基因操作的主要技术原

第 一 章 基 因 操 作 的 主 要 技 术 原 理第 二 节 凝 胶 电 泳 凝 胶 电 泳 是 一 种 分 析 鉴 定 重 组 DNA分子 、 蛋 白 质 、 蛋 白 质 与 核 酸 相 互 作 用 的重 要 实 验 手 段 ， 同 时 也 是 分 子 生 物 学 研究 方 法 的 技 术 基 础 。 1 凝 胶 电 泳 凝 胶 包 含 复 杂 的 孔 道 网 络 ， DNA分 子 必 须 通 过 这些 孔 道 才 能 够 到 达 阳 极 。小 的 DNA分 子 ， 在 凝 胶 中 迁 移 的 更 快 。 按 凝 胶 材 料 分 : 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 (普 通 和 低 熔 点 琼 脂 糖 )按 电 泳 装 置 分 : 水 平 式 /琼 脂 糖 凝 胶 竖 式 /聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶两 种 方 法 比 较 ： 分 离 效 果 和 分 离 范 围 ; 操 作 难 易 凝 胶 电 泳 的 种 类 基 本 原 理带 有 负 电 荷 的 DNA或 RNA核 苷 酸 链 ，依 靠 稳 定 的 无 反 应 活 性 的 介 质 （ 琼 脂 糖 凝 胶 和 聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 ） 和 缓 冲 液 ，在 电 场 中 以 一 定 的 迁 移 率 从 负 极 移 向 正 极 。根 据 核 酸 分 子 大 小 不 同 、 构 型 或 形 状 的 差 异 ， 以及 所 带 电 荷 的 不 同 ，可 以 通 过 电 泳 将 其 混 合 物 中 的 不 同 成 分 彼 此 分 开 。 2 核 酸 电 泳 凝 胶 的 成 分 和 浓 度 决 定 能 够 分 离 的 DNA大 小琼 脂 糖 凝 胶 ： 相 对 大 的 孔 道 ， 分 离 大 一 些 的 分 子 ；聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ： 很 小 的 孔 道 ， 分 离 小 的 DNA分 子 ， 能 够 分 离 仅 仅 相 差 一 个 核 苷 酸 的 DNA分 子 。 用 途琼 脂 糖 凝 胶 ： 用 于 DNA和 RNA的 常 规 分 析聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ： 常 用 于 小 分 子 核 酸 和 蛋 白 质 分 析凝 胶 电 泳 的 一 般 程 序 制 胶 ， 点 样 ， 电 泳 ， 染 色 ， 观 察 取 决 于 核 酸 分 子 本 身 的 大 小 和 构 型分 子 量 较 小 的 DNA分 子 ， 比 分 子 量 较 大 的 DNA分 子迁 移 率 要 快 ；同 等 分 子 量 的 不 同 构 型 的 核 酸 分 子 ， 构 型 紧 密 的比 松 散 型 的 开 环 DNA分 子 或 线 性 DNA分 子 迁 移 率要 快 。电 泳 的 迁 移 率 与 凝 胶 的 类 型 和 密 度 相 关 琼 脂 糖 凝 胶 的 分 辨 力 在 0.2 50Kb之 间 ; 聚 丙 烯 酰 胺 的 分 辨 力 在 1 1000bp之 间 ；凝 胶 电 泳 的 分 辨 力 Separation Range of Agarose PolyAcrylamide Gels (PAGE) 琼 脂 糖 ： 一 种 从 红 色 海 藻 中 提 取 出 的 线 性 多 糖聚 合 物 。分 为 常 熔 点 的 琼 脂 糖 低 熔 点 （ LMP） 琼 脂 糖2 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 Agarose gel electrophoresis LMP琼 脂 糖 熔 点 ： 62 65 熔 解 后 ， 在 37 可 保 持 液 态 数 小 时 ； 在 25 可 保 持 液 态 约 10min 回 收 DNA分 子 在 65 下 将 LMP琼 脂 糖 凝 胶 熔 化 ； 加 入 过 量 的 酚 抽 提 DNA； 离 心 获 得 含 DNA分 子 的 上 清 液 ； 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 参 数 ： 缓 冲 液 ： 1 TAE（ TBE, TPE） 凝 胶 的 含 量 ： 根 据 检 测 的 DNA大 小 加 DNA样 品 ： 1 g， 指 示 剂 电 泳 条 件 ： 大 片 断 低 电 压 长 时 间 ， 小 片 段 高 电 压 短 时 间 使 凝 胶 中 的 DNA分 子 可 视 化染 色 是 最 简 单 的 方 法 。