药品微生物限度检查法

药品微生物限度检查法吉 林 省 食 品 药 品 检 验 所2008.3.29长 春 2021-4-25 2 l 微 生 物 限 度 检 查 法 系 检 查 非 规 定 灭 菌 制 剂 及 其 原 、辅 料 受 微 生 物 污 染 程 度 的 方 法 ， 也 是 评 价 生 产 企业 的 药 用 原 料 、 辅 料 、 设 备 、 器 具 、 工 艺 流 程 、环 境 和 操 作 者 卫 生 状 况 的 重 要 手 段 和 依 据 。 检 查项 目 包 括 染 菌 量 及 控 制 菌 检 查 。 2021-4-25 3 微 生 物 限 度 检 查 法 起 草 的 指 导 思 想 较 完 善 检 查 法 ： 也 是 目 前 国 际 上 常 用的 一 种 方 法 。 是 以 琼 脂 平 板 上 的 细 菌 、霉 菌 或 酵 母 菌 形 成 的 一 个 独 立 可 见 的菌 落 为 计 数 依 据 。 该 法 测 定 结 果 只 反映 在 规 定 条 件 下 所 生 长 的 细 菌 、 霉 菌和 酵 母 菌 的 菌 落 数 。 增 加 试 验 的 可 操 作 性 使 方 法 更 具 科 学 性 ， 保 证 检 验 结 果的 准 确 性 。 2021-4-25 4 检 验 全 过 程 应 严 格 遵 守 无 菌 操 作 ， 在 环 境 洁净 度 10000级 和 局 部 洁 净 度 100级 单 向 流 空 气区 域 内 进 行 ， 以 防 止 再 污 染 。 单 向 流 空 气 区域 、 工 作 台 面 及 环 境 应 定 期 按 中 华 人 民 共 和国 国 家 标 准 GB/T 16292 16294-1996 医 药工 业 洁 净 室 （ 区 ） 悬 浮 粒 子 、 浮 游 菌 和 沉 降菌 的 测 试 方 法 进 行 洁 净 度 验 证 。 2021-4-25 5 洁 净 级 别洁 净 级 别 尘 粒 数 /m3 浮 游 菌个 /m2 沉 降 菌个 /0.5h微 粒 直 径0.5um 微 粒 直 径5um100 3,500 0 5 110000 350,000 2000 100 3100000 3,500,000 20,000 500 10 2021-4-25 6 检 验 量 检 验 量 即 一 次 试 验 所 用 的 供 试 品 量 （ g、 ml或 cm2） 一 般 应 随 机 抽 取 不 少 于 检 验 用 量 （ 两 个 以 上 最 小包 装 单 位 ） 的 3倍 量 供 试 品 。 除 另 有 规 定 外 ， 一 般 供 试 品 的 检 验 量 为 10g或10ml； 中 药 膜 剂 为 50cm2 贵 重 药 品 、 微 量 包 装 药 品 的 检 验 量 可 以 酌 减 。 要 求 检 查 沙 门 菌 的 供 试 品 其 检 验 量 应 增 加 10g或10ml 2021-4-25 7 供 试 液 的 制 备 根 据 供 试 品 的 理 化 特 性 与 生 物 学 特 性 ，采 取 适 宜 的 方 法 制 备 供 试 液 。 供 试 液 制 备 若 需 用 水 浴 加 温 时 ， 温 度 不 应 超 过45 。 供 试 液 从 制 备 至 加 入 检 验 用 培 养 基 ， 不 得 超 过 1小 时 。 除 另 有 规 定 外 ， 常 用 的 供 试 品 制 备 方 法如 下 ： 2021-4-25 8 （ 1） 液 体 供 试 品 取 供 试 品 10ml,加 稀 释 剂 至100ml中 混 匀 ， 作 为 1:10 供 试 液 。 水 溶 性 液体 制 剂 可 用 混 合 的 供 试 品 原 液 直 接 作 为 供 试液 。 （ 2） 固 体 、 半 固 体 或 黏 稠 性 供 试 品 取 供 试品 10g加 稀 释 剂 至 100ml中 ， 用 匀 浆 仪 或 其 它适 宜 的 方 法 ， 混 匀 后 ， 作 为 1:10供 试 液 。 