线粒体钙超载

1Calcium Homeostasis and Calcium Overload in Cell(细胞内钙稳态与钙超载细胞内钙稳态与钙超载)Pathophysio.Dep.Of SDU袁中瑞袁中瑞 2In all eukaryotic cells,the cytosolic concentration of Ca2+ions(Ca2+C)is tightly controlled by interactions among transporters,pumps,channels and binding proteins.Finely tuned changes in Ca2+C modulate a variety of intracellular functions ranging from muscular contraction to secretion,and disruption of Ca2+handling leads to cell death.3 细胞内钙稳态调节细胞内钙稳态调节 (Calcium Homeostasis in Cell 细胞内钙超载细胞内钙超载 (calcium overload in cell)线粒体与钙线粒体与钙 (mitochondria and calcium)4一、Calcium Homeostasis in Cell5Fig.1.Ca2+distribution in the cell.High and low Ca2+domains are marked with orange and blue,respectively.(From:Calcium signaling and apoptosis,Biochem Biophys Res Commun.2003 May 9;304(3):445-54)67(一一)钙平衡钙平衡1 1、钙瞬变值、钙瞬变值 Ca2+EC:110 mM Ca2+C:0.110M细胞内钙细胞内钙:44%存于胞内钙库（肌浆网存于胞内钙库（肌浆网/内质内质网）；网）；细胞内游离钙仅细胞内游离钙仅0.005%生理性钙瞬变值生理性钙瞬变值：即细胞内钙浓度的增加，平均介于即细胞内钙浓度的增加，平均介于0.110M之间。之间。钙荧光探针钙荧光探针（indo-1indo-1、fura-2fura-2、fluo-3 AM fluo-3 AM 等等等）以及等）以及Aequorin（水母发光蛋白）、（水母发光蛋白）、GFP-based fluorescent Ca2+probes（such as cameleons and pericams）等。）等。89102 2.钙移动的决定因素钙移动的决定因素钙的平衡和钙的瞬变值依赖于两组蛋白质钙的平衡和钙的瞬变值依赖于两组蛋白质 一组负责钙的输入和激活钙释放一组负责钙的输入和激活钙释放 另一组负责钙的输出和摄取回收另一组负责钙的输出和摄取回收 (1(1）CaCa2+2+进入胞液的途径进入胞液的途径 (2(2）CaCa2+2+离开胞液的途径离开胞液的途径11(1(1）CaCa2+2+进入胞液的途径进入胞液的途径 Ca Ca2+2+进入胞液是顺浓度梯度的被动过程进入胞液是顺浓度梯度的被动过程 细胞外细胞外CaCa2+2+跨膜入胞跨膜入胞细胞内细胞内CaCa2+2+释放释放 细胞内细胞内CaCa2+2+增加主要取决于内增加主要取决于内CaCa2+2+释放释放 另外另外CaCa2+2+还可通过还可通过NaNa+-CaCa2+2+交换蛋白进入胞液交换蛋白进入胞液12 1）细胞膜细胞膜CaCa2+2+通道通道电压依赖性电压依赖性CaCa2+2+通道（通道（voltage-dependent voltage-dependent calcium channelcalcium channel，VDCVDC）：）：其活动受膜电压变其活动受膜电压变化的影响化的影响 L-L-型型(Lasting-,Lasting-,持续型持续型)：特点是开启后产生特点是开启后产生持续持续CaCa2+2+内流；内流；（*可被可被钙通道阻滞剂所阻断钙通道阻滞剂所阻断）T-T-型型(Transitory,Transitory,短暂短暂型型)：开放时间短暂，开放时间短暂，很快失活；很快失活；N-N-型型(Neuronal,Neuronal,神经型神经型)：开放时间开放时间介于介于L L、T T 型，只存在于某些神经元上。型，只存在于某些神经元上。