风疹病毒多表位诊断抗原的制备

风疹病毒多表位诊断抗原的制备风疹病毒多表位诊断抗原的制备 2016/06/13 病毒学报2016年第三期摘要：原核表达与层析纯化获取风疹病毒多表位诊断抗原，并初步评价其抗原性。将衣壳蛋白、以及包膜糖蛋白三个主要免疫显性表位串联，密码子优化后全基因合成；利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有标签的表达质粒中，在大肠杆菌中进行表达，并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白；利用（）技术对目的蛋白抗原性进行鉴定，并建立抗体检测技术，初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的多表位诊断抗原，实验表明目的蛋白不但可以被单克隆抗体识别，还可以被多克隆抗体、阳性血清相应抗体所识别。分别对份急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测，发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的多表位诊断抗原，偶联后可以作为检测抗原应用于血清学检测中。关键词：多表位抗原；风疹病毒；原核表达；层析纯化；标签风疹病毒（是风疹的病原体，属于披膜病毒科风疹病毒属，为有包膜正义单链病毒，人是唯一宿主。只有一个血清型，但有多个基因型，目前共有个被认可的基因型（，）和一个临时基因型（）正在或曾在世界各地流行。近年来我国的流行是由和基因型共循环引起的多个传播链所致，其中基因型为优势型别。感染成人一般为自限性疾病，但是孕妇感染，尤其是妊娠前三个月的新发感染将会引发流产、死产或胎儿感染后先天性风疹综合征。鉴于的新近感染或急性感染诊断对预防新生儿风疹意义重大，我国已经将感染检测作为孕期检测的一项重要内容。临床上通过检测孕妇血清抗体以确定新近感染或急性感染，但目前国内检测人血清抗体诊断试剂盒参次不齐，需要进一步优化。一般来说，新发感染的血清学诊断依赖于抗体的检测或者恢复期病人血清抗体水平四倍升高。感染的体液免疫应答始于低亲和力抗体的产生，随后抗体类型转换导致亲和力高、免疫效应强的抗体型别产生而消除入侵的病原体。其中补体决定区的体细胞超突变将导致亲和力逐渐增强的抗体产生。抗体亲和力检测也常被用于新发感染与过往感染的区分，但尿素等解离剂打开不同亲和力抗体与抗原的结合程度无法准确把握。因此抗体的检测结果作为临床辅助诊断相对比较客观。三个结构蛋白（衣壳蛋白、两个跨膜糖蛋白和）均可引发抗体应答，但只有蛋白为免疫显性的。免疫沉淀和免疫印迹技术也证实大部分抗抗体应答主要由蛋白诱发，而且血凝素活性和病毒中和活性都归于蛋白的，。已被证实是病毒的主要中和表位，并且作为一种多肽诊断抗原构建的检测方法可以与传统检测、血凝素凝集实验以及病毒中和滴定法相媲美。而且这个表位在不同株之间是保守的，已被推荐用来测定保护性免疫检测指标，因此诊断抗原中必须包含这个表位。同时和衣壳蛋白也同样能引发机体免疫应答，已经鉴定出糖蛋白上一个细胞表位，衣壳蛋白上两个细胞表位和。考虑到衣壳蛋白在病毒颗粒中的含量以及在病毒生命周期中的重要作用，我们在构建表位依赖性诊断抗原时也同时加入衣壳蛋白上的两个细胞表位。谷胱甘肽转移酶基因融合表达系统具有蛋白表达、纯化和检测多种用途。氨基端融合日本血吸虫的蛋白很早就被证实可以在大肠杆菌（）中可溶性、高水平的表达。自身在中表达可以自发折叠成具有天然构象的具有酶活性的蛋白质。拥有的全部氨基酸序列的融合蛋白也被证实具有酶活性。而且细菌裂解物中的融合蛋白利用亲和层析介质很容易纯化。本实验中我们将多表位抗原插入到表达载体中，使其可以表达出融合蛋白，一是避免过多的酶偶联到抗原表位上产生空间位阻效应而将抗原位点封闭，二是使融合蛋白可以在中高效可溶性表达。同时在融合蛋白的羧基端我们添加了标签，可以利用更加便宜的亲和介质进行目的蛋白的纯化，大大降低了蛋白纯化的成本。