供 试 液 的 制 备 2021-4-25 9 非 水 溶 性 供 试 品 取 供 试 品 5g(5ml)， 加 入 司 盘 80 5g、 单 硬 脂酸 甘 油 酯 3g、 聚 山 梨 酯 80 10g的 无 菌 溶 化混 合 物 （ 温 度 低 于 45 ） 的 烧 杯 中 ， 用 无菌 玻 棒 搅 拌 成 团 后 ， 慢 慢 加 入 45 左 右 的稀 释 剂 至 100ml， 边 加 边 搅 拌 ， 使 供 试 品 充分 乳 化 ， 作 为 1:20供 试 液 。特 殊 供 试 液 制 备 方 法 2021-4-25 10 特 殊 供 试 液 制 备 方 法 取 供 试 品 10g， 加 至 含 玻 璃 珠 和 20ml的无 菌 十 四 烷 酸 异 丙 酯 的 容 器 中 ， 充 分 振摇 ， 使 供 试 品 溶 解 ， 再 加 入 约 45 的 稀释 剂 ， 振 摇 5-10分 钟 ， 萃 取 ， 待 油 水 明显 分 层 ， 取 其 水 层 作 为 1:10供 试 液 。 十 四 烷 酸 异 丙 酯 的 灭 菌 方 法 ： 采 用 薄 膜过 滤 法 除 菌 ， 选 用 孔 径 为 0.22um的 脂 溶性 滤 膜 ， 在 140 干 热 灭 菌 2小 时 。 2021-4-25 11 特 殊 供 试 液 制 备 方 法 非 水 溶 性 膜 剂 供 试 品 取 50cm2,剪 碎 ，加 适 量 的 稀 释 剂 （ 通 常 为 每 1ml或 每2ml含 1cm2） ,浸 泡 ， 振 摇 ， 以 供 试 品浸 液 作 为 1:10或 1:20供 试 品 。 2021-4-25 12 特 殊 供 试 液 制 备 方 法 肠 溶 及 结 肠 溶 制 剂 供 试 品 取 供 试 品 10g， 加 至 100ml pH6.8磷 酸盐 缓 冲 液 （ 肠 溶 制 剂 ） 中 或 pH7.6磷酸 盐 缓 冲 液 （ 结 肠 制 剂 ） ， 置 45 水浴 中 ， 振 摇 ， 使 溶 解 ， 作 为 1:10的 供试 液 。 2021-4-25 13 特 殊 供 试 液 制 备 方 法 具 抑 菌 活 性 的 供 试 品 当 供 试 品 有 抑 菌 活 性 时 ， 应 消 除 其 抑 菌 活性 后 ， 再 依 法 检 查 。 常 用 的 方 法 有 ： 培 养 基 稀 释 法 离 心 沉 淀 集 菌 法 3000转 /分 离 心 20分 钟 ，500转 /分 离 心 5分 薄 膜 过 滤 法 中 和 法 2021-4-25 14 菌 数 报 告 规 则 细 菌 数 酵 母 菌 平 均 菌 落 数 在 30-300， 霉 菌 平 均 菌 落 数 在 30-100 之 间 的 稀 释 级作 为 菌 数 报 告 的 依 据 。 当 仅 有 个 稀 释 级 的 菌 落 数 符 合 上 述 规 定 ，以 该 级 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 的 值 报告 菌 数 。 2021-4-25 15 菌 数 报 告 规 则 当 同 时 有 2个 稀 释 级 的 菌 落 数 符 合 上 述 规 定 时 ， 视 两 者 比值 （ 比 值 为 高 稀 释 级 的 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 的 值 除 以低 稀 释 级 的 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 的 值 ） 而 定 。 若 比值 不 大 于 2， 以 两 稀 释 级 的 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 的 均值 报 告 菌 数 ； 若 比 值 大 于 2但 不 超 过 5时 ， 以 低 稀 释 级的 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 的 值 报 告 菌 数 。 