溴 乙 锭 (EtBr) 能 够 用 来 对 琼 脂 糖 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶中 的 DNA进 行 染 色 。只 要 在 足 够 的 DNA存 在 条 件 下 ， 经 过 EtBr染 色 后 ， 在紫 外 照 射 下 能 以 不 同 的 条 带 显 示 出 来 。注 意 ： 溴 乙 锭 是 非 常 强 的 致 癌 物 ； 紫 外 光 也 会 灼 伤 。因 此 ， 用 于 把 DNA染 成 蓝 色 或 绿 色 ， 又 不 需 要 紫 外 照射 就 能 看 见 DNA的 非 致 癌 染 料 ， 越 来 越 多 地 被 用 于实 验 室 研 究 中 。 染 色 和 观 察 ： 溴 化 乙 锭 （ EB） 染 色 ， 在 300nm波 长 的 紫 外 下 观 察 （ 凝 胶 成 像 仪 ） 能 看 到 0.05 g的 微 量 DNA DNA的 片 断 大 小 与 荧 光 强 度 成 正 比 DNA分 子 大 小 的 估 计如 何 确 定 凝 胶 电 泳 中 片 段 的 大 小 ?最准确的方法：利 用 迁 移 速 度 和 分 子 重 量 间 的 数 学关 系 。 相 关 公 式 是 ： D=a-b (logM)D是 迁 移 的 距 离 ， M是 相 对 分 子 质 量 ， a和 b是 依 赖于 电 泳 条 件 的 常 数 。通常使用： 一 种 简 单 ， 但 相 对 不 太 精 确 的 估 计 DNA片 段 大 小 的 方 法 。 方 法 ： 利 用 已 知 大 小 的 DNA片 段 作 标 准 (marker /ladder),目 的 DNA片 段 与 之 比 对 、 估 计 。例 如 ： Hind 将 DNA切 成 8个 片 段 ， 这 些 片 段 的大 小 都 已 经 知 道 ， 范 围 从 125bp到 23kb。 实 验 中的 片 段 大 小 可 以 通 过 对 比 两 条 泳 道 中 条 带 的 位置 而 加 以 估 计 。尽 管 不 十 分 精 确 ， 这 种 方 法 进 行 起 来 只 有 5 的 错误 率 Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8% Agarose 124681012kb Agarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit: 5-10 ng DNA 根 据 标 准 DNA相 对 迁 移 距 离 推 测 待 测 定 的 DNA片 段 的 大 小 Agarose gel electrophoresis 对 放 射 性 标 记 的 DNA进 行 放 射 性 自 显 影染 色 的 一 个 缺 陷 是 其 灵 敏 性 的 限 制 ， 如 果 每 条 带中 DNA的 含 量 少 于 10ng， 则 很 有 可 能 在 染 色 后仍 然 看 不 到 条 带 。 对 于 微 量 的 DNA就 需 要 更 加灵 敏 的 检 测 手 段 。放 射 自 显 影 是 一 个 很 好 的 方 法 。 电 泳 前 将 DNA结 合 上 放 射 性 标 记 ， 利 用 X射 线 敏感 摄 影 对 凝 胶 进 行 拍 摄 就 能 够 肉 眼 观 察 到 DNA分 子 。放 射 性 DNA使 胶 片 曝 光 ， 显 示 出 DNA条 带 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ： 丙 稀 酰 胺 / 亚 甲 双 丙 稀 酰 胺 （ 29： 1） TEMED 过 硫 酸 铵 （ 10 ）缓 冲 液 ： TBE3 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链 分 离 凝 胶 -SSCP用 于 单 链 分 离 ,可 以 进 行 SNP的 检 测 。PAGE原 理 ：SNP: DNA长 度 相 同 ， 仅 一 个 碱 基 不 同 ；加 热 后 解 链 后 电 泳 ， 迁 移 速 度 不 同 。 