常用分子生物学技术的原理及应用

目 录 常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第21章 目 录 第一节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique 目 录 n核 酸 分 子 杂 交 (nucleic acid hybridization) 在 DNA复 性 过 程 中 ， 如 果 把 不 同 DNA单 链分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA与 RNA放 在 一起 ， 只 要 在 DNA或 RNA的 单 链 分 子 之 间 有 一 定的 碱 基 配 对 关 系 ， 就 可 以 在 不 同 的 分 子 之 间 形成 杂 化 双 链 (heteroduplex) 。一 、 分 子 杂 交 与 印 迹 技 术 的 原 理 目 录 复性RNA DNA 目 录 （ 一 ） 印 迹 技 术利 用 各 种 物 理 方 法 使 电 泳 胶 中 的 生 物 大 分 子转 移 到 NC等 各 种 膜 上 ， 使 之 成 为 固 相 化 分 子 。这 一 技 术 类 似 于 用 吸 墨 纸 吸 收 纸 张 上 的 墨 迹 ， 因此 称 之 为 “ blotting” ， 译 为 印 迹 技 术 。 目 录 用 放 射 性 核 素 、 生 物 素 或 荧 光 染 料 标 记 其末 端 或 全 链 的 已 知 序 列 的 多 聚 核 苷 酸 链 被 称 为“ 探 针 ” ， 探 针 可 以 与 固 定 在 NC膜 上 的 核 苷酸 结 合 ， 判 断 是 否 有 同 源 的 核 酸 分 子 存 在 。 （ 二 ） 探 针 技 术 目 录 二 、 印 迹 技 术 的 类 别 及 应 用（ 一 ） DNA印 迹 (Southern Blotting)（ 二 ） RNA印 迹 (Northern Blotting)（ 三 ） 蛋 白 质 的 印 迹 (Western Blotting)用 于 基 因 组 DNA、 重 组 质 粒 和 噬 菌 体 的 分 析 。 用 于 RNA的 定 性 定 量 分 析 。用 于 蛋 白 质 定 性 定 量 及 相 互 作 用 研 究 。 目 录 n其 他 ： 斑 点 印 迹 (dot blotting) 原 位 杂 交 (in situ hybridization)DNA点 阵 (DNA array) DNA芯 片 技 术 (DNA chip) 三种印迹技术的比较 分 子 杂 交 实 验 目 录 放射自显影照片 目 录 DNA点 阵 目 录 第二节聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction 目 录 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 1 55 5 5 5 5Template DNA一 、 PCR技 术 的 工 作 原 理 55 555 5 5 5 目 录 Cycle 3 55 555 5 5 55 5 5 5 5 55 525 30 次 循 环 后 ， 模 板 DNA的 含 量可 以 扩 大 100万 倍 以 上 。 目 录 模 板 DNA 特 异 性 引 物 耐 热 DNA聚 合 酶 dNTPs Mg2+n PCR体 系 基 本 组 成 成 分 目 录 n PCR的 基 本 反 应 步 骤变 性95C延 伸72C 退 火Tm-5C 目 录 利 用 特 异 性 引 物 以 cDNA或 基 因 组 DNA为 模 板 获得 已 知 目 的 基 因 片 段 , 或 与 逆 转 录 反 应 相 结 合 ， 直接 以 组 织 和 细 胞 的 mRNA为 模 板 获 得 目 的 片 段 ；利 用 简 并 引 物 从 cDNA文 库 或 基 因 组 文 库 中 获 得序 列 相 似 的 基 因 片 段 ；利 用 随 机 引 物 从 cDNA文 库 或 基 因 组 文 库 中 克 隆基 因 。 