本研究利用原核表达系统和层析纯化技术获取的串联表位诊断抗原建立抗体捕获法，来鉴定的新近感染或急性感染。一、材料与方法主要材料与试剂（）和载体为科室现存，限制性内切酶和以及连接酶购自日本公司。基因合成根据大肠杆菌密码子偏好表，对多表位串联片段基因序列进行优化（图），并在其端引入酶切位点，端引入酶切位点，交由大连宝生物公司合成，基因片段大小为，命名为。表达质粒的构建基因片段人工合成后存于载体上，用限制性内切酶和将目的片段酶切下来，连接到相同酶切处理的表达载体（本科室构建，图）上，转化（）感受态细胞。次日挑取单克隆菌落进行培养与小量表达，提取阳性克隆质粒进行测序和双酶切鉴定。鉴定正确的质粒命名为。目的蛋白的表达和纯化将新鲜转化质粒的（）接种于含氨苄霉素（）的培养基（蛋白胨，酵母提取液，）中，振荡培养后等倍扩菌。继续培养后将温度调至，终浓度诱导后离心收菌（，）。用溶液（，）重悬菌体沉淀后超声破碎（次），离心（，）收集上清。上清中加入终浓度为的后上样于用溶液（，）平衡的层析介质中。待上样完毕，用，咪唑（溶于溶液中）进行梯度洗脱，并收集相应洗脱液。分别取样电泳观察目的蛋白的含量以及分布情况，将目的蛋白含量最高，纯度最好的洗脱液于基液（，）中进行彻底透析备用。层析介质用基液平衡后将透析液上样，待上样完毕，用，（溶于基液中）进行梯度洗脱并收集相应洗脱液。分别取样电泳观察目的蛋白的含量以及分布情况。将目的蛋白含量最高，纯度最好的洗脱液于（，的，）中彻底透析后，于保存备用。目的蛋白的鉴定利用技术对抗原性进行鉴定。蛋白溶液以及标签蛋白溶液（本实验室预制）上样进行电泳（恒流，），而后半干转膜至硝酸纤维素膜（）（恒压，）上。转膜完成后，膜用封闭液（含脱脂奶粉的）于处理过夜。次日分别加入封闭液稀释的（；）、（；）、阳性血清（）、阴性血清（），常温孵育后用洗膜次。检病毒学报卷测抗体对应为（；）、（；）和（；），常温孵育后洗膜次，最后显色，清水终止显色。偶联反应抗体捕获法构建中，检测抗原被设计为偶联物。偶联反应按照试剂盒操作步骤操作（，）。简言之，纯化的去内毒素处理后，在中透析，透析完成后将终浓度调整为。然后逐滴加入合适体积的（）。缓慢搅拌下，孵育过夜。向溶液中加入（），室温孵育终止反应。最后加等体积，室温孵育后，保存备用。利用棋盘法滴定和评价偶联反应效率。用碳酸盐包被缓冲液二倍系列稀释（），每个微孔板中加入后，孵育。用洗涤次后，每孔加入封闭液封闭包被孔中的非特异蛋白结合位点。孵育后，洗涤次。然后，用二倍系列稀释（），每孔加入后，孵育。洗涤次后每孔加入（，）孵育。最后加入（）终止反应。参考基线波长为，用酶标仪测定波长吸收度值（值）。目的蛋白诊断效能的评价利用建立血清抗体诊断试剂盒，并对临床和实验室确诊的血清样本进行检测，评价试剂盒对阴阳性血清标本的鉴别能力。简言之，碳酸盐包被缓冲液稀释抗二抗（）后包被板条孔，封闭液封闭非特异性位点；加入待测血清（：稀释），置孵育，然后洗涤；加入偶联物（稀释），置孵育，然后洗涤；加入显色，参考基线波长为，用酶标仪测定波长为吸收度值（值）。二、结果目的蛋白的构建与表达纯化的构建如图，融合蛋白的氨基端为标签，紧跟着衣壳蛋白两个抗原表位（和），然后是抗原表位，羧基端为标签，间隔中添加了必要的连接臂（如等）以及合适的酶切位点（如、和）。双酶切处理（和）表达载体和获取带有相同粘性末端的载体（大约；图）和片段（约；图），经过连接酶连接转化入（）感受态细胞后进行培养，测序、小量表达（图）和双酶切鉴定结果（图）证实目的片段已经成功插入表达质粒中，并将正确质粒命名为质粒。挑取个新鲜转化质粒的（）单克隆菌落培养适当时间后进行诱导表达，电泳结构发现，与对照组相比，在约处有明显表达条带（图），表明蛋白可以在大肠杆菌中有效表达。大量表达后发现目的蛋白主要存在于超声菌体沉淀重悬液的上清中（图），目的蛋白含量达到。