13受体操纵性钙通道受体操纵性钙通道(receptor-operated receptor-operated calcium channelcalcium channel，ROC)ROC)：a a 配体与受体结合后配体与受体结合后直接调节钙通道开放直接调节钙通道开放；b b 配体与受体结合后配体与受体结合后G G蛋白偶联蛋白偶联调节钙通调节钙通道开放道开放；c c 受体与配体结合后受体与配体结合后G G蛋白偶联蛋白偶联产生第二产生第二信使信使修饰修饰VDC(VDC(可能是可能是L-L-型型VDC)VDC)，调节调节VDCVDC对对CaCa2+2+的通透性的通透性。14egeg:1 1受体激动剂受体激动剂G G蛋白蛋白 AC AC cAMPcAMP PKA PKA 磷酸化钙通道，胞外磷酸化钙通道，胞外CaCa2+2+内流。内流。152 2）细胞内贮存钙释放的机制）细胞内贮存钙释放的机制 细胞内游离细胞内游离CaCa2+2+主要贮存于内质网主要贮存于内质网(ER)ER)肌浆肌浆网网(SR)SR)中，经中，经CaCa2+2+释放通道释放。释放通道释放。1,4,5-1,4,5-三磷酸肌醇三磷酸肌醇(IPIP3 3)敏感钙池敏感钙池:受受IPIP3 3受体系受体系统调控统调控 IP IP3 3不敏感钙池不敏感钙池:受受ryanodineryanodine受体系统调控受体系统调控16 IPIP3 3受体系统受体系统当当IPIP3 3与与IPIP3 3受体受体(IPIP3 3R)R)结合结合开放钙通道，开放钙通道，ER/SRER/SR中的钙释放入胞浆中中的钙释放入胞浆中IPIP3 3R-typeR-type介导的介导的CaCa2+2+释放依赖于释放依赖于一定浓度的一定浓度的胞浆胞浆CaCa2+2+（CaCa2+2+ii），），呈钟形反应呈钟形反应(bell-bell-shaped response);IPshaped response);IP3 3R-type,R-type,则更接则更接近线性反应。近线性反应。IPIP3 3R R系统释放细胞内钙受许多因素影响：系统释放细胞内钙受许多因素影响：CaCa2+2+ii；碱性环境中碱性环境中CaCa2+2+释放增加释放增加 K K+通过通过K K+通道进入钙池，进而促进通道进入钙池，进而促进CaCa2+2+释放释放 肝素是肝素是IPIP3 3R R的持异性拮抗剂的持异性拮抗剂17 ryanodineryanodine受体系统受体系统在多种细胞内普遍存在在多种细胞内普遍存在ryanodineryanodine受体（以下简受体（以下简称称RyRRyR）调节调节IPIP3 3不敏感钙池内钙的释放。不敏感钙池内钙的释放。现知现知RyRRyR至少有至少有3 3种亚型种亚型:RyRRyR1 1存在于骨路肌存在于骨路肌SRSR上，有上，有5032503250375037个氨基酸个氨基酸残基；残基；RyRRyR2 2存在于心肌上，有存在于心肌上，有49674967个氨基酸残基，个氨基酸残基，RyRRyR3 3存在于非肌性细胞上，比前两者小得多，只存在于非肌性细胞上，比前两者小得多，只有有641641个氨基酸残基。个氨基酸残基。18CaCa2+2+与与RyRRyR上的上的CaCa2+2+结合位点结合，而触结合位点结合，而触发发SRSRERER释放释放CaCa2+2+。这种这种CaCa2+2+诱发诱发CaCa2+2+释放释放(calcium induced calcium calcium induced calcium releaserelease，CICR)CICR)的正反馈机制是的正反馈机制是RyRRyR系系统触发统触发CaCa2+2+释放的特征。释放的特征。普鲁卡因、钌红为普鲁卡因、钌红为RyRRyR的拮抗剂，咖啡因、的拮抗剂，咖啡因、ryanodineryanodine为其激动剂。为其激动剂。193 3）NaNa+-CaCa2+2+交换蛋白交换蛋白NaNa+-CaCa2+2+交换蛋白交换蛋白:为双向性离子转运器，为双向性离子转运器，催化催化NaNa+从膜的一侧转运到另一侧，以交换从膜的一侧转运到另一侧，以交换CaCa2+2+的相的相反方向的运动。反方向的运动。3 NaNa+:CaCa2+2+，是产电的。，是产电的。3Na+Ca2+胞外胞外胞内胞内20NaNa+-CaCa2+2+交换交换是利用业已建立起来的离子的电是利用业已建立起来的离子的电化学位能，即由化学位能，即由NaNa+-K-K+ATPaseATPase 建立的胞内外建立的胞内外NaNa+梯度，而不直接利用梯度，而不直接利用ATP。CaCa2+2+流动的方流动的方向取决于向取决于NaNa+梯度的方向，只是后者的方向相梯度的方向，只是后者的方向相反。反。