二 、 PCR技 术 的 主 要 用 途（ 一 ） 目 的 基 因 的 克 隆 目 录 利 用 PCR技 术 可 以 随 意 设 计 引 物 在 体外 对 目 的 基 因 片 段 进 行 嵌 和 、 缺 失 、 点 突变 等 改 造 。 PCR技 术 高 度 敏 感 ， 对 模 板 DNA的量 要 求 很 低 ， 是 DNA和 RNA微 量 分 析 的最 好 方 法 。 （ 三 ） DNA和 RNA的 微 量 分 析（ 二 ） 基 因 突 变 目 录 将 PCR技 术 引 入 DNA序 列 测 定 ， 使 测 序工 作 大 为 简 化 ， 也 提 高 了 测 序 的 速 度 ；待 测 DNA片 段 既 可 克 隆 到 特 定 的 载 体 后进 行 序 列 测 定 ， 也 可 直 接 测 定 。PCR与 其 他 技 术 的 结 合 可 以 大 大 提 高 基因 突 变 检 测 的 敏 感 性 。（ 四 ） DNA序 列 测 定（ 五 ） 基 因 突 变 分 析 目 录 逆 转 录 PCR(reverse transcription PCR， RT-PCR)是 将 RNA的 逆 转 录 反 应 和 PCR反 应 联 合应 用 的 一 种 技 术 。 RT-PCR是 目 前 从 组 织 或 细 胞 中 获 得 目 的 基 因以 及 对 已 知 序 列 的 RNA进 行 定 性 及 半 定 量 分析 的 最 有 效 方 法 。 （ 一 ） 逆 转 录 PCR技 术三 、 几 种 重 要 的 PCR衍 生 技 术 目 录 原 位 PCR(in situ PCR)是 在 组 织 切 片 或 细 胞 涂 片上 的 单 个 细 胞 内 进 行 的 PCR反 应 ， 然 后 用 特 异性 探 针 进 行 原 位 杂 交 ， 即 可 检 出 待 测 DNA或RNA是 否 在 该 组 织 或 细 胞 中 存 在 。 原 位 PCR方 法 弥 补 了 PCR技 术 和 原 位 杂 交 技 术的 不 足 ， 是 将 目 的 基 因 的 扩 增 与 定 位 相 结 合 的一 种 最 佳 方 法 。（ 二 ） 原 位 PCR技 术 目 录 （ 三 ） 实 时 PCR技 术实 时 PCR(real-time PCR)技 术 通 过 动 态监 测 反 应 过 程 中 的 产 物 量 ， 消 除 了 产 物 堆 积对 定 量 分 析 的 干 扰 ， 亦 被 称 为 定 量 PCR。 目 录 n实 时 PCR技 术 原 理QR 335 5上 游引 物 下 游引 物荧 光 标 记 引 物 R Q 3 355 目 录 第三节核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis 目 录 n核 酸 序 列 分 析 的 基 本 原 理 ： 化 学 裂 解 法 (Maxam-G illbert法 ) DNA链 的 末 端 合 成 终 止 法 (Sanger法 ) 目 录 一 、 DNA链 末 端 合 成 终 止 法 目 录 G A T C 测 序 反 应 电 泳 AACG TG G ACTAACG TG G ACAACG TG G AAACG TG GAACG TGAACG TAACG AACAAA 5 3 正极负极ddG ddA ddT ddC n链 末 端 合 成 终 止 法 测 定 DNA序 列 的 原 理 目 录 二 、 DNA自 动 测 序采 用 荧 光 替 代 放 射 性 核 素 标 记 是 实 现 DNA序列 分 析 自 动 化 的 基 础 。 用 不 同 荧 光 分 子 标 记 四 种双 脱 氧 核 苷 酸 ， 然 后 进 行 Sanger测 序 反 应 ， 反 应产 物 经 电 泳 （ 平 板 电 泳 或 毛 细 管 电 泳 ） 分 离 后 ，通 过 四 种 激 光 激 发 不 同 大 小 DNA片 段 上 的 荧 光 分子 使 之 发 射 出 四 种 不 同 波 长 荧 光 ， 检 测 器 采 集 荧光 信 号 ， 并 依 此 确 定 DNA碱 基 的 排 列 顺 序 。 