当 出 现 比 值 大于 5或 高 稀 释 级 的 菌 落 数 大 于 或 等 于 低 稀 释 级 的 菌 落数 等 异 常 情 况 时 ， 应 查 明 原 因 再 行 检 查 ， 必 要 时 ， 应进 行 方 法 的 重 新 验 证 。 2021-4-25 16 菌 数 报 告 规 则 当 各 稀 释 级 的 平 均 菌 落 数 均 小 于 30，以 最 低 稀 释 级 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释倍 数 的 值 报 告 菌 数 。 各 稀 释 级 的 平 板 均 无 菌 落 生 长 ， 或 仅最 低 稀 释 级 的 平 板 有 菌 落 生 长 ， 但 平均 菌 落 数 小 于 1时 ， 以 1乘 以 最 低 稀释 倍 数 的 值 报 告 菌 数 。 2021-4-25 17 菌 数 报 告 规 则各 各 稀 释 级 菌 落 平 均 数 比 值 菌 落 数 报 告1： 10 1： 102 1： 103 不 可 计不 可 计不 可 计39240.5 16429527141190 2046604 1.62.210.2 164003775027100异 常2405 160003800027000240 10 2021-4-25 18 操 作 要 点 一 个 细 菌 、 霉 菌 或 酵 母 菌 的 菌 落 均 可 由 一个 或 多 个 菌 细 胞 生 长 繁 殖 而 成 ， 因 此 供 试品 中 所 测 得 的 菌 落 数 ， 实 际 为 菌 落 形 成 单位 数 （ colony forming unity, cfu） 供 试 品 检 验 的 全 过 程 必 须 符 合 无 菌 技 术要 求 。 培 养 基 、 稀 释 剂 、 实 验 器 具 等 的 灭 菌 ， 按灭 菌 法 （ 见 附 录 ） 的 要 求 采 用 验 证 合 格 的灭 菌 程 序 灭 菌 。 2021-4-25 19 操 作 要 点 作 供 试 品 稀 释 时 ， 每 一 稀 释 级 都 要 更 换 吸 管 。 细 菌 培 养 48h， 真 菌 培 养 72h， 计 数 。 如 菌 落 极 小 ， 不易 辨 认 可 适 当 延 长 培 养 时 间 。 再 点 计 菌 落 数 。 含 蜂 蜜 、 王 浆 的 液 体 制 剂 ， 用 玫 瑰 红 钠 琼 脂 培 养 基 测 定霉 菌 数 ， 用 酵 母 浸 出 粉 胨 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 测 定 酵 菌 数 ，并 且 合 并 计 数 。 若 同 一 稀 释 级 两 个 平 板 的 菌 落 平 均 数 不 小 于 15， 则 两 个平 板 的 菌 落 数 不 能 相 差 1 倍 或 以 上 。 使 用 灭 菌 吸 管 时 ， 管 尖 不 要 接 触 可 能 污 染 的 任 何 容 器 或用 具 。 供 试 液 稀 释 及 注 皿 时 应 振 摇 后 取 均 匀 的 供 试 液 ， 以 免 造成 实 验 误 差 。 2021-4-25 20 操 作 要 点 培 养 基 的 分 装 量 不 得 超 过 容 器 的 2/3以 免 灭 菌 时 溢 出 。 包 装 时 ， 塞子 必 须 塞 紧 ， 以 免 松 动 或 脱 落 造 成 染 菌 。 培 养 基 配 制 后 应 在 2h内 灭 菌 ， 避 免 细 菌 繁 殖 。 灭 菌 后 的 培 养 基 应 保 存 在 2-25 防 止 被 污 染 ， 可 在 三 周 内 用 毕 。 已 溶 化 的 培 养 基 应 一 次 用 完 ， 一 般 开 启 后 不 宜 再 用 ， 更 不 要 反 复加 热 溶 化 注 皿 时 培 养 基 应 在 45 1 ， 高 于 45 时 易 造 成 细 菌 受 损 或 致 死 ，低 于 45 时 易 凝 固 ， 影 响 混 匀 ， 因 此 使 用 前 可 用 水 浴 保 温 效 果 较好 。 