可 以 分 离 1bp的 差 异用 途 ： 测 序 、 AFLP、为 避 免 局 部 区 域 产 生 二 级 结 构 ， 可 采 用 各种 变 性 措 施 ， 如 煮 沸 样 品 ， 提 高 电 泳 温 度 ，凝 胶 中 加 入 变 性 剂 （ 尿 素 、 甲 醛 、 甲 胺 等 ）核 酸 测 序 凝 胶 n 传 统 凝 胶 电 泳 中 ， 电 场 是 沿 着 凝 胶 长 度 走 向 定 位 的 ，DNA分 子 是 沿 着 直 线 向 正 极 迁 移 。 不 同 大 小 的 DNA分 子在 凝 胶 网 状 孔 道 中 迁 移 的 时 候 ， 迁 移 速 率 不 同 ， 从 而被 分 离 开 。n 只 有 一 定 大 小 范 围 内 的 分 子 能 够 通 过 这 种 方 法 分 离 ，因 为 对 于 大 分 子 来 说 ， 分 子 越 大 ， 迁 移 速 率 的 差 异 越小 。n 实 际 操 作 中 ， 普 通 的 凝 胶 电 泳 不 能 有 效 地 分 离 大 于50kb的 DNA分 子 。4 通 过 凝 胶 电 泳 分 离 染 色 体 1984年 ， D.R.Cantor发 明 的 ， 分 离 超 大 分 子 量 的DNA分 子 。在 脉 冲 电 泳 中 ， 电 场 方 向 是 周 期 变 化 的 ， 头 一 个 脉冲 电 场 方 向 与 核 酸 的 移 动 方 向 成 45 角 ， 下 一 个脉 冲 的 电 场 方 向 与 核 酸 移 动 方 向 在 另 一 侧 成 45 角 ， 由 于 加 在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 的 电 场 方 向 、 电流 大 小 、 以 及 作 用 时 间 都 在 交 替 地 变 换 着 ， 这 就使 得 DNA分 子 必 须 随 时 调 整 其 泳 动 的 方 向 ， 来 适应 凝 胶 孔 隙 的 无 规 则 变 化 。脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 （ PFGE） 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 原 理 图 北 南 脉 冲 场 电 泳 常 规 电 泳 两 组 电 极 ， 排 列 不 均 匀 ; 一 组 电 极 ， 电 场 方 向 不 变 ， 电 极 排 列 均 匀 ， 定 时 改 变 电 场 方 向 ， DNA分 子 的 净 DNA移 动 方 向 与 电 场 方 向 相 同 。 整 个 电 泳 移 动 方 向 与 两 电 场 呈 45o， 在 电 泳 过 过 程 保 持 电 压 稳 定 。 常 规 方 法 制 备 DNA 程 中 ， 电 压 有 时 可 随 时 间 的 增 加 而 样品 增 加 ， 制 备 DNA样 品 与 常 规 方 法不 同 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 PFGE工 作 假 说1) DNA松 弛 时 间 ： 大 分 子 DNA改 变 形 状 和 重 新 定 向 所 需的 时 间 。 这 个 时 间 与 DNA分 子 量 呈 正 相 关 （ Tr）2) DNA移 动 时 间 ： DNA分 子 向 前 移 动 的 时 间 （ Tm）3) 电 场 脉 冲 时 间 ： 其 电 场 方 向 所 持 续 的 时 间 （ Tp） 与 分 子 量 小 的 DNA分 子 相 比 ， 分 子 量 大 的 DNA分 子需 要 较 多 的 次 数 来 更 换 其 构 型 和 方 位 ， 使 之 能够 按 新 的 方 向 游 动 ， 所 以 迁 移 率 就 慢 ， 从 而 达到 了 分 离 大 分 子 量 DNA分 子 的 目 的 。 可 以 分 离 几 千 kb的 DNA分 子 。 这 个 长 度 范 围 包含 许 多 真 核 生 物 染 色 体 分 子 ， 包 括 酵 母 、 许 多重 要 的 丝 状 真 菌 和 原 生 动 物 ， 如 疟 疾 新 生 虫 。因 此 ， 能 够 得 到 这 些 生 物 体 染 色 体 的 凝 胶 图 谱 。 PFGE can resolve large DNA fragments 染 色 体 DNA电 泳 的 用 途 1. 测 定 染 色 体 数 目 ： 特 别 适 合 于 低 等 真 核 生 物 2. 测 定 基 因 连 锁 关 系 ： 结 合 DNA杂 交 技 术 ， 可 适 合 各 种 生 物 3. 染 色 体 DNA重 排 分 析 1） 酵 母 细 胞 经 X-射 线 照 射 ， 染 色 体 发 生 断 裂 ， 可 得 弥 散 型 。 但 让 其 修 复 后 ， 又 可 形 成 带 ， 但 有 的 发 生 了 重 排 ， 导 致 带 型 变 化 2） 非 洲 锥 虫 ： 变 异 表 面 糖 蛋 白 基 因 的 表 达 4. 