资源描述
凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒Cat Number: For Research Use OnlyStore at -20 for one yearExpire date: 一、 试剂盒说明 本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白,提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。二、 试剂盒组份组份KGP150 (50 test)KGP1100 (100 test)储存温度Buffer A25 mL25 mL 24Buffer B1.5 mL30 mL4Buffer C12.5 mL25 mL4DTT50L100L-20蛋白酶抑制剂250L500L-20PMSF(100mM)400L800L-20三、操作步骤 实体组织蛋白的提取1、 组织样本,将组织剪切成小块,加入适量的冰冷PBS均浆后,静置5 min ,弃沉淀,小心吸取上清转移至另一离心管中;2、 上清4离心500g,3 min,弃上清,估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积);3、 每20L细胞压积中,加入200L预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1L DTT,5L 100mM PMSF,5L蛋白酶抑制剂】,最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上1015min;4、 加入11L冷Buffer B,最大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1min;5、 再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后, 4离心,16000g,5min;6、 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管,置于冰上,即得胞浆蛋白;7、 在离心沉淀物(细胞核)中加入100L预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1L DTT,5L 100mM PMSF,5L蛋白酶抑制剂),最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上40min,每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds;8、 4离心,16000g,10min,尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白;9、 上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法),分装并保存于-80,避免反复冻融。 培养细胞蛋白提取1、 取培养细胞51061107个/mL,4离心,500g,3 min收集细胞,弃去培养液,用预冷的PBS洗涤两遍;2、 用移液枪尽可能取去上清,勿留残液,估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积);3、 每20L细胞压积中,加入200L预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1L DTT,5L 100mM PMSF,5L蛋白酶抑制剂】,最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上1015min;4、 加入11L冷Buffer B,最大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1min;5、 再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后, 4离心,16000g,5min;6、 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管,置于冰上,即得胞浆蛋白;7、 在离心沉淀物(细胞核)中加入100L预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1L DTT,5L 100mM PMSF,5L蛋白酶抑制剂),最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上40min,每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds;8、 4离心,16000g,10min,尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白;9、 上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法),分装并保存于-80,避免反复冻融。四、 注意事项1、 所有的试剂及器具均需预冷后使用;2、 细胞的数量不应少于0.5107个/mL;, 3、 以上各缓冲液的使用量是以20L细胞压积为例,如细胞压积不同,请参考下表加入各缓冲液。细胞压积PCVBuffer ABuffer BBuffer C10L100L5.5L50L20L200L11L100L50L500L27.5L250L100L1mL55L500L 4、 一般常规提取的蛋白样品,进行后续试验不需要透析,但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想,则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐,建议使用凯基透析Buffer (Cat: KGBP001)透析后进行后续分析。
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