倾 注 培 养 基 于 平 皿 中 与 样 品 摇 匀 时 ， 切 勿 溅 到 皿 盖 边 和 皿 盖 上 ，以 免 影 响 实 验 结 果 。 2021-4-25 21 操 作 要 点l 采 用 薄 膜 过 滤 法 时 ， 水 溶 性 供 试 液 过 滤 前 先 将少 量 的 冲 洗 液 过 滤 以 润 湿 滤 膜 。 油 类 供 试 品 ，其 滤 膜 和 过 滤 器 在 使 用 前 应 充 分 干 燥 。 为 发 挥滤 膜 的 最 大 过 滤 效 率 ， 应 注 意 保 持 供 试 品 溶 液及 冲 洗 液 覆 盖 整 个 滤 膜 表 面 。 供 试 液 经 薄 膜 过滤 后 ， 若 需 要 用 冲 洗 液 冲 洗 滤 膜 ， 每 张 滤 膜 每次 冲 洗 量 为 100ml， 冲 洗 液 、 冲 洗 量 及 冲 洗 方 法同 方 法 验 证 试 验 。 每 片 滤 膜 的 总 过 滤 量 不 宜 过大 ， 以 避 免 滤 膜 上 的 微 生 物 受 损 伤 。 2021-4-25 22 操 作 要 点 每 张 滤 膜 取 相 当 于 1g或 1ml供 试 品 的 供 试 液 直 接 过 滤 或 加 至 适 量稀 释 剂 中 混 匀 ， 过 滤 ， 用 适 宜 的 冲 洗 液 冲 洗 滤 膜 ， 冲 洗 方 法 及冲 洗 量 同 “ 计 数 方 法 的 验 证 ” ， 冲 洗 后 取 出 滤 膜 ， 菌 面 朝 上 贴于 营 养 琼 脂 培 养 基 或 玫 瑰 红 钠 琼 脂 培 养 基 或 酵 母 浸 出 粉 胨 葡 萄糖 琼 脂 培 养 基 平 板 上 培 养 。 每 种 培 养 基 至 少 制 备 一 张 滤 膜 ， 滤膜 贴 于 平 板 上 时 不 得 有 空 隙 或 气 泡 ， 否 则 影 响 微 生 物 生 长 。 2021-4-25 23 操 作 要 点 2021-4-25 24 异 常 情 况 处 理 菌 落 蔓 延 ： 培 养 中 由 于 一 些 菌 落 蔓 延生 长 而 影 响 另 一 些 菌 落 生 长 ， 甚 至 掩 盖了 另 一 些 菌 落 ， 干 扰 计 数 。 原 因 ： 有 动 力 和 培 养 环 境 湿 度 过 大 造成 ， 给 动 力 菌 造 成 泳 动 的 条 件 ， 促 使 形成 蔓 延 菌 落 机 会 增 多 。 2021-4-25 25 加 TTC： 于 倾 注 培 养 基 前 ， 在 每 1000ml营 养琼 脂 内 加 入 灭 菌 1%TTC溶 液 1ml混 匀 后 倾 注平 皿 。 开 盖 干 燥 ： 将 已 凝 固 的 琼 脂 平 板 开 盖 ， 倒 置斜 放 于 净 化 工 作 台 上 ， 开 机 1-2h后 合 盖 ， 再放 培 养 箱 中 2021-4-25 26 换 陶 瓦 盖 ： 将 已 凝 固 的 琼 脂 平 板 盖 换 上 新 近干 热 灭 菌 的 陶 瓦 盖 。 2021-4-25 27 异 常 菌 数 报 告 在 特 殊 情 况 下 ， 营 养 琼 脂 培 养 基 上 生 长 的 霉 菌 、酵 母 菌 多 于 玫 瑰 红 钠 琼 脂 培 养 基 上 菌 落 数 则以 营 养 琼 脂 平 板 的 霉 菌 、 酵 母 菌 菌 落 数 报 告 ，反 之 如 玫 瑰 红 钠 琼 脂 平 板 生 长 了 细 菌 ， 且 多于 营 养 琼 脂 平 板 的 菌 落 数 ， 则 以 玫 瑰 红 钠 琼脂 平 板 的 细 菌 数 报 告 2021-4-25 28 控 制 菌 的 检 查 大 肠 埃 希 菌 检 验 程 序 供 试 品 供 试 液 不 少 于 100ml的 胆 盐 乳 糖 增 菌 液 3537 1824h 取 0.2ml 5mlMUG培 养 基 中 3537 