疾 病 的 诊 断 引 起 某 种 皮 肤 病 的 原 生 动 物 Leishmania, 具 有 其 特 征 性 的 染色 体 。 PFG便 可 用 于 诊 断 。 方 法 ： 不 同 的 RNA电 泳 方 法 是 依 据 使 RNA分 子 变 性 所 采取 的 方 法 。 这 些 方 法 不 仅 要 使 RNA分 子 在 点 样 时是 一 级 结 构 ， 而 且 在 整 个 电 泳 过 程 中 也 保 持 一级 结 构 。1. 乙 二 醛 /二 甲 基 亚 砜 法 原 理 ： 乙 二 醛 可 以 与 核 酸 、 核 苷 酸 及 碱 基 发 生 反 应 ，特 别 是 鸟 苷 形 成 一 个 稳 定 的 附 加 环 ， 从 而 阻 止GC碱 基 的 互 补 作 用 发 生 。步 骤 ： RNA+10mM羟 甲 基 醛 和 50% DMSO混 合 50 、 1 h变 性 点 样 电 泳 染 色 观 察 5 RNA凝 胶 电 泳 2. 羟 甲 基 汞 法原 理 ： 羟 甲 基 汞 可 与 RNA分 子 的 嘌 呤 或 嘧 啶碱 基 发 生 反 应 ， 反 应 部 位 是 在 可 形 成 氢键 的 亚 氨 基 处 。步 骤 ： RNA+10mM羟 甲 基 醛 ， 点 样 在 含 4mM羟甲 基 醛 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 ， 电 泳 ， 染 色 观察 3. 甲 醛 法步 骤 ： RNA+2.2M甲 醛 +50%甲 胺 ， 点 样 在 含 2.2M甲 醛 琼 脂糖 凝 胶 上 ， MOPS缓 冲 液 电 泳 ， 染 色 观 察其 它 变 性 剂 ， 如 尿 素 、 甲 胺 等 也 可 用 于 RNA电 泳 . 4. 三 种 方 法 的 比 较 第 一 种 方 法 安 全 ， 但 由 于 反 应 是 不 可 逆 的 ， 由 此 回 收的 RNA样 品 用 于 体 外 翻 译 效 果 不 好 。 第 二 、 三 种 方 法 的 反应 可 逆 ， 回 收 RNA样 品 可 用 于 体 外 翻 译 反 应 ， 但 操 作 必 须小 心 ， 因 两 种 变 性 剂 有 毒 。 6 蛋 白 质 电 泳方 法 ： 变 性 与 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ， 前 者常 称 之 为 SDS-PAGE。 差 别 ： 有 无 变 性 剂用 途 ： 非 变 性 凝 胶 可 用 于 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 过 程中 ， 可 直 接 用 于 酶 促 反 应 （ 颜 色 变 化 ）SDS-PAGE可 用 于 蛋 白 质 分 子 量 、 亚 基 组 成 的 测 定 。mRNA翻 译 产 物 ， 基 因 表 达 产 物 测 定 等 。 用 于 DNA、 RNA以 及 蛋 白 质 的 回 收方 法 1) 电 洗 脱 法 : 利 用 电 泳 方 法 将 凝 胶 中 的 特 定 核 酸 分 子 洗 脱 到其 它 介 质 中 ； 2) 滤 纸 法 核 酸 凝 胶 染 色 ， 长 波 紫 外 光 确 定 位 置 ， 在 分 离带 前 方 切 一 口 子 并 插 入 滤 纸 条 (其 背 面 覆 盖 透 析 袋 膜 )， 电泳 至 DNA带 全 部 进 入 滤 纸 条 ， 洗 脱 DNA， 纯 化 、 沉 淀 7 电 泳 片 段 的 分 离 与 回 收 3) 透 析 袋 法 切 下 含 DNA带 琼 脂 块 ， 放 入透 析 袋 ， 封 口 ， 放 入 电 泳 槽 ， 电 泳 2-3小时 至 全 部 DNA离 开 凝 胶 块 ， 反 向 电 泳 1分钟 ， 取 出 DNA液 ， 纯 化 、 沉 淀 。4) 冻 融 法 待 回 收 DNA 切 口 DNA 切 口 凝 胶 块 滤 纸 法 透 析 袋 凝 胶 块 待 回 收 DNA 透 析 袋 法 待 回 收 DNA 凝 胶 块 V-型 槽 电 洗 脱 槽 法 回 收 DNA方 法 影 响 回 收 率 的 因 素 1） DNA分 子 大 小 回 收 率 与 分 子 量 大 小 呈 负 相 关 ； 2） 乙 醇 沉 淀 其 中 温 度 、 时 间 和 DNA浓 度 （ 回 收 时体 积 ） 均 与 回 收 率 有 关 ； 3） 离 心 时 间 时 间 越 长 ， 效 果 越 好 ， 对 低 浓 度 DNA尤 其 明 显 。