NaNa+-CaCa2+2+交换的可逆电位约在交换的可逆电位约在15mV到到 30mV之间。膜电位负于可逆电位时，之间。膜电位负于可逆电位时，NaNa+内向内向和和CaCa2+2+外向运动。反之，膜电位正于可逆电位，外向运动。反之，膜电位正于可逆电位，也即膜去极化，则也即膜去极化，则NaNa+外向而外向而CaCa2+2+内向运动。内向运动。21(2(2）CaCa2+2+离开胞液的途径离开胞液的途径CaCa2+2+离开胞液是逆浓度梯度、耗能的主动过程离开胞液是逆浓度梯度、耗能的主动过程:1)Ca 1)Ca2+2+-ATPATP酶酶 2)Na 2)Na+-CaCa2+2+交换蛋白交换蛋白221)Ca1)Ca2+2+-ATPATP酶酶心肌细胞主要依靠心肌细胞主要依靠CaCa2+2+-ATPATP酶酶转运转运CaCa2+2+回到细回到细胞内贮存系统或移出细胞外胞内贮存系统或移出细胞外恢复细胞内的恢复细胞内的CaCa2+2+稳态。稳态。CaCa2+2+-ATPATP酶有酶有1010个螺旋疏水节段，称为个螺旋疏水节段，称为M1M1M10M10。在在M4M4，M5M5，M6M6，M8M8形成的一个通道中有形成的一个通道中有2 2个对个对CaCa2+2+具有很高亲和力的结合位点。这具有很高亲和力的结合位点。这1010个个螺旋疏水节段与螺旋疏水节段与3 3个细胞质亲水环相连接。亲个细胞质亲水环相连接。亲水环包含水环包含ATPATP结合位点和磷酸化位点。结合位点和磷酸化位点。23 细胞膜细胞膜CaCa2+2+-ATPATP酶酶:利用利用ATPATP提供的能量逆细胞膜两侧高的电化学提供的能量逆细胞膜两侧高的电化学梯度泵出梯度泵出CaCa2+2+，其活性受钙调蛋白、，其活性受钙调蛋白、PKAPKA、PKCPKC等因子的调控。等因子的调控。细胞器（内质网及肌浆网）钙细胞器（内质网及肌浆网）钙ATPATP酶：酶：位于细胞内钙位于细胞内钙贮存系统（细胞器）膜上，蓄积贮存系统（细胞器）膜上，蓄积CaCa2+2+到细胞器腔中。到细胞器腔中。心脏和血管的肌浆网心脏和血管的肌浆网CaCa2+2+-ATPATP酶构型具有特殊酶构型具有特殊性，性，其功能调节依赖于一种辅助性跨膜蛋白其功能调节依赖于一种辅助性跨膜蛋白-受磷蛋白。受磷蛋白。24受磷蛋白（受磷蛋白（phospholamban,PLNphospholamban,PLN)受磷蛋白由五个亚基受磷蛋白由五个亚基(分子量分子量6 6 KD)KD)组成，每个组成，每个亚基均可磷酸化，有两个不同的磷酸化位点，亚基均可磷酸化，有两个不同的磷酸化位点，分别对分别对cAMPcAMP依赖的蛋白激酶依赖的蛋白激酶A(PKA)A(PKA)和另一种钙和另一种钙调蛋白依赖的蛋白激酶起反应。调蛋白依赖的蛋白激酶起反应。受磷蛋白的磷酸化受磷蛋白的磷酸化肌浆网肌浆网CaCa2+2+-ATPATP的跨膜结的跨膜结构改变，构改变，CaCa2+2+-ATPATP的泵能力随后被激活。的泵能力随后被激活。（HF）NE，-R PKAPKA :Pi化化PLN,非非Pi 化化PLN 心肌舒张功能障碍心肌舒张功能障碍252)Na2)Na+-CaCa2+2+交换蛋白交换蛋白在细胞内高钙时作为钙输出系统工作在细胞内高钙时作为钙输出系统工作NaNa+-CaCa2+2+交换其转运交换其转运CaCa2+2+的速率高，约为钙泵的几的速率高，约为钙泵的几十倍。十倍。Ca2+3Na+胞外胞外胞内胞内2627举例：举例：给予给予-激动剂激动剂心肌收缩力心肌收缩力，舒张速率，舒张速率 L-VDCPLNCa2+-ATPaseCa2+-ATPase28二、细胞内钙超载二、细胞内钙超载29Temporally and spatially organized increases in Ca2+c,Ca2+m,and Ca2+n represent one of the most commonly used intracellular signals.However,prolonged changes in Ca2+distribution including an elevation in Ca2+c,Ca2+m,and Ca2+n and a Ca2+decrease in ER trigger a variety of cascades that lead to cell death.30 1972 年年Shen 和和Jennings发现犬心脏冠状动脉短发现犬心脏冠状动脉短暂闭塞后复灌可加速细胞内暂闭塞后复灌可加速细胞内Ca2+的积聚的积聚,并首并首次提出钙超载之说次提出钙超载之说,此后此后,Ca2+在再灌注损伤中在再灌注损伤中的作用一直成为人们研究的重点。