将上清液进行处理后利用亲和层析进行纯化，电泳结果发现，目的蛋白主要存在于咪唑洗脱液中（图），并且目的蛋白含量达到了，浓度为。咪唑洗脱液经过完全透析后，上阴离子交换层析柱，电泳结果发现目的蛋白主要分布于洗脱液中，并且目的蛋白的含量达到了，浓度为（图）。最后将洗脱液在中进行透析，保存备用。目的蛋白的鉴定根据目的蛋白中包含、表位等特征，对蛋白的抗原性进行初步鉴定。结果显示，利用羊抗多克隆抗体、鼠抗标签抗体以及阳性血清作为捕获抗体，其相应二抗作为检测抗体，在膜上相应位置都出现了明显条带（图）；并且阴性血清作为捕获抗体，在膜上相应位置没有出现对应条带。表明了蛋白包含了抗原表位和标签。目的蛋白诊断效能的评价通过棋盘滴定法确定最适工作浓度为，并且表明和已经成功偶联，可以应用于抗体检测试剂盒的建立。利用偶联蛋白作为诊断抗原建立抗体检测试剂盒，分别对份阳性血清、阴性血清和健康人群血清样本进行检测（表）。从图可得出，阳性血清样本、阴性血清样本以及健康人群血清样本值分布范围分别为（，置信区间）、（）和（）。以阴性结果平均数的倍粗略估算试剂盒的值为，得出其灵敏度为，特异性为。并且阳性血清样本与阴性血清样本和健康人群血清样本值分布明显不同（），而阴性血清样本与健康人群血清样本值分布无明显区别（）。对表数据进行卡方检验，我们发现，其，说明诊断结果与临床和实验室确诊结果之间无统计学意义。而且值为，表明一致性优越。因此，新型抗体诊断试剂盒可以很好地鉴别阴阳性血清样本。三、讨论本研究中，我们选择了蛋白上已经被用图抗原诊断效果评价于检测的一个重要显性表位，而且添加了衣壳蛋白的两个表位和作为诊断抗原，其目的是提高诊断试剂的灵敏度。虽然与包膜蛋白相比，在诱发免疫应答产生中和活性方面蛋白抗原表位处于次要地位，但对于诊断而言抗原意义也很重要，。在等研究中，衣壳蛋白多肽抗原与阳性血清反应的滴度都在以上，表明阳性血清中存在大量与蛋白上抗原决定簇可以发生反应的抗体（已排除非特异结合反应的存在），并且通过动物实验证实抗原也具有较高的免疫原性，可以诱发强烈的抗体应答。针对目前市场上主要以蛋白作为诊断抗原的试剂盒出现不同程度漏检的现象，本研究添加蛋白上的特异表位，旨在初步探索提高诊断试剂灵敏度的方案。作为融合蛋白前缀有效提高蛋白在原核表达系统中表达量的同时，也在一定程度上增强了其可溶性表达（图）。实验证实了携带病毒的主要免疫显性表位，并且可以与阳性血清中的相应抗体发生反应，初步证实了其抗原性可以应用于新近感染或急性感染的诊断。另外我们将与进行了偶联，并通过棋盘滴定法评价了偶联效果以及确定了的最适工作滴度，为成品试剂盒的研发鉴定了基础。此方法不但通过添加前缀有效避免了偶联带来的抗原效价降低或失活，还将衣壳蛋白的两个细胞表位纳入诊断抗原分子中，同时提高了检测方法的灵敏度和特异性。虽然与偶联实验的重复性优异，但是是过吸引偶联还是其他原因避免或者减少诊断抗原表位发生偶联还待进一步研究。另外，本研究中诊断抗原中保留和标签，一是为了偶联反应中减少对表位的偶联反应，二是为了稳定串联表位在表面的有效展示，至于两个标签对诊断抗原特异性的影响还需要进一步的研究，据目前许多诊断抗原的研究中大多也携带着标签。并且新建立的诊断试剂是以捕获法作为基础研制，已经将标签的影响降低到了最低。我们利用本实验室保存的临床和实验室诊断确定的阴阳性血清作为血清盘进行抗原诊断能力的评价，尚未按照商品化血清学诊断试剂研发的要求，采用检定所或其他权威机构建立并提供的系列血清，并就检测特异性及敏感度与国际上的商品试剂作比较。本研究旨在新型诊断抗原的构建制备、抗原性研究以及其诊断能力的初步探索，实验将进一步拓展。总之，我们筛选出结构蛋白上的抗原表位，并将其串联在标签的羧基端，让其在原核表达细胞中进行表达，利用亲和层析和离子交换层析成功获取了带有前缀蛋白和后缀标签的诊断抗原，并将其应用于风疹病毒新近感染和急性感染的诊断，证实了诊断抗原在检测技术中的实用性，很好地解决了抗原在偶联过程中造成的抗原失活或抗原效价降低，有效提高了检测试剂盒的灵敏度和特异性。