5、 24h 366nm紫 外 光 下 观 察 加 靛 基 质 试 剂 MUG阳 性 ， 靛 基 质 阳 性 MUG阴 性 ， 靛 基 质 阳 性 MUG阴 性 ， 靛 基 质 阴 性 MUG阳 性 ， 靛 基 质 阴 性 取 胆 盐 乳 糖 培 养 液 划 线 报 告 曙 红 亚 甲 蓝 琼 脂 平 板 或 麦 康 凯 琼 脂 平 板 36 1 1824h 阳 性 阴 性 镜 检 、 适 宜 的 生 化 试 验 报 告 2021-4-25 29 大 肠 埃 希 菌 检 验 程 序 供 试 品 供 试 液 不 少 于 100ml的 胆 盐 乳 糖 增 菌 液 3537 1824h 取 0.2ml 5mlMUG培 养 基 中 3537 5、 24h 366nm紫 外 光 下 观 察 加 靛 基 质 试 剂 MUG阳 性 ， 靛 基 质 阳 性 MUG阴 性 ， 靛 基 质 阳 性 MUG阴 性 ， 靛 基 质 阴 性 MUG阳 性 ， 靛 基 质 阴 性 取 胆 盐 乳 糖 培 养 液 划 线 报 告 曙 红 亚 甲 蓝 琼 脂 平 板 或 麦 康 凯 琼 脂 平 板 36 1 1824h 阳 性 阴 性 镜 检 、 适 宜 的 生 化 试 验 报 告 报 告 2021-4-25 30 注 意 事 项 配 制 MUG培 养 基 时 ， 务 必 校 正 pH值 ， 灭 菌 后 pH不 得过 7.4否 则 pH值 偏 高 ， MUG分 解 本 身 则 显 荧 光 。 供 试 品 培 养 液 接 种 于 MUG培 养 基 中 ， 培 养 时 间 一 般 在4h、 24h观 察 是 否 产 生 荧 光 ， 如 荧 光 很 微 弱 ， 不 能 准 确判 断 时 ， 可 延 长 培 养 时 间 至 48h再 观 察 结 果 。 由 于 大 肠埃 希 菌 各 菌 株 间 的 GUD的 活 性 不 完 全 相 同 ， 对 底 物 和底 物 的 浓 度 反 应 的 差 异 ； 培 养 基 中 选 择 因 子 的 影 响 ；培 养 时 间 、 温 度 ； pH的 改 变 ； 大 量 竞 争 菌 和 样 品 本 身物 质 成 分 的 干 扰 等 ， 对 结 果 的 判 断 亦 有 影 响 。 2021-4-25 31 注 意 事 项 观 察 供 试 品 MUG管 时 ， 可 与 阳 性 对 照 管 、 阴 性 对 照管 同 时 在 366nm紫 外 灯 下 观 察 。 在 曙 红 亚 甲 蓝 琼 脂 或 麦 康 凯 琼 脂 平 板 上 生 长 的 可 疑菌 落 ， 务 必 挑 选 2-3个 以 上 菌 落 分 别 做 IMViC试 验 鉴别 。 在 IMViC试 验 中 ， 以 灭 菌 接 种 环 沾 取 菌 苔 ， 首 先 接种 于 枸 椽 酸 盐 琼 脂 斜 面 上 ， 然 后 再 接 种 于 蛋 白 胨 水等 其 它 培 养 基 上 ， 切 务 将 培 养 基 带 入 枸 椽 酸 盐 琼 脂斜 面 上 ， 以 免 产 生 假 阳 性 结 果 。 2021-4-25 32 大 肠 菌 群大 肠 菌 群 作 为 水 质 粪 便 污 染 的 指 示 菌 已 有 80多 年 历 史 。 大 肠 菌 群 的 定义 ： 是 指 37 生 长 时 能 发 酵 乳 糖 ， 在 24h内 产 酸 产 气 的 革 兰 阴 性 无芽 孢 杆 菌 ， 符 合 上 述 定 义 的 细 菌 除 大 肠 埃 希 氏 杆 菌 属 外 ， 还 包 括 肠杆 菌 科 的 肠 杆 菌 属 、 枸 椽 酸 菌 属 、 克 雷 伯 菌 属 等 ， 实 际 上 基 本 包 括人 和 了 正 常 家 畜 肠 道 内 的 全 部 需 氧 的 革 兰 阴 性 杆 菌 ， 较 大 肠 埃 希 菌更 具 代 表 性 ， 且 存 活 时 间 较 长 。 故 检 出 大 肠 埃 希 菌 ， 一 般 认 为 药 品受 粪 便 的 近 期 污 染 ； 而 检 出 大 肠 菌 群 ， 则 表 示 药 品 受 粪 便 的 近 期 或远 期 污 染 。 