的作用一直成为人们研究的重点。各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为钙超载钙超载(calcium overload)calcium overload)。31Possible Correlation of Calcium Overload with CytotoxicityIncreasing of Ca2+C,calcium overload,is the primary cause of cytotoxiceffects,including necrosis and apoptosis,of toxicants and stress induced responses.eg.Cardiotoxicity:oxidative stress,ischemia-reperfusion;Hepatotoxicity:CCl4Immunotoxicity:glucocorticoidsKidney toxicity:oxidative stress,heavy metalsNeurotoxicity:lead,ischemia,excitatory amino acid32Role of Calcium Overload in Cellular InjuryRelation of Ca2+C to early reversible injury -bleb and cytoskeletalalteration -cell volume changes()-nuclear changes()-condensation of mitochondriaRelation of Ca2+C to irreversible injury -swollen mitochondria -DNA strand break33(一）一）Ca2+超载的的形态学资料超载的的形态学资料 电镜：大多内流的电镜：大多内流的CaCa2+2+都局限于都局限于mitomito基质内的致基质内的致密体内（细胞密体内（细胞CaCa2+2+超载的显示器）超载的显示器）,mitomito内内CaCa2+2+的大量内流是再灌注收缩早期的特征现象。的大量内流是再灌注收缩早期的特征现象。形态学变化：缺血形态学变化：缺血40 40 minmin时（时（肌纤维水肿、肌纤维水肿、mitomito肿胀肿胀,无无CaCa2+2+流入流入mitomito的迹象）；再灌注时的迹象）；再灌注时:心肌细胞超微结构的损伤（收缩带的形成、心肌心肌细胞超微结构的损伤（收缩带的形成、心肌纤维的断裂和肌纤维膜的破坏纤维的断裂和肌纤维膜的破坏,细胞急剧肿胀细胞急剧肿胀,并出现并出现mitomito内致密体）内致密体）用用CaCa2+2+荧光探针表明：心肌缺血荧光探针表明：心肌缺血90 90 秒（已发生秒（已发生细胞内细胞内CaCa2+2+）；短暂缺血后再灌注早期（细胞）；短暂缺血后再灌注早期（细胞内内CaCa2+2+暂时暂时）；）；缺血缺血30 30 分钟后复灌（渐进的分钟后复灌（渐进的稳定的稳定的CaCa2+2+）。）。34（二）二）Ca2+超载的机制超载的机制 1、N a+-Ca2+交换异常交换异常 2、内源性儿茶酚胺释放增多、内源性儿茶酚胺释放增多 3、生物膜损伤、生物膜损伤 351.N a+-Ca2+交换异常交换异常 在心肌缺血和再灌注时，在心肌缺血和再灌注时，NaNa+-Ca-Ca2+2+交换蛋白以反交换蛋白以反向转运增强，成为向转运增强，成为CaCa2+2+进入细胞的主要途径。进入细胞的主要途径。胞外胞外胞内胞内Ca2+3Na+36（1）细胞内高细胞内高Na+对对Na+-Ca2+交换蛋白的交换蛋白的直接激活直接激活 缺血：缺氧缺血：缺氧 ATP Na+-ATPase失灵失灵 细细胞内胞内Na+浓度升高浓度升高 再灌注：氧，再灌注：氧，ATP 激活激活Na+-Ca2+交换蛋白交换蛋白 细胞内高钠细胞内高钠 Na+-Ca2+交换蛋白以反向转运的方式加速交换蛋白以反向转运的方式加速Na+向细胞外转运，同时将大量向细胞外转运，同时将大量Ca2+运入胞浆。运入胞浆。37（2）细胞内高）细胞内高H+对对Na+-Ca2+交换蛋白的交换蛋白的间接激活间接激活 Na+-H+交换蛋白交换蛋白细胞膜细胞膜Na+-H+交换蛋白是离子逆向转运蛋白交换蛋白是离子逆向转运蛋白 Na+-H+交换蛋白主要感受细胞内交换蛋白主要感受细胞内H+浓度的变化，浓度的变化，利用利用H+电电-化学梯度作为动力来源，以化学梯度作为动力来源，以1：1的的比例将细胞内比例将细胞内H+排出细胞，而将排出细胞，而将Na+摄入细胞，摄入细胞，这是维持细胞内这是维持细胞内pH稳定的重要机制。