目 录 ddG ddA ddTddC 红 色荧 光绿 色荧 光黄 色荧 光蓝 色荧 光 电 泳 DNA序 列 自 动 分 析 原 理 及 结 果 图 目 录 第四节基因文库Gene Library 目 录 基 因 组 DNA文 库 (genomic DNA library) cDNA文 库 (cDNA library) n基 因 文 库 (gene library)是 指 一 个 包 含 了 某 一 生 物 体 全 部 DNA序 列的 克 隆 群 体 。 目 录 一 、 基 因 组 DNA文 库基 因 组 DNA文 库 是 指 生 物 的 基 因 组 DNA的信 息 （ 包 括 所 有 的 编 码 区 和 非 编 码 区 ） 以 DNA片 段 形 式 贮 存 的 克 隆 群 体 。 用 于 构 建 基 因 组 文 库 的 载 体 有 噬 菌 体 、粘 粒 和 酵 母 人 工 染 色 体 等 。 目 录 n基 因 组 文 库 和 cDNA文 库 的 构 建 和 筛 选 目 录第 一 轮 筛 选 第 二 轮 筛 选 第 三 轮 筛 选 n基 因 组 文 库 筛 选 结 果 举 例 目 录 cDNA文 库 是 包 含 某 一 组 织 细 胞 在 一 定 条件 下 所 表 达 的 全 部 mRNA经 逆 转 录 而 合 成 的cDNA序 列 的 克 隆 群 体 ， 它 以 cDNA片 段 的 形式 贮 存 着 该 组 织 细 胞 的 基 因 表 达 信 息 。 二 、 cDNA文 库 目 录 第五节生物芯片技术Biological Chip Technique 目 录 是 指 将 许 多 特 定 的 DNA片 段 有 规 律 地 紧 密 排列 固 定 于 单 位 面 积 的 支 持 物 上 ， 然 后 与 待 测 的 荧光 标 记 样 品 进 行 杂 交 ， 杂 交 后 用 荧 光 检 测 系 统 等对 芯 片 进 行 扫 描 ， 通 过 计 算 机 系 统 对 每 一 位 点 的荧 光 信 号 做 出 检 测 、 比 较 和 分 析 ， 从 而 迅 速 得 出定 性 和 定 量 的 结 果 。 该 技 术 亦 被 称 作 DNA微 阵 列(DNA microarray)。 一 、 基 因 芯 片n基 因 芯 片 (gene chip) 目 录 n基 因 芯 片 工 作 流 程 示 意 图 目 录 是 将 高 度 密 集 排 列 的 蛋 白 分 子 作 为 探 针 点阵 固 定 在 固 相 支 持 物 上 ， 当 与 待 测 蛋 白 样 品 反应 时 ， 可 捕 获 样 品 中 的 靶 蛋 白 ， 再 经 检 测 系 统对 靶 蛋 白 进 行 定 性 和 定 量 分 析 的 一 种 技 术 。二 、 蛋 白 质 芯 片蛋 白 质 分 子 间 的 亲 和 反 应n蛋 白 质 芯 片 (protein chip)n蛋 白 质 芯 片 作 用 原 理 目 录 第六节生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 目 录 一 、 蛋 白 质 相 互 作 用 研 究 技 术 酵 母 双 杂 交 各 种 亲 和 分 析 （ 标 签 蛋 白 沉 淀 、 免 疫 共 沉 淀 等 ） 荧 光 共 振 能 量 转 换 效 应 分 析 噬 菌 体 显 示 系 统 筛 选n常 用 蛋 白 质 相 互 作 用 的 研 究 技 术 目 录 标 签 融 合 蛋 白 结 合 实 验 是 一 个 基 于 亲 和 色 谱原 理 的 、 分 析 蛋 白 质 体 外 直 接 相 互 作 用 的 方 法 。（ 一 ） 标 签 蛋 白 沉 淀标 签 融 合 蛋 白 结 合 实 验 主 要 用 于 证 明 两 种 蛋白 分 子 是 否 存 在 直 接 物 理 结 合 、 分 析 两 种 分 子 结合 的 具 体 结 构 部 位 及 筛 选 细 胞 内 与 融 合 蛋 白 相 结合 的 未 知 分 子 。 目 录 标 签 融 合蛋 白 沉 淀实 验 流 程示 意 图 目 录 （ 二 ） 酵 母 双 杂 交 技 术 的 基 本 原 理 和 用 途 目 录 n酵 母 双 杂 交 系 统 的 应 用 证 明 两 种 已 知 基 因 序 列 的 蛋 白 质 可 以 相 互 作 用的 生 物 信 息 学 推 测 。 