质粒DNA的分离、纯化

n 质 粒 是 染 色 体 外 的 DNA分 子 ， 大 小 可 为 1kb到 200kb。n 大 多 数 来 自 细 菌 的 质 粒 是 双 链 、 共 价 闭 合 环状 的 分 子 ， 以 超 螺 旋 形 式 存 在 。 它 是 细 菌 内的 共 生 型 遗 传 因 子 。n 其 复 制 和 遗 传 独 立 于 细 菌 染 色 体 ， 但 复 制 和转 录 依 赖 于 宿 主 编 码 的 蛋 白 和 酶 。一 、 实 验 原 理 q 煮 沸 法 原 理 染 色 体 DNA比 质 粒 DNA分 子 大 得 多 ， 且 染 色 体 DNA为 线状 分 子 ， 而 质 粒 DNA为 共 价 闭 合 环 状 分 子 ； 当 加 热 处 理 DNA溶 液 时 ， 线 状 染 色 体 DNA容 易 发 生 变 性 ，共 价 闭 环 的 质 粒 DNA在 冷 却 时 即 恢 复 其 天 然 构 象 ； 变 性 染 色 体 DNA片 段 与 变 性 蛋 白 质 和 细 胞 碎 片 结 合 形 成沉 淀 ， 而 复 性 的 超 螺 旋 质 粒 DNA分 子 则 以 溶 解 状 态 存 在液 相 中 ， 从 而 可 通 过 离 心 将 两 者 分 开 。 q碱 裂 解 法 原 理 当 用 碱 处 理 DNA溶 液 时 ， 线 状 染 色 体 DNA容 易 发 生 变 性 ， 共价 闭 环 的 质 粒 DNA在 回 到 中 性 pH时 即 恢 复 其 天 然 构 象 ； SDS是 一 种 阴 离 子 表 面 活 性 剂 ， 它 既 能 使 细 菌 细 胞 裂 解 ， 又 能使 一 些 蛋 白 质 变 性 ， 所 以 SDS处 理 细 菌 细 胞 后 ， 会 导 致 细 菌 细胞 壁 的 破 裂 ， 从 而 使 质 粒 DNA以 及 基 因 组 DNA从 细 胞 中 同 时释 放 出 来 。 释 放 出 来 的 DNA遇 到 强 碱 性 （ NaOH） 环 境 ， 就会 变 性 。 然 后 ， 用 酸 性 乙 酸 钾 来 中 和 溶 液 ， 使 溶 液 处 于 中 性 ，质 粒 DNA将 迅 速 复 性 ， 而 基 因 组 DNA， 由 于 分 子 巨 大 ， 难 以复 性 。 离 心 后 ， 质 粒 DNA将 在 上 清 中 ， 而 基 因 组 DNA则 与 细胞 碎 片 一 起 沉 淀 到 离 心 管 的 底 部 。 通 过 这 种 方 法 即 可 将 质 粒DNA从 细 菌 中 提 取 出 来 。 q 碱 裂 解 法 流 程 图对数期菌体 溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液 菌 种 ： E. coli MV1184（ 含 pUC118） 、 E. coli K12（ 含 pEGFP）设 备 ： eppendorf管 、 微 量 取 液 器 (20 l,200 l,1000 l)， 台 式高 速 离 心 机 ， 涡 旋 振 荡 器试 剂 ： LB液 体 培 养 基 、 溶 液 、 溶 液 、 溶 液 、 RNA酶 A 、 饱和 酚 :氯 仿 1:1 二 、 材 料 、 设 备 及 试 剂 溶 液 ： 50mM 葡 萄 糖 ； 25mM TrisHCl（ pH8.0） ； 10mM EDTA溶 液 ： （ 新 鲜 配 制 ） 0.2N NaOH； 1% SDS溶 液 ： 5M KAC 10ml； 冰 醋 酸 11.5ml； 水 28.5ml 1、 取 1.5ml培 养 液 倒 入 1.5ml eppendorf管 中 ,4 下 12000g离 心 30秒 。 2、 弃 上 清 ,将 管 倒 置 于 卫 生 纸 上 数 分 钟 ,使 液 体 流 尽 。 3、 菌 体 沉 淀 重 悬 浮 于 100 l溶 液 中 (需 剧 烈 振 荡 ),室 温 下 放 置 5-10分 钟 。 4、 加 入 新 配 制 的 溶 液 200 l, 盖 紧 管 口 ， 快 速 温 和 颠 倒 eppendorf管 数次 ,以 混 匀 内 容 物 (千 万 不 要 振 荡 ),冰 浴 5分 钟 。 5、 加 入 150 l预 冷 的 溶 液 ,盖 紧 管 口 ， 并 倒 置 离 心 管 ， 温 和 振 荡 10秒 ,使沉 淀 混 匀 ,冰 浴 中 5-10分 钟 ,4 下 12000g离 心 5-10分 钟 。 6、 上 清 液 移 入 干 净 eppendorf管 中 ,加 入 等 体 积 的 酚 /氯 仿 (1:1),振 荡 混匀 ,4 下 12000g离 心 5分 钟 。 