稳定的重要机制。Na+H+胞外胞外胞内胞内38缺血缺血 无氧代谢无氧代谢 细胞内、外细胞内、外H+浓度浓度 再灌注再灌注 胞外胞外H+，胞内，胞内H+仍高仍高跨膜跨膜H+浓度梯度形成浓度梯度形成激活激活Na+-H+交换蛋白交换蛋白促进细促进细胞内胞内H+排出，而细胞外排出，而细胞外Na+内流内流；如果内流的不能被如果内流的不能被Na+-ATPase充分排出，细胞充分排出，细胞内高钠就可继发性激活内高钠就可继发性激活Na+-Ca2+交换蛋白，促进交换蛋白，促进Ca2+内流，加重细胞内内流，加重细胞内Ca2+超载。超载。动物实验中应用动物实验中应用Na+-H+交换抑制剂可减轻心肌交换抑制剂可减轻心肌缺血再灌注损伤，但在近年临床患者的实验中，缺血再灌注损伤，但在近年临床患者的实验中，Na+-H+交换抑制剂并未对高危患者显示出明显交换抑制剂并未对高危患者显示出明显的保护作用，提示还有其他机制介导再灌注性的保护作用，提示还有其他机制介导再灌注性心肌损伤。心肌损伤。392.内源性儿茶酚胺释放增多内源性儿茶酚胺释放增多 生理条件下，心功能主要受生理条件下，心功能主要受肾上素能受体调肾上素能受体调节，节，1肾上素能受体的调节作用很小。但缺血肾上素能受体的调节作用很小。但缺血-再灌注损伤时，内源性儿茶酚胺释放增多，再灌注损伤时，内源性儿茶酚胺释放增多，1肾上素能受体的调节也相对起重要作用。肾上素能受体的调节也相对起重要作用。401)1肾上素能受体肾上素能受体1肾上素能受体激活肾上素能受体激活G蛋蛋白白-磷脂酶磷脂酶C（PLC）介导的细胞信号转导介导的细胞信号转导通路，促进磷脂酰酯通路，促进磷脂酰酯醇（醇（PI）分解，生成分解，生成三磷酸肌醇（三磷酸肌醇（IP3）和和甘油二酯（甘油二酯（DG）。）。IP3与肌浆网上的与肌浆网上的IP3受受体结合促进钙池内钙体结合促进钙池内钙释放；释放；DG进一步激活进一步激活PKC，而而PKC可促进可促进Na+-H+交换，进而增加交换，进而增加Na+-Ca2+交换，使胞浆交换，使胞浆Ca2+浓度升高浓度升高412)肾上素能受体兴奋肾上素能受体兴奋 肾上素能受体兴奋可通过增加肾上素能受体兴奋可通过增加L型型Ca2+通道的通道的开放促进开放促进Ca2+内流内流:1 1受体激动剂受体激动剂心肌细胞后，通过心肌细胞后，通过G G蛋白偶联蛋白偶联激活激活ACcAMPACcAMP，激活激活PKA PKA 磷酸化磷酸化L型型钙通钙通道，使其对道，使其对CaCa2+2+通透性增高，胞外通透性增高，胞外CaCa2+2+内流内流42 在缺血前或再灌注前应用在缺血前或再灌注前应用Ca2+通道通道阻阻滞剂滞剂阻断阻断Ca2+内流，可见细胞坏死程度减内流，可见细胞坏死程度减轻，提示轻，提示Ca2+通道是细胞外通道是细胞外Ca2+进入胞浆进入胞浆造成造成Ca2+超载的途径之一。但在再灌注后超载的途径之一。但在再灌注后应用应用Ca2+通道通道阻滞剂阻滞剂往往不能有效的防止往往不能有效的防止细胞内细胞内Ca2+浓度升高。浓度升高。433.生物膜损伤 细胞膜和细胞内膜性结构是维持细细胞膜和细胞内膜性结构是维持细胞内、外以及细胞内各间区离子平衡的胞内、外以及细胞内各间区离子平衡的重要结构。生物膜损伤可使其通透性增重要结构。生物膜损伤可使其通透性增加，细胞外加，细胞外Ca2+顺浓度差进入细胞，或顺浓度差进入细胞，或使细胞内使细胞内Ca2+分布异常，加重细胞功能分布异常，加重细胞功能紊乱与结构破坏。紊乱与结构破坏。44Cellular membraneCellular membrane PLA2lipid break upCa2+normal无无Ca2+再灌注再灌注glycocalyxglycocalyx(1)Ca2+反常反常45(2)自由基损伤膜，膜结构破坏自由基损伤膜，膜结构破坏(3)肌浆网膜损伤：肌浆网膜损伤：CaCa2+2+-ATPATP酶酶功能抑制，使肌功能抑制，使肌浆网摄浆网摄Ca2+减少减少(4)线粒体膜损伤：抑制氧化磷酸化，使线粒体膜损伤：抑制氧化磷酸化，使ATP生生成减少，细胞膜和肌浆网膜成减少，细胞膜和肌浆网膜CaCa2+2+-ATPATP酶酶能量供能量供应不足，促进应不足，促进Ca2+超载的发生；超载的发生；细胞膜细胞膜NaNa+-ATPATP酶酶能量供应不足，能量供应不足，细胞内细胞内NaNa+含量明显增高，含量明显增高，激活激活NaNa+-Ca-Ca2+2+交换蛋白，交换蛋白，CaCa2+2+内流增多。