以 大 肠 菌 群 作 为 口 服 药 品 微 生 物 限 度 标 准 的 控 制 菌 ， 具 有 广 泛 的 卫 生 学 意 义 ， 更 能 反 映 药 品 的 卫 生 质 量 。 2021-4-25 33 操 作 方 法取 乳 糖 胆 盐 发 酵 管 3支 ， 分 别 加 入 1:10供 试 液 1ml (供 试 品 量 0.1g或 0.1ml), 1:100供 试 液 1ml(供 试品 量 0.01g或 0.01ml),1:1000供 试 液 1ml（ 供 试 品量 0.001g或 0.001ml） ， 同 时 作 阴 性 对 照 ， 各 管置 36 1 培 养 18-24h, 阴 性 对 照 应 无 菌 生 长 。 2021-4-25 34 结 果 判 断 乳 糖 胆 盐 发 酵 管 若 无 菌 生 长 ， 或 有 菌 生 长 但 不 产 酸 产 气 （ 或 产 酸 不 产 气 ）报 告 未 检 出 大 肠 菌 群 ； 如 有 产 酸 产 气 ， 应 做 确 证 试 验 ， 将 产 酸 产 气的 发 酵 管 划 线 接 种 于 EMB或 麦 康 凯 琼 脂 平 板 上 培 养 18-24h， 如 平 板 上无 菌 落 生 长 可 判 该 管 未 检 出 大 肠 菌 群 。 如 平 板 上 有 菌 落 生 长 并 与 药 典所 列 的 菌 落 形 态 特 征 相 符 或 疑 似 ， 镜 检 为 革 兰 阴 性 无 芽 孢 杆 菌 的 菌 落 ，应 取 上 述 平 板 上 的 可 疑 菌 落 4-5个 各 接 种 1支 乳 糖 发 酵 管 ， 培 养 24 48h,凡 产 酸 产 气 ， 革 兰 阴 性 无 芽 孢 杆 菌 ， 判 该 管 检 出 大 肠 菌 群 ， 反 之 判 该 管 未 检 出 大 肠 菌 群 。 2021-4-25 35 沙 门 菌 检 验 程 序 供 试 品 10g(10ml) 200ml的 营 养 肉 汤 中 3537 1824h 四 硫 磺 酸 盐 增 菌 液 3537 1824h DHL， EMB或 MacC 3537 1824h 无 典 型 菌 落 三 糖 铁 琼 脂 （ TSI） 3537 1824h 报 告 斜 面 未 见 红 色 （ 斜 面 黄 色 ） 斜 面 红 色 （ 黄 色 ） 底 层 未 见 黄 色 （ 底 层 无 黑 色 ） 底 层 黄 色 （ 黑 色 ） 血 清 凝 集 、 生 化 试 验 报 告 2021-4-25 36 注 意 事 项 在 作 氰 化 钾 试 验 时 ， 应 注 意 密 封 管 口 ， 夏 天 分 装培 养 基 宜 在 冰 浴 中 进 行 ， 防 止 氰 化 钾 分 解 ， 产 生 氢氰 酸 逸 出 ， 致 使 培 养 基 内 氰 化 钾 浓 度 降 低 ， 不 能 抑制 细 菌 生 长 ， 造 成 假 阳 性 。 氰 化 钾 为 剧 毒 品 ， 操 作 时 须 谨 慎 ， 用 后 培 养 基 每管 加 数 粒 硫 酸 亚 铁 和 20%氢 氧 化 钾 0.5ml去 毒 ， 然 后再 灭 菌 、 洗 涤 。 2021-4-25 37 铜 绿 假 单 胞 菌 检 验 程 序 供 试 品 供 试 液 BL增 菌 液 3537 1824h 溴 代 十 六 烷 三 甲 胺 平 板 3537 1824h 氧 化 酶 、 革 兰 染 色 镜 检 氧 化 酶 阴 性 氧 化 酶 阳 性 非 革 兰 阴 性 无 芽 孢 杆 菌 革 兰 阴 性 无 芽 孢 杆 菌 绿 脓 菌 素 报 告 绿 脓 菌 素 阳 性 绿 脓 菌 素 阴 性 生 化 试 验 报 告 2021-4-25 38 注 意 事 项 铜 绿 假 单 胞 菌 污 染 药 品 后 ， 因 生 产 工 艺 和 药 物 的影 响 ， 在 溴 代 十 六 烷 基 三 甲 胺 平 板 上 的 菌 落 形 态可 产 生 非 典 型 形 态 。 