRNA的 加 工 包 括首 、 尾 修 饰 和 剪 接（ 一 ） 前 体 mRNA在 5 -末 端 加 入 “ 帽 ” 结 构大 多 数 真 核 mRNA的 5 -末 端 有 7-甲 基鸟 嘌 呤 的 帽 结 构 。这 个 真 核 mRNA加 工 过 程 的 起 始 步 骤 由两 种 酶 ， 加 帽 酶 (capping enzyme)和 甲 基转 移 酶 (methyltransferase)催 化 完 成 。 2021-5-28 63 mRNA的 帽 子 结 构 （ m7GpppG） 是 在5 -端 形 成 的 。 转 录 产 物 第 一 个 核 苷 酸往 往 是 5 -三 磷 酸 鸟 苷 pppG。 mRNA成 熟 过 程 中 ， 先 由 磷 酸 酶 把 5 -pppG水 解 ， 生 成 5 -ppG或 5 -pG。然 后 ， 5 -端 与 另 一 三 磷 酸 鸟 苷 （ pppG） 反 应 ， 生 成 三 磷 酸 双 鸟 苷 。 在 甲 基 化酶 的 作 用 下 ， 第 一 或 第 二 个 鸟 嘌 呤 碱 基发 生 甲 基 化 ， 形 成 帽 子 结 构 。 2021-5-28 64 5 pppGp 5 GpppGppppG ppi 鸟 苷 酸转 移 酶5 m7GpppGp甲 基 转 移 酶SAMn 帽 子 结 构 的 生 成 过 程 ： 5 ppGp磷 酸 酶 Pi 2021-5-28 65 n 帽 子 结 构 ： 2021-5-28 66 n 帽 子 结 构 的 意 义 ： 可 以 使 mRNA免 遭 核 酸 酶 的 攻 击 。 （ 帽子 结 构 是 前 体 mRNA在 细 胞 核 内 的 稳 定因 素 ， 也 是 mRNA在 细 胞 质 内 的 稳 定 因素 。 ） 也 能 与 帽 结 合 蛋 白 质 复 合 体 (cap-binding complex of protein)结 合 ， 并 参 与 mRNA和 核 糖 体 的 结 合 ， 启 动 蛋 白 质 的 生 物 合成 。 2021-5-28 67 （ 二 ） 前 体 mRNA在 3 端 特 异 位 点 断 裂 并 加上 多 聚 腺 苷 酸 尾 尾 部 修 饰 是 和 转 录 终 止 同 时 进 行 的 过 程 。 poly A的 有 无 与 长 短 ， 是 维 持 mRNA作 为翻 译 模 板 的 活 性 ， 以 及 增 加 mRNA本 身 稳定 性 的 因 素 。 一 般 真 核 生 物 在 胞 浆 内 出 现 的 mRNA， 其poly A长 度 为 100至 200个 核 苷 酸 之 间 ， 也有 少 数 例 外 。 poly A是 mRNA由 细 胞 核 进 入 细 胞 质 所 必需 的 。 2021-5-28 68 前 体 mRNA分 子 的 断 裂 和 加 多 聚 腺 苷 酸 尾是 多 步 骤 过 程 。 加 工 过 程 先 由 核 酸 外 切 酶 切 去 3 -末 端 一些 过 剩 的 核 苷 酸 ， 然 后 由 多 聚 腺 苷 酸 酶 催化 ， 以 ATP为 底 物 ， 在 mRNA 3-末 端 逐 个加 入 腺 苷 酸 ， 形 成 poly尾 。 3 -末 端 切 除 信 号 是 3 -端 一 段 保 守 序 列AAUAAA。 AAUAAA G/U5 3Poly(A)信 号 Poly(A)位 点 mRNACPSF G/U5 3CPSFCFI,CFII,CStFCPSF CStFCFICFIIPAP CPSF CStFCFICFIIPAPATP G/UPPPi CFIICFI CStF慢 速 多 腺 苷 酸 化 PABCPSF AAAAAAAAAAOHPAPATPPPi PAB 快 速多 腺 苷 酸 化CPSF AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAHOAAAAAAAAAAPAPCPSF AAAAAAAAAAOHPAP 2021-5-28 70 （ 三 ） 前 体 mRNA的 剪 接 核 内 的 蛋 白 质 小 分 子 核 糖 核 酸 蛋 白 体（ 剪 接 体 , splicesome）snRNA 1. hnRNA （ hetero-nuclear RNA, hnRNA） 核 内 出 现 的 转 录 初 级 产 物 ， 分 子 量 往 往 比 在 胞 浆内 出 现 的 成 熟 mRNA大 几 倍 ， 甚 至 数 十 倍 ， 核 内 的初 级 mRNA称 为 杂 化 核 RNA。 