大肠杆菌发酵生产L

大肠杆菌发酵生产L-色氨酸工艺简析廖韦红;褚宏;纪衍英【摘要】本文对L-色氨酸进行了简要概述，指出利用大肠杆菌工程菌直接发酵生产 L-色氨酸为国内主流方法,并对其成熟的发酵工艺控制、提取工艺进行了简析，并指 出部分可进一步优化的工艺点。其中发酵工艺简析包括菌种培养基增加一定溶度抗 生素和控制发酵温度来控制质粒稳定性;分析物料作用并提出优化后的种子、发酵 培养基组成;菌种无需控制溶氧,而发酵则用溶氧反馈补料;控制乙酸和氨氮浓度、顺 序升温缩短周期降低抑制性副产物作用。分离提取工艺简析包括硫酸酸化p H2-3, 陶瓷膜过滤并控制滤液平均单位为14000-18000u/ml,阳离子树脂纯化,醋酸调p H5.89Q5%活性炭60工脱色20-30min,蒸发浓缩结晶，纯化水洗涤整条工艺路线。期刊名称】 生物技术世界年(卷),期】 2016(000)004【总页数】2页(P11-12)【关键词】L-色氨酸;大肠杆菌;发酵生产;提取;工艺【作 者】 廖韦红;褚宏;纪衍英【作者单位】 1山东鲁抗生物制造有限公司，山东邹城273517;2山东鲁抗医药股份有限公司，山东济宁272000;3山东鲁抗立科有限公司，山东济宁272000【正文语种】 中 文中图分类】 TQ92L-色氨酸，1825年首次被发现，是第二必需氨基酸，广泛应用于各行业。化学名 为a-氨基-p-吲哚丙酸，白色或微黄色片状晶体或粉末，溶于水，在稀酸或稀碱中 较稳定。在有NaOH、CuSO4存在下加热会分解产生大量吲哚。其生产方法最早是化学合成法和蛋白质水解法，在上世纪90年代就被酶促转化法 所替代。又因酶促反应法底物价格高，转化率低，很快被微生物发酵法替代，有添 加前体发酵和直接发酵两种形式。前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。又随 着重组DNA技术在L-色氨酸生产菌株的筛选中的可靠应用，使直接发酵法更具优 势，成为目前的主流工业方法。L-色氨酸生产菌株有谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，枯草杆菌，重组大肠杆菌。谷氨 酸棒杆菌以日本协和的Ikeda等改造后的KY9218菌株，产酸达到58g/l1 为 代表；黄色短杆菌以Shiio等的诱变株产酸达到19g/l 2 为代表；Kurahashi 等以枯草杆菌为出发菌株，82h产酸达到21.5g/l 3; Azuma等以大肠杆菌为 出发菌株，产酸到达54.5g/ lo 由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚、易培养、发酵周期短且基因表达更高效等特性， 较其余出发菌得到更广泛的应用。国内很多院校及研究部门对大肠杆菌基因敲除与 表达做了大量研究工作，山东鲁抗也以W3110为出发菌株构建了自己的高产大肠 杆菌工程菌，35h产酸45.5g/l4。影响大肠杆菌工程菌放大培养的因素有质粒稳定性、培养基组成、溶氧控制和抑制 性代谢产物的积累四个方面。本文侧重从工业生产放大角度，探究发酵最佳工艺。1.1 质粒稳定性菌种放大培养基采用一级（LB+抗生素）固体培养基斜面，二级（LB+抗生素）液 体培养基，培养基中添加50mg/l抗生素或10mg/l四环素5 是为了保证菌种 质粒的稳定性。发酵培养选取36工时，大肠杆菌菌比生长速率大而质粒分配不稳定；选取30工时质粒基本不丢失，但菌体生长缓慢，产酸下降。所以实际生产两级发酵中，种子采取32-33C,发酵采取32-36C顺序升温。1.2 发酵培养基组成 因母菌种没有利用淀粉和蔗糖的相关酶系6，碳源为葡萄糖。