内流增多。46（三）钙超载引起再灌注损伤的机制（三）钙超载引起再灌注损伤的机制 1 1.激活多种酶：激活多种酶：CaCa2+2+i i 磷脂酶磷脂酶 细胞膜及细胞器膜的损伤细胞膜及细胞器膜的损伤 花生四烯酸（花生四烯酸（arachidonic acid,AA)环氧合酶：环氧合酶：PGI2，PGD2，PGE2，TXA2 脂氧合酶：白三烯（脂氧合酶：白三烯（LT）：）：LTB4、LTC4 LT：趋化性趋化性（WBC），激活激活M 细胞色素细胞色素P-450加单氧酶：加单氧酶：抑制钠泵的代谢产物抑制钠泵的代谢产物 CaCa2+2+i i 蛋白酶蛋白酶 细胞膜和结构蛋白的分解细胞膜和结构蛋白的分解AA47 CaCa2+2+iiATPaseATPase ATP ATP 的消耗的消耗 CaCa2+2+ii核酶（核酶（ribozymeribozyme）染色体的损伤染色体的损伤 2.2.促进氧自由基生成：促进氧自由基生成：次黄嘌呤次黄嘌呤 CaCa2+2+i XO i XO 黄嘌呤黄嘌呤 自由基自由基 尿酸尿酸3 3.再灌注性心律失常再灌注性心律失常 CaCa2+2+i Nai Na+-Ca-Ca2+2+交换交换 一过性内向电一过性内向电流流 在在APAP后形成延迟后除极后形成延迟后除极 心律失常心律失常484 4.肌原纤维过度收缩（收缩带）肌原纤维过度收缩（收缩带）CaCa2+2+i i 肌原纤维过度收缩（收缩带）肌原纤维过度收缩（收缩带）肌肌纤维断裂纤维断裂 Mechanism:Mechanism:缺血期堆积的缺血期堆积的H H+迅速移走，抑制作用迅速移走，抑制作用 再灌注，重新获得再灌注，重新获得ATP+ATP+CaCa2+2+ii 肌原纤维过度收缩肌原纤维过度收缩/甚至是不可逆性缩短甚至是不可逆性缩短 损伤细胞骨架结构损伤细胞骨架结构心肌纤维断裂心肌纤维断裂 49实验证据：实验证据：单个心肌细胞内注射单个心肌细胞内注射CaCa2+2+细胞的过度收缩细胞的过度收缩结扎猪冠状动脉前降支结扎猪冠状动脉前降支4545minmin，恢复血流，经恢复血流，经冠脉给与直接抑制肌原纤维收缩的药物冠脉给与直接抑制肌原纤维收缩的药物BDM BDM 再灌注后心肌梗死的面积比对照组减少再灌注后心肌梗死的面积比对照组减少50%50%5 5.线粒体功能障碍线粒体功能障碍 ATPATP生成不足；启动细胞的死亡生成不足；启动细胞的死亡是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤着缺血再灌注损伤50三、三、线粒体与钙线粒体与钙线粒体被认为是细胞内最大的钙池之一，生理线粒体被认为是细胞内最大的钙池之一，生理状态下，可以有效地缓冲细胞内状态下，可以有效地缓冲细胞内CaCa2+2+浓度变化。浓度变化。心肌缺血后，其损伤的发生、发展与线粒体内心肌缺血后，其损伤的发生、发展与线粒体内CaCa2+2+稳态失调关系密切。稳态失调关系密切。目前研究证实，在多数条件下，线粒体内目前研究证实，在多数条件下，线粒体内CaCa2+2+的过度聚集使的过度聚集使膜通透性转运孔膜通透性转运孔（mitochondrial mitochondrial permeability transition pore,MPTPpermeability transition pore,MPTP）开放，开放，引起线粒体功能障碍和与启动细胞死亡事件相引起线粒体功能障碍和与启动细胞死亡事件相关蛋白的释放，启动细胞死亡。关蛋白的释放，启动细胞死亡。51线粒体的结构：由内外两层膜封闭，包括外膜、线粒体的结构：由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。在肝细胞内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基质质67%，内膜，内膜21%，外膜，外膜8%，膜间隙，膜间隙4%。线粒体结构模型线粒体结构模型52（一）线粒体内（一）线粒体内CaCa2+2+的转运的转运 1.线粒体内线粒体内CaCa2+2+与钙微区与钙微区 钙微区（钙微区（calcium microdomain）是指当单个钙是指当单个钙释放通道或小群通道开放时，形成通道口附近释放通道或小群通道开放时，形成通道口附近的局部的局部CaCa2+2+浓度升高。浓度升高。少量激活内质网上的少量激活内质网上的IP3型钙释放通道型钙释放通道胞浆胞浆内钙微区内钙微区周围的线粒体可感受到钙微区周围的线粒体可感受到钙微区线线粒体内粒体内CaCa2+2+浓度快速上升。