snRNA（ small nuclear RNA, snRNA） 核 内 的 小 型 RNA。 碱 基 数 在 100300bp范 围 。snRNA和 核 内 的 蛋 白 质 组 成 小 分 子 核 糖 核 蛋 白 体（ snRNP） ， 作 为 RNA剪 接 的 场 所 。 2021-5-28 71 真 核 生 物 结 构 基 因 ， 由 若 干 个 编 码 区 和 非编 码 区 互 相 间 隔 开 但 又 连 续 镶 嵌 而 成 ， 去 除 非编 码 区 再 连 接 后 ， 可 翻 译 出 由 连 续 氨 基 酸 组 成的 完 整 蛋 白 质 ， 这 些 基 因 称 为 断 裂 基 因 。 断 裂 基 因 (splite gene) CA B D编 码 区 A、 B、 C、 D 非 编 码 区 2021-5-28 72 2. 外 显 子 (exon)和 内 含 子 (intron) 外 显 子 ： 在 断 裂 基 因 及 其 初 级 转 录 产 物 上出 现 ， 并 表 达 为 成 熟 RNA的 核 酸 序 列 。（ 结 构 基 因 中 有 表 达 活 性 的 编 码 区 ） 内 含 子 ： 隔 断 基 因 的 线 性 表 达 而 在 剪 接 过程 中 被 除 去 的 核 酸 序 列 。 （ 结 构 基 因 中 无表 达 活 性 的 非 编 码 区 ） 2021-5-28 73DNA mRNA鸡 卵 清 蛋 白 成 熟 mRNA与 DNA杂 交 电 镜 图 剪 接 是 把 hnRNA中 的 内 含 子 除 去 ， 把 外 显 子连 接 起 来 。 内 含 子 弯 成 套 索 状 ， 称 套 索 RNA（ lariat RNA） ， 外 显 子 相 互 靠 近 并 连 接 。 鸡 卵 清 蛋 白基 因hnRNA首 、 尾 修 饰hnRNA剪 接成 熟 的 mRNA 鸡卵清蛋白基因及其转录 、转录后修饰 2021-5-28 75 内 含 子 的 分 类 ： 根 据 基 因 的 类 型 和 剪 接 的 方 式 ， 通 常 把内 含 子 分 为 4类 ： I ： 主 要 存 在 于 线 粒 体 、 叶 绿 体 及 某 些 低 等 真 核 生 物的 rRNA基 因 ； II： 发 现 于 线 粒 体 、 叶 绿 体 ， 转 录 产 物 是 mRNA； III： 是 常 见 的 形 成 套 索 结 构 后 剪 接 ， 大 多 数 mRNA基因 有 此 类 内 含 子 ； IV： 是 tRNA基 因 及 其 初 级 转 录 产 物 中 的 内 含 子 ， 剪接 过 程 需 酶 及 ATP。 2021-5-28 76 2021-5-28 77 3. mRNA的 剪 接 套 索 剪 接 模 式 除 去 hnRNA中 的 内 含 子 ， 将 外 显 子 连 接 。(1)内 含 子 两 端 的 序 列 ： 5 GU AG 3n5GU可 结 合 U1-snRNAn分 支 点 A可 结 合 U2-snRNA(2)U1-snRNA, U2-snRNA等 形 成 剪 接 体（ splicesome） 将 内 含 子 切 除 2021-5-28 78 snRNP与 hnRNA结 合 成 为 剪 接 体 2021-5-28 79 UACUACA - AGUG U4U5U6 E1 E2U1 U2 UACUACA - AGUGU6 E1 E2U1、 U4、 U5 pG-OH(ppG-OH, pppG-OH) U-OH GpUpGpA 第 一 次 转 酯 反 应第 二 次 转 酯 反 应UpA GpU外 显 子 1 内 含 子 外 显 子 2G-OHUpUpGpA剪 接 过 程 的 二 次 转 酯 反 应 (twice transesterification) 2021-5-28 81 4. 剪 切 和 剪 接 ， 可 加 工 成 不 同 的 mRNA 剪 切 ： 剪 去 内 含 子 后 ， 上 游 的 外 显 子 不 再 与相 邻 的 外 显 子 连 接 。 剪 接 ： 剪 去 内 含 子 后 ， 上 游 的 外 显 子 继 续 与相 邻 的 外 显 子 连 接 。 （ 即 剪 切 后 将 相 邻 的 外显 子 连 接 起 来 ） 某 些 真 核 生 物 的 前 体 mRNA可 经 剪 切 或 （ 和） 剪 接 两 种 模 式 ， 加 工 成 不 同 的 mRNA 如 ： 免 疫 球 蛋 白 、 肌 球 蛋 白 、 降 钙 素 等 生 成 过 程 2021-5-28 82 RNA编 辑 作 用 说 明 ， 基 因 的 编 码 序 列 经 过 转 录后 加 工 ， 是 可 有 多 用 途 分 化 的 ， 因 此 也 称 为 分化 加 工 (differential RNA processing)。 （ 四 ） mRNA的 编 辑 (mRNA editing) 人 类 apo B基 因 mRNA（ 14500个 核 苷 酸 ）肝 脏apo B100（ 分 子 量 为 500 000） 肠 道 细 胞apo B48（ 分 子 量 为 240 000）mRNA编 辑 2021-5-28 83 二 、 tRNA的 转 录 后 加 工真 核 生 物 的 tRNA由 RNA-pol III催 化 生 成 初 级 转录 产 物 。 2021-5-28 84 1、 tRNA的 剪 接 2021-5-28 85 2、 化 学 修 饰 稀 有 碱 基 的 生 成 等 3-端 加 上 CCA-OH 甲 基 化 ： AmA GmG 还 原 反 应 ： UDHU 核 苷 内 的 转 位 反 应 ： U 脱 氨 反 应 ： AI tRNA核 苷 酸 转 移 酶 、连 接 酶ATP ADP 碱 基 修 饰（ 2） 还 原 反 应 如 ： U DHU （ 3） 核 苷 内 的 转 位 反 应 如 ： U （ 4） 脱 氨 反 应 如 ： A I 如 ： A Am（ 1） 甲 基 化（ 1）（ 1） （ 3）（ 2） （ 4） 2021-5-28 88 三 、 rRNA的 转 录 后 加 工 真 核 细 胞 的 rRNA基 因 （ rDNA） 属 于 丰富 基 因 每 个 基 因 被 不 能 转 录 的 基 因 间 隔 分 段 隔开 rDNA位 于 核 仁 内 ， 每 个 基 因 各 自 为 一 个转 录 单 位 45S的 转 录 产 物 是 三 种 rRNA的 前 身 rRNA成 熟 后 ， 在 核 仁 内 装 配 ， 形 成 核 蛋白 体 2021-5-28 89转 录 45S - rRNA剪 接18S - rRNA 5.8S和 28S-rRNA rDNA内 含 子 内 含 子 28S5.8S18S 2021-5-28 90 四 、 核 酶 (ribozyme) 具 有 酶 促 活 性 的 RNA称 为 核 酶 。 槌 头 结 构 （ hammerhead structure） 核 酶 发 挥 作 用 的 关 键 。 要 求 ：至 少 含 有 3 个 茎 （ RNA分 子 内 配 对 形 成 的 局部 双 链 ）1至 3个 环 （ RNA分 子 局 部 双 链 鼓 出 的 单 链 ）至 少 有 13个 一 致 性 的 碱 基 位 点 。 四 膜 虫 rRNA内 含 子 的 二 级 结 构四 膜 虫 rRNA的 剪 接 采 用 自 我 剪 接 方 式5-端 核 苷 酸 序 列 最 简 单 的 核 酶 二 级 结 构 槌 头 结 构 (hammerhead structure)底 物 部 分 通 常 为 60个 核 苷 酸 左 右同 一 分 子 上 包 括 有 催 化部 份 和 底 物 部 份 催 化 部 份 和 底 物 部 份 组成 锤 头 结 构 除 rRNA外 ， tRNA、 mRNA的 加 工 也 可 采用 自 我 剪 接 方 式 。 2021-5-28 93 核 酶 研 究 的 意 义 核 酶 的 发 现 ， 对 中 心 法 则 作 了 重 要 补 充 ； 核 酶 的 发 现 是 对 传 统 酶 学 的 挑 战 ； 利 用 核 酶 的 结 构 设 计 合 成 人 工 核 酶 。 2021-5-28 94 人 工 设 计 的 核 酶粗 线 表 示 合 成 的 核 酸 分 子细 线 表 示 天 然 的 核 酸 分 子X 表 示 一 致 性 序 列箭 头 表 示 切 断 点 2021-5-28 95 RNA聚 合 酶 全 酶 在 转 录 起 始 区 的 结 合 全 酶 2021-5-28 96 酵 母 RNA聚 合 酶 和