低浓度初糖前期 菌体生长较快， 但进入主发酵期菌体增长无力， 活力下降；高浓度初糖会因葡萄 糖效应导致乙酸大量积累，反而抑制菌体生长与产物合成，所以葡萄糖浓度是培养 基组成的最关键因素。无机氮源以硫酸铵为最好，不仅提供氮元素，也提供硫酸根。尿素因细胞脲酶活力 不强而不可用，醋酸铵因醋酸根抑制产物合成也不可用。有机氮源以酵母粉为最好，是因其营养配比与工作菌体成分相似。而玉米浆等因促 进乙酸的积累不宜使用。柠檬酸钠和葡萄糖联合代谢会抑制丙酮酸激酶，减弱糖酵解途径7。磷酸盐浓 度可调节进入EMP途径和HMP途径的碳硫8,调节发酵生产周期而不可或 缺。硫酸镁因镁离子是许多酶的辅助因子和激活剂，而不可缺少。但离子强度如果 太大反会抑制产物合成，锰离子可部分替代起到激活作用。生物素通过改变细胞膜的通透性，让更多色氨酸分泌到胞外，减少反馈抑制。VB5 产生的辅酶A参与各种酰化反应，糖与氨基酸代谢，促进菌体的生长5。所以认为种子培养基最佳配比为葡萄糖30g/l、硫酸铵15g/l、酵母粉10g/l、柠 檬酸1.5g/l、磷酸二氢钾5g/l、硫酸镁1.2g/l、硫酸亚铁50mg/l、微量元素 1ml/l、生物素 30ppm、VB5100ppm，氢氧化钠调 pH6.8。发酵培养基最佳配比为葡萄糖15g/l、硫酸铵5g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸0.5-2g/l、磷酸二氢钾10g/l、硫酸镁2g/l、硫酸亚铁100mg/l、微量元素2ml/l、泡 敌0.5ml/l，氢氧化钠调pH6.8。其中微量元素为二水锰酸钠0.15g/l、硼酸1g/l、氯化钻0.5g/ l、氯化锰0.3g/l、 硫酸铜 0.5g/l、硫酸锌 1.2g/l , EDTA1.0g/l。1.3 溶氧控制 一级发酵侧重菌种放大，一般采用1：1的通气比，搅拌采用最大线速度放大测算 而来，保持恒定，溶氧下降到一定程度即可转种，无需补糖无需控制溶氧。发酵培 养一般采用1：0.7-1.1的通气比，并通过调整空气流量和搅拌转速来调控溶氧供 给。此与一般细菌发酵无差异。L-色氨酸发酵分为4个阶段，前6h为生长的延滞期，6-26h为对数期，26-32h 为稳定期，32h以后为衰亡期。在发酵过程中葡萄糖半饥饿供给，并用溶氧反馈 补料技术监控补料过程，有利于产物表达9。工业生产在6至32小时之间控制15-30%溶氧，即溶氧高于30% ，反馈会增大瞬间补料量，当溶氧低于15% ，反馈会减少瞬间补料量，既保证菌体活性又降低葡 萄糖效应。1.4抑制性代谢产物的积累 主要是乙酸、旁支酸及氨氮。控制初始糖浓度，利用溶氧反馈补料技术，培养基中 柠檬酸的适量配比，顺序升温发酵控制都是控制乙酸的产生。除了提高葡萄糖消后 质量，最直接降低氨氮的方法是利用NaOH调起始培养基pH，并部分替代氨水 混合补料。分离提取工艺有离子交换、结晶、有机溶剂萃取等。其中离子交换具有工艺简便、投资少、节能、污染小的优点。国内外大多先利用离子交换对含有L-色氨酸的发 酵液进行纯化，最后结晶得到L-色氨酸固体。发酵液预处理有两种方法，稀释和酸化，使产物全部进入水相。在实际工业生产考 虑收率与溶液体积，酸化比稀释成本低。又因硝酸腐蚀性强，醋酸、草酸成本高， 盐酸离子活度高，腐蚀性强，酸化剂常选硫酸。固液分离多采用陶瓷膜过滤，而不 管采用连续稀释还是间隙洗涤工艺，结束单位与收率存在一个非线性相关，结束单 位越低收率越高，滤液的平均浓度也越低。更重要的，溶液单位与体积与预处理溶液单位体积存在一个非线性相关。为了保证 陶瓷膜收率，稀释体积需尽量大，产物溶液平均浓度就小。