分 析 已 知 存 在 相 互 作 用 的 两 种 蛋 白 质 分 子 的 的相 互 作 用 功 能 结 构 域 或 关 键 的 氨 基 酸 残 基 。 将 拟 研 究 的 蛋 白 质 的 编 码 基 因 与 BD基 因 融 合 成为 “ 诱 饵 ” 表 达 质 粒 ， 可 以 筛 选 AD基 因 融 合 的“ 猎 物 ” 基 因 表 达 文 库 ， 筛 选 未 知 的 相 互 作 用蛋 白 质 。 目 录 电 泳 迁 移 率 变 动 测 定 (electrophoretic mobility shift assay， EMSA)或 称 凝 胶 迁 移 变 动 实 验 (gel shift assay)最 初 用 于 研 究 DNA结 合 蛋 白 与 相 应DNA序 列 间 的 相 互 作 用 ， 可 用 于 定 性 和 定 量 分 析 ，已 经 成 为 转 录 因 子 研 究 的 经 典 方 法 。 目 前 这 一 技术 也 被 用 于 研 究 RNA结 合 蛋 白 和 特 定 RNA序 列 间的 相 互 作 用 。二 、 DNA-蛋 白 质 相 互 作 用 分 子 分 析 技 术（ 一 ） 电 泳 迁 移 率 变 动 测 定 目 录 放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标 记 探 针 1X 1X 1X 1X核 蛋 白 提 取 物 1X 10X 10X未 标 记 探 针 10Xn凝 胶 迁 移 实 验 结 果 示 意 图 目 录 染 色 质 免 疫 沉 淀 技 术 (chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是 目 前 可以 研 究 体 内 DNA与 蛋 白 质 相 互 作 用 的主 要 方 法 。（ 二 ） 染 色 质 免 疫 沉 淀 法 目 录 n染 色 质 免 疫 沉 淀 实 验 流 程 及 结 果 示 意 图 目 录 遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七节 目 录 n转 基 因 技 术采 用 基 因 转 移 技 术 使 目 的 基 因 整 合 入 受 精卵 细 胞 或 胚 胎 干 细 胞 ， 然 后 将 细 胞 导 入 动 物 子宫 ， 使 之 发 育 成 个 体 。 转 基 因 被 导 入 的 目 的 基 因转 基 因 动 物 (transgenic animal)目 的 基 因 的 受 体 动 物一 、 转 基 因 技 术 目 录 n核 转 移 技 术 即 动 物 整 体 克 隆 技 术 ， 将 动 物 的 一个 体 细 胞 核 全 部 导 入 另 一 个 体 的 去 胞 核的 的 激 活 的 卵 细 胞 内 ， 使 之 发 育 成 个 体 ，即 克 隆 (clone)。二 、 核 转 移 技 术 目 录 n基 因 剔 除 技 术 (gene knock out) 也 称 基 因 靶 向 (gene targeting)灭 活 ，有 目 的 去 除 动 物 体 内 某 种 基 因 的 技 术 。三 、 基 因 剔 除 技 术 目 录 将 灭 活 的 基 因 放 入 胚 胎 干 细 胞 (embryonic stem cell， ES)中 ， 使 这 一 灭 活 基 因 通 过 同 源 重组 取 代 原 有 的 目 的 基 因 ， 筛 选 到 基 因 已 定 点 灭活 的 细 胞 后 ， 通 过 显 微 注 射 将 细 胞 注 入 小 鼠 囊胚 中 。 细 胞 在 小 鼠 囊 胚 中 参 与 胚 胎 的 发 育 ， 最终 形 成 嵌 合 体 小 鼠 。 