浓度快速上升。mito-mito-内质网内质网 8080nmnm线粒体内线粒体内CaCa2+2+聚积影响内质网对聚积影响内质网对CaCa2+2+的摄取与的摄取与释放，两者之间可进行释放，两者之间可进行CaCa2+2+循环。而且，线粒循环。而且，线粒体对内质网体对内质网CaCa2+2+释放有调节作用。释放有调节作用。532.线粒体内钙离子的转运方式及调节线粒体内钙离子的转运方式及调节 产电的顺向产电的顺向转运转运UniporterUniporter.两种交换：两种交换：3 NaNa+/CaCa2+2+逆逆向转运向转运，2H H+/CaCa2+2+逆向逆向转运转运.54(1)the mitochondrial Ca2+uniporter,MCUis on the inner membrane,the Pathway of mito taking up Ca2+.Act like a channel,opening with increased probability once the local Ca2+c rises.Low-affinity:its activity would be extremely low at rest.Taking up Ca2+at the expenses of m(-150200 mV).可被钌红可被钌红(ruthinium red)和和La3+特异性抑制特异性抑制.55MCU starts to be activated at 25M of local Ca2+c.At the average,Ca2+c is near 10M during activation，but higher Ca2+concentrations(10100M)can be reached at local cells spots,at high Ca2+microdomains.The activity of the MCU is very small or absent at cytosolic Ca2+below 0.5M,whereas its activity increases dramatically along the micromolar range,reaching saturation above 100M.Global Ca2+c increasing able to activate MCU can also be reached during Ca2+overload under pathological circumstances and do usually drive to mitochondria-triggered cell death.MCU56（2)Pathway of calcium effluxing from mitochondria Mito 3Na+/Ca2+exchanger,is predominant in heart and brain mitochondria and is electrogenic Ca2+/2H+exchanger：is nonelectrogenic and is present in liver and kidney mitochondria MPTP a regulated pore,which has two different open states and can open transiently.During physiological Ca2+signals,an increase in Ca2+m is followed by a transient release of Ca2+m 57Activation of MCU occurs when the Ca2+c in the neighbourhood of the mitochondrial membrane increases to the micromolar range.Under these conditions,the rate of Ca2+entry through the uniporter exceeds that of Ca2+extrusion through the exchanger,leading to a fast increase in Ca2+m.Summarize58 是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤载伴随着缺血再灌注损伤（二）线粒体钙超载与细胞损伤（二）线粒体钙超载与细胞损伤59601.1.