但是阳离子交换树脂的 最大平衡吸附量随溶液pH降低而增大；交换过程的吸附速率随产物浓度的升高而 增大。为了保证树脂收率需提高产物溶液平均浓度，这样就产生了一个最佳浓度控 制点。故此采用酸化pH2-3 (符合其pKa值2.38 )，并控制陶瓷膜滤液浓度为14000- 18000u/ml ( 30-35C)。为提高产品质量，在树脂交换后仍需一步脱色。虽然有报道11最佳的脱色工艺：活性炭用量0.5%，室温，时间20min。但实际工业生产中因经过前面纯化后 产物溶液稳定性提高，而过滤速度低、等电点产物溶解度低等原因，需采用升温脱 色工艺。成盐剂的选择，醋酸最佳，刚好与大肠杆菌密集发酵有大量副产物乙酸不 冲突。故此树脂交换液用乙酸调pH5.89 , 0.5%活性炭控制温度60C, 20-30min脱色 过滤，蒸发浓缩后降温结晶，离心分离，纯化水洗涤可制得高质量产品。本文未对菌种斜面及摇瓶周期作分析，未对L-色氨酸发酵接种量、中间监测作分 析。也有人提出，硝酸铵是最最理想的发酵无机氮源；也有文献报道利用L-色氨 酸和肌苷成复盐结晶分离纯化。这都可作为工业化进一步探讨的方向。【相关文献】1 Ikeda M，katsumata R. Hyperproduction of tryptophan by Corynebacteriumglutamicum with the modified pentose phosphate pathway.Applied And EnviromenttalMicrobiology，1 999，65(6)：2497-2502.2 Nakaawa H，et al.Synthisis of L-Tryptophan from pyruvate ，ammonia and indoleJ.Agricultural and Biogogical Chemistry，1972.36(13)：2523-25283 Shiio I，Sugimoto S，Kawamura K.Production of L-Tryptophan by azaserine- resistant mutants of Brevibacterium flavumJ. Agricultural and Biogogical Chemistry， 1982.46(7)：1849-19544 于传军，左良成，徐宝兴，徐洪利，赵体金，李水仙，王东杰，戴晓燕，丁贞科高产L-色氨 酸的大肠杆菌工程菌P 中国专利：102453691 A. 2012-05-165 娄秀平，沈健增，蔡宇杰，廖祥儒，张大兵维生素对大肠杆菌Escherichia+coliJN8产L-色 氨酸的影响R 食品与生物技术学报，2013 ,32 ( 9 )6 王东阳，蔡传康，闫汝东，冯志彬，张华正交试验优化L-色氨酸发酵培养基的研究J.安 徽农业科学，2011，39(4)：1910-1911，1914. 7刘新星，陈双喜，储炬，庄英萍，张嗣良.柠檬酸钠对枯草杆菌生长代谢及肌苷积累的影响J 微生物学报，2004,44 ( 5 ): 627-6308 赵春光，谢希贤，徐庆阳，陈宁磷酸盐对Escherichia+coli+TRJH L-色氨酸发酵代谢流分布 的影响J 天津科技大学学报，2009,24 ( 5 ): 10-13 , 26.9 程立坤，赵春光，黄静，徐庆阳，谢希贤，陈宁葡萄糖浓度对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响R 食品与发酵工业，2010 ,36 ( 3 ):5-910 贺希娜，刘峰丄-色氨酸发酵液的活性炭脱色工艺研究J 安徽农学通报，2012 ,(11): 32-33,41.