为 防 止 漏 检 ， 在 挑 取 疑 似 菌落 时 ， 宜 取 23个 以 上 菌 落 ， 分 别 进 行 检 验 ， 以 提高 铜 绿 假 单 胞 菌 的 检 出 率 。 做 氧 化 酶 试 验 时 ， 试 验 菌 苔 必 须 新 鲜 ， 陈 旧 培 养物 反 应 不 可 靠 试 验 应 避 免 与 铁 、 镍 等 金 属 接 触 ， 不 可 用 普 通 接种 针 （ 环 ） （ 白 金 材 料 除 外 ） ， 挑 取 菌 苔 ， 否 则易 出 现 假 阳 性 。 宜 用 玻 璃 棒 或 木 棒 。 2021-4-25 39 注 意 事 项 试 剂 宜 新 鲜 配 制 ， 放 置 过 久 ， 二 盐 酸 二 甲 基 对 苯 二胺 氧 化 变 色 不 可 用 。 该 反 应 需 在 有 氧 条 件 下 进 行 ， 勿 滴 加 试 剂 过 多 ， 以免 浸 没 培 养 物 ， 使 之 与 空 气 隔 绝 ， 造 成 假 阴 性 反 应 。 绿 脓 菌 素 是 铜 绿 假 单 胞 菌 鉴 定 的 重 要 特 征 ， 但 色 素的 产 生 受 许 多 因 素 的 影 响 ， 除 菌 株 差 异 及 变 异 外 ，培 养 条 件 是 重 要 因 素 ， 温 度 、 培 养 基 成 分 等 皆 可 影响 色 素 产 生 。 培 养 基 中 琼 脂 、 蛋 白 胨 等 均 应 事 先 测试 ， 选 用 适 宜 品 牌 ， 实 验 时 并 用 阳 性 菌 株 作 对 照 试验 。 2021-4-25 40 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验 程 序 供 试 品 供 试 液 营 养 肉 汤 （ 亚 碲 酸 钠 肉 汤 ） 3537 1824h 卵 黄 氯 化 钠 平 板 或 甘 露 醇 氯 化 钠 平 板 3537 1824h 无 菌 落 营 养 琼 脂 斜 面 3537 1824h 报 告 血 浆 凝 固 酶 试 验 ， 革 兰 染 色 镜 检 2021-4-25 41 注 意 事 项 金 黄 色 葡 萄 球 菌 在 上 述 三 种 分 离 培 养 基 上 的 典 型 菌 落 为 金黄 色 。 但 由 于 受 药 物 影 响 或 非 典 型 菌 株 存 在 ， 可 呈 橙 黄 色 、柠 檬 色 或 白 色 。 做 控 制 菌 检 查 ， 对 非 典 型 菌 落 也 有 必 要 进行 凝 固 酶 试 验 做 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 筛 查 ， 以 防 漏 检 金 黄 色葡 萄 球 菌 。 培 养 基 存 放 时 间 和 培 养 时 间 影 响 色 素 产 生 ， 故培 养 基 应 新 鲜 配 制 。 培 养 时 间 宜 48h以 上 。 做 血 浆 凝 固 酶 试 验 应 用 新 鲜 培 养 物 及 新 鲜 血 浆 。 如 用 旧 培养 物 及 血 浆 易 导 致 假 阴 性 反 应 。 此 外 ， 观 察 结 果 时 不 宜 摇动 试 管 ， 因 凝 固 初 期 凝 块 不 结 实 易 破 坏 ， 引 起 假 阴 性 反 应 。 2021-4-25 42 梭 菌 的 检 验 程 序 供 试 液 10ml 2份 （ 1份 置 80 水 浴 保 温 10分 ） 100ml疱 肉 培 养 基 厌 氧 培 养 7296h 未 浑 浊 、 产 气 、 消 化 碎 肉 、 臭 气 0.2ml 报 告 含 庆 大 霉 素 的 哥 伦 比 亚 琼 脂 平 板 厌 氧 培 养 4872h 无 菌 生 长 过 氧 化 氢 酶 试 验 报 告 过 氧 化 氢 酶 阴 性 、 G+梭 菌 有 或 无 卵 圆 形 或 球 形 芽 孢 报 告 ， 检 出 梭 菌 2021-4-25 43 注 意 事 项 厌 氧 培 养 是 厌 氧 菌 培 养 的 基 本 前 提 ，有 些 厌 氧 菌 严 格 厌 氧 ， 一 旦 在 有 氧 存在 时 迅 速 死 亡 ， 这 是 导 致 培 养 失 败 、造 成 假 阴 性 结 果 的 主 要 原 因 之 一 因 此检 查 梭 菌 ， 必 须 保 证 厌 氧 的 培 养 条 件 。 