凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒

凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒Cat Number： For Research Use OnlyStore at -20 for one yearExpire date： 一、 试剂盒说明 本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。二、 试剂盒组份组份KGP150 （50 test）KGP1100 （100 test）储存温度Buffer A25 mL25 mL 24Buffer B1.5 mL30 mL4Buffer C12.5 mL25 mL4DTT50L100L-20蛋白酶抑制剂250L500L-20PMSF（100mM）400L800L-20三、操作步骤 实体组织蛋白的提取1、 组织样本，将组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS均浆后，静置5 min ，弃沉淀，小心吸取上清转移至另一离心管中；2、 上清4离心500g，3 min，弃上清，估计细胞压积PCV（离心后的紧实细胞体积）；3、 每20L细胞压积中，加入200L预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1L DTT，5L 100mM PMSF，5L蛋白酶抑制剂】，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上1015min；4、 加入11L冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；5、 再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4离心，16000g,5min；6、 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；7、 在离心沉淀物（细胞核）中加入100L预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1L DTT，5L 100mM PMSF，5L蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；8、 4离心，16000g,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；9、 上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法），分装并保存于-80，避免反复冻融。 培养细胞蛋白提取1、 取培养细胞51061107个/mL，4离心，500g,3 min收集细胞，弃去培养液，用预冷的PBS洗涤两遍；2、 用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞压积PCV（离心后的紧实细胞体积）；3、 每20L细胞压积中，加入200L预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1L DTT，5L 100mM PMSF，5L蛋白酶抑制剂】，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上1015min；4、 加入11L冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；5、 再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4离心，16000g,5min；6、 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；7、 在离心沉淀物（细胞核）中加入100L预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1L DTT，5L 100mM PMSF，5L蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；8、 4离心，16000g,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；9、 上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法），分装并保存于-80，避免反复冻融。四、 注意事项1、 所有的试剂及器具均需预冷后使用；2、 细胞的数量不应少于0.5107个/mL；， 3、 以上各缓冲液的使用量是以20L细胞压积为例，如细胞压积不同，请参考下表加入各缓冲液。细胞压积PCVBuffer ABuffer BBuffer C10L100L5.5L50L20L200L11L100L50L500L27.5L250L100L1mL55L500L 4、 一般常规提取的蛋白样品，进行后续试验不需要透析，但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想，则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐，建议使用凯基透析Buffer (Cat: KGBP001)透析后进行后续分析。