7、 将 水 相 移 入 干 净 eppendorf管 中 ,加 入 2倍 体 积 的 无 水 乙 醇 ,振 荡 混 匀 后置 于 -20 冰 箱 中 20分 钟 ， 然 后 4 下 12000g离 心 10分 钟 。 8、 弃 上 清 ,将 管 口 敞 开 倒 置 于 卫 生 纸 上 使 所 有 液 体 流 出 ,加 入 1ml 70 乙 醇洗 沉 淀 一 次 ,4 下 12000g离 心 5-10分 钟 。 9、 吸 除 上 清 液 ,将 管 倒 置 于 卫 生 纸 上 使 液 体 流 尽 ,真 空 干 燥 10分 钟 或 室 温干 燥 。 10、 将 沉 淀 溶 于 20 l TE缓 冲 液 (pH8.0， 含 20 g /ml RNaseA)中 ， 储 于 -20 冰 箱 中 。 三 、 操 作 步 骤 实 验 结 果 ： 获 得 质 粒 DNA（ pUC118及 pEGFP） 使 用 处 于 对 数 期 的 新 鲜 菌 体 （ 老 化菌 体 导 致 开 环 质 粒 增 加 ） 培 养 时 应 加 入 筛 选 压 力 ， 否 则 菌 体易 污 染 ， 质 粒 易 丢 失 尽 量 选 择 高 拷 贝 的 质 粒 ， 如 为 低 拷贝 或 大 质 粒 ， 则 应 加 大 菌 体 用 量 菌 株 不 要 频 繁 转 接 （ 质 粒 丢 失 ） 菌 体 量 适 当 。 培 养 基 去 除 干 净 ， 同 时 保 证 菌 体 在 悬 浮 液 中 充 分 悬 浮 。 变 性 的 时 间 不 要 过 长 （ 5分 钟 ） ， 否 则 质 粒 易 被 打 断 。 复 性 时 间 也 不 宜 过 长 ， 否 则 会 有 基 因 组 DNA的 污 染 。 G 菌 、 酵 母 质 粒 的 提 取 ， 应 先 用 酶 法 或 机 械 法 处 理 ，以 破 壁 。 采 用 吸 附 材 料 吸 附 的 方 式 分 离 DNA时 ，应 提 供 相 应 的 缓 冲 体 系 采 用 有 机 （ 酚 /氯 仿 ） 抽 提 时 应 充 分 混 匀 ，但 动 作 要 轻 柔 离 心 分 离 两 相 时 ， 应 保 证 一 定 的 转 速 和时 间 针 对 不 同 材 料 的 特 点 ， 在 提 取 过 程 中 辅以 相 应 的 去 杂 质 的 方 法 当 沉 淀 时 间 有 限 时 ， 用 预 冷 的 乙 醇 或 异 丙 醇 沉 淀 ，沉 淀 会 更 充 分 沉 淀 时 加 入 1/10体 积 的 NaAc（ pH5.2， 3M） ， 有 利于 充 分 沉 淀 沉 淀 后 应 用 70 的 乙 醇 洗 涤 ， 以 除 去 盐 离 子 等 晾 干 DNA， 让 乙 醇 充 分 挥 发 （ 不 要 过 分 干 燥 ） 若 长 期 储 存 建 议 使 用 TE缓 冲 液 溶 解 TE中 的 EDTA能 螯 和 Mg2+或 Mn2+离 子 ， 抑 制 DNase pH值 为 8.0， 可 防 止 DNA发 生 酸 解 1. 菌 体 老 化2. 碱 裂 解 不 充 分3. 菌 体 中 无 质 粒4. 溶 液 使 用 不 当 1. 请 涂 布 平 板 培 养 后 ， 重 新 挑选 新 菌 落 进 行 液 体 培 养2. 可 减 少 菌 体 用 量 或 增 加 溶 液的 用 量3. 不 要 频 繁 转 接 ， 每 次 接 种 时应 接 种 单 菌 落 。 检 查 抗 生 素使 用 浓 度 是 否 正 确 。4. 溶 液 在 温 度 较 低 时 可 能 出现 浑 浊 ， 置 于 37 保 温 片 刻直 至 溶 解 为 清 亮 的 溶 液。q问 题 一 ： 未 提 出 质 粒 或 质 粒 得 率 较 低 ， 如 何 解 决 ？ 原因 对策 1. 混 有 蛋 白2. 混 有 RNA3. 混 有 基 因 组 DNA 1. 不 要 使 用 过 多 菌 体 。 重 新 纯 化DNA， 去 除 蛋 白 、 多 糖 、 多 酚等 杂 质2. 加 入 RNaseA室 温 放 置 一 段 时 间3. 加 入 溶 液 II 和 III后 防 止 剧 烈 振 荡， 可 能 把 基 因 组 DNA剪 切 成 碎片 从 而 混 杂 在 质 粒 中 。 细 菌 培养 时 间 过 长 会 导 致 细 胞 和 DNA的 降 解 ， 培 养 时 间 不 要 超 过 16小 时 。q问 题 二 ： 质 粒 纯 度 不 高 ， 如 何 解 决 ？ 原因 对策 1. 简 要 叙 述 溶 液 、 溶 液 和 溶 液 的 作 用 ， 以 及 实 验 中 分 别 加 入 上 述 溶 液 后 ， 反 应 体 系 出 现 的 现 象 及 其 成 因 。2. 染 色 体 DNA与 质 粒 DNA分 离 的 主 要 依 据 是 什 么 ？