2021-4-25 44 厌 氧 培 养 方 法 冷 触 媒 法 ： 该 法 是 利 用 氢 硼 化 钠 或 氢 硼 化 钾 与 水反 应 产 生 氢 ， 氢 与 氧 气 在 钯 催 化 下 结 合 成 水 ， 从而 造 就 了 一 个 厌 氧 环 境 。 由 于 在 厌 氧 环 境 中 加 入5%-10% 的 二 氧 化 碳 ， 更 有 利 于 厌 氧 菌 的 生 长 。故 在 厌 氧 环 境 中 加 入 柠 檬 酸 与 碳 酸 氢 钠 ， 由 此 制备 CO2。 取 适 宜 容 器 ， 1个 放 入 氢 硼 化 钠 0.22g（ 以 厌 氧 容器 容 积 1L计 ） ， 1个 置 枸 椽 酸 0.33g碳 酸 氢 钠 0.37g另 一 个 置 活 化 的 钯 1g， 临 用 前 与 培 养 管 、 厌 氧 指示 管 一 同 放 入 备 妥 的 装 置 中 ， 取 水 各 5ml加 入 前 两个 试 剂 容 器 内 立 即 封 闭 容 器 ， 待 厌 氧 指 示 管 指 示达 到 厌 氧 状 态 时 ， 即 可 移 入 37 培 养 箱 培 养 。 2021-4-25 45 厌 氧 培 养 方 法焦 性 没 食 子 酸 法 ： 取 培 养 皿 或 其 他 适 宜 容 器 一 个 ， 内 装 焦性 没 食 子 酸 10g， 无 水 碳 酸 钠 5g（ 以 厌 氧 容 器 容 积 1L计 ） ， 与 已 经 接 种 的 培 养 管 或 平 板 、 厌 氧 指 示 管 1支 同时 置 厌 氧 装 置 内 ， 立 即 封 闭 容 器 ， 待 厌 氧 指 示 管 指 示达 到 厌 氧 状 态 时 ， 即 可 移 入 37 培 养 箱 培 养 。 2021-4-25 46 厌 氧 培 养 方 法l 凡 士 林 石 蜡 封 盖 法 ： 在 已 接 种 的 培 养 管 内 注 入 已 经 灭菌 并 液 化 的 1:1凡 士 林 石 蜡 混 合 物 约 1cm高 度 ， 试 验 管 经75-80 水 浴 保 温 时 ， 凡 士 林 石 蜡 混 合 物 自 动 熔 化 并 严 严地 封 住 液 面 ， 待 冷 却 后 置 37 培 养 。 该 法 的 优 点 在 于 在培 养 过 程 中 可 随 时 取 出 培 养 物 作 其 他 检 查 。 缺 点 是 仅 适应 于 液 体 培 养 物 的 厌 氧 培 养 ， 且 使 用 后 器 具 难 以 洗 涤 。 2021-4-25 47 结 果 判 断 供 试 品 检 出 控 制 菌 或 其 他 致 病 菌 时 按 一 次 检 出 结 果为 准 不 再 复 试 。 供 试 品 细 菌 、 霉 菌 、 酵 母 菌 其 中 任 何 一 项 不 符 合 该品 种 项 下 的 规 定 ， 应 从 同 一 批 样 品 中 随 机 抽 样 ， 独立 复 试 两 次 ， 以 3次 结 果 平 均 值 报 告 菌 数 。 眼 用 制 剂 检 出 霉 菌 和 酵 母 菌 时 ， 须 以 两 次 复 试 结 果均 不 得 长 菌 ， 方 可 判 供 试 品 的 霉 菌 和 酵 母 菌 数 符 合该 品 种 项 下 的 规 定 . 若 供 试 品 的 细 菌 数 、 霉 菌 和 酵 母 菌 数 及 控 制 菌 三 项检 验 结 果 均 符 合 该 品 种 项 下 的 规 定 ， 判 供 试 品 符 合规 定 ； 若 其 中 任 何 一 项 不 符 合 该 品 种 项 下 的 规 定 ，判 供 试 品 不 符 合 规 定 . 2021-4-25 48 谢 谢 ！