线粒体钙超载使线粒体钙超载使ATP合成障碍合成障碍生理状态下，生理状态下，Ca2+m 调节调节mito产能产能细胞受到生理剌激时细胞受到生理剌激时,CaCa2+2+由钙库释放由钙库释放线粒体线粒体产生短暂而局部的产生短暂而局部的CaCa2+2+上升上升线粒体脱氢酶活线粒体脱氢酶活性增加。性增加。细胞缺血细胞缺血 Ca2+m增加，线粒体脱氢酶活性增加，线粒体脱氢酶活性增加，产生更多的增加，产生更多的ATP以满足细胞需要。以满足细胞需要。Ca2+m过度持续增加过度持续增加,可引起线粒体膜通透性可引起线粒体膜通透性转运孔转运孔(MPTP)不可逆过度开放，不可逆过度开放，小于小于1 500道道尔顿的分子或离子可以通过线粒体内膜，尔顿的分子或离子可以通过线粒体内膜，H+由此进入线粒体基质由此进入线粒体基质引起引起ATP合成障碍。合成障碍。61 化学渗透学说：化学渗透学说：认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+H+的跨膜梯度的跨膜梯度.这一学说得到公认并获得了这一学说得到公认并获得了19781978年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。(呼呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜逆浓度梯度泵出线粒体内膜;H+;H+不能自由透过线粒体内膜不能自由透过线粒体内膜在在线粒体内膜两侧形成质子跨膜梯度线粒体内膜两侧形成质子跨膜梯度pHpH及跨膜电位及跨膜电位线粒体线粒体外的外的H+H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+H+浓度梯度进入线浓度梯度进入线粒体基质中，粒体基质中，H+H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATPATP的合的合成成)622.2.线粒体钙超载导致线粒体钙超载导致MPTP不可逆过度开放不可逆过度开放MPTP是由电位依赖性离子通道，是孔蛋白、腺苷是由电位依赖性离子通道，是孔蛋白、腺苷酸移位酶及亲环素酸移位酶及亲环素D复合物在内外膜交接处构成的复合物在内外膜交接处构成的一种复合结构。一种复合结构。MPTP在生理状态下呈间断性开放，且具有可逆性，在生理状态下呈间断性开放，且具有可逆性，能造成能造成m的降低，线粒体内的降低，线粒体内Ca2+减少和内部产减少和内部产生自由基减少，使细胞维持正常的生理功能。若生自由基减少，使细胞维持正常的生理功能。若MPTP不可逆过度开放可导致不可逆过度开放可导致m崩溃，呼吸链崩溃，呼吸链解偶联，解偶联，ATP合成停止，线粒体基质外流，还原合成停止，线粒体基质外流，还原性谷胱甘肽耗竭，超氧阴离子大量产生，最终导性谷胱甘肽耗竭，超氧阴离子大量产生，最终导致基质渗透压增高，线粒体内腔肿胀。致基质渗透压增高，线粒体内腔肿胀。63 线粒体钙超载产生缺血再灌注损伤的重要机制线粒体钙超载产生缺血再灌注损伤的重要机制之一就是线粒体基质之一就是线粒体基质CaCa2+2+浓度持续升高致使线浓度持续升高致使线粒体内膜粒体内膜MPTP不可逆过度开放不可逆过度开放 64 1）MPTP开放引起细胞色素开放引起细胞色素C释放释放细胞细胞死亡：死亡：在细胞色素在细胞色素C含量丰富的细胞，通过快速凋亡含量丰富的细胞，通过快速凋亡机制包括由机制包括由ApaF1(凋亡促进因子凋亡促进因子-l)介导的凋亡介导的凋亡过程。释放的细胞色素过程。释放的细胞色素C参与激活凋亡的酶通参与激活凋亡的酶通路，未释放的细胞色素路，未释放的细胞色素C用于维持电子传递和用于维持电子传递和氧呼吸，为凋亡进程提供氧呼吸，为凋亡进程提供ATP。由于线粒体由于线粒体MPTP开放，细胞色素开放，细胞色素C大量释放，大量释放，ATP产生骤减，无法维持供能，细胞走向坏死。产生骤减，无法维持供能，细胞走向坏死。65Fig.2.Temporal and spatial organization of mitochondrial depolarization and cyto c release induced by C2-ceramide+Ca2t and tBid.Fluorescence imaging of DWm was carried out simultaneously with cyto c distribution in cyto c-GFP