n操 作 方 式 目 录 n建 立 动 物 模 型 单 基 因 决 定 疾 病 模 型 基 因 剔 除获 得 性 突 变 (gain-of-function mutation) 多 基 因 决 定 疾 病 模 型四 、 基 因 转 移 和 基 因 剔 除 在 医 学发 展 中 的 作 用 目 录 第八节疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes 目 录 功 能 克 隆 (functional cloning) 定 位 克 隆 (positional cloning)n克 隆 疾 病 相 关 基 因 的 策 略 目 录 n定 义 从 对 一 种 致 病 基 因 的 功 能 的 了 解 出 发来 克 隆 该 致 病 基 因 。（ 一 ） 功 能 克 隆n应 用 生 化 机 制 已 明 确 、 基 因 表 达 产 物 较 易 得到 部 分 纯 化 的 遗 传 性 疾 病 。 目 录 利 用 酵 母 系 统 从 功 能 学 角 度 鉴 定 致 病 基 因 。用 不 同 人 的 DNA片 段 转 化 与 人 类 遗 传 疾 病 具 有类 似 表 型 的 突 变 酵 母 ， 可 以 恢 复 (rescue)正 常 表 型的 片 段 中 所 含 有 的 基 因 即 可 能 为 致 病 基 因 。 这 种 实验 称 为 功 能 互 补 试 验 (functional complementation assay)。 目 录 （ 二 ） 定 位 克 隆n定 义 从 一 种 致 病 基 因 的 染 色 体 定 位 出 发 逐 步 缩小 范 围 ， 最 后 克 隆 该 基 因 。n系 统 的 定 位 克 隆 工 作 遗 传 学 分 析 (确 定 致 病 基 因 染 色 体 定 位 )交 换 分 析 、 连 锁 不 平 衡 分 析 分 子 生 物 学 分 析染 色 体 异 常 (缺 失 、 易 位 等 )分 析 、 基 因文 库 的 筛 选 与 基 因 克 隆 目 录 基因诊断和基因治疗第九节Gene Diagnosis and Gene Therapy 目 录 n定 义 直 接 检 测 基 因 结 构 及 其 表 达 水 平 是 否 正常 ， 从 而 对 疾 病 作 出 诊 断 的 方 法 。一 、 基 因 诊 断 (G ene Diagnosis)n特 点 以 基 因 作 为 检 查 材 料 和 探 察 目 标 ， 属 于“ 病 因 诊 断 ” 。 针 对 特 定 基 因 ， 特 异 性 强 。 所 用 技 术 具 有 放 大 效 应 ， 故 诊 断 灵 敏 度 高 。 适 用 性 强 ， 诊 断 范 围 广 。 目 录 1. DNA序 列 分 析用 于 基 因 突 变 类 型 已 经 明 确 的 遗 传 病 的诊 断 及 产 前 诊 断 。2. PCR技 术 快 速 检 出 样 品 中 的 痕 量 病 原 微 生 物 。 微 量 DNA 样 品 中 的 基 因 及 基 因 变 异 分 析 。 用 于 个 体 识 别 、 亲 缘 关 系 鉴 定 、 器 官 移 植 术前 组 织 配 型 、 基 因 连 锁 分 析 等 等 。 目 录 样 品 中 痕 量 病 原 微 生 物 的 迅 速 检 出 、 分 类 及 分 型 。 同 时 分 析 样 品 中 可 能 存 在 的 多 种 不 同 基 因 变 异方 式 。 分 析 样 品 中 耐 药 菌 株 的 存 在 和 个 体 对 药 物 或 毒 物的 敏 感 性 。 分 析 个 体 的 疾 病 易 感 状 态 ， 如 肿 瘤 、 自 身 免 疫 病发 生 的 预 警 。3. 基 因 芯 片 (gene chip) 目 录 将 某 种 遗 传 物 质 转 移 到 患 者 细 胞 内 ，使 其 在 体 内 发 挥 作 用 ,以 治 疗 疾 病 的 方 法 ，称 为 基 因 治 疗 。二 、 基 因 治 疗 (G ene Therapy)n定 义 目 录 （ 一 ） 基 因 治 疗 的 基 本 策 略1. 缺 陷 基 因 精 确 的 原 位 修 复 基 因 增 补 基 因 失 活 基 因 疫 苗 基 因 矫 正基 因 置 换 目 录 （ 二 ） 基 因 治 疗 的 基 本 程 序 治 疗 性 基 因 的 选 择 基 因 载 体 的 选 择 靶 细 胞 的 选 择 基 因 转 移 病 毒 载 体非 病 毒 载 体体 细 胞生 殖 细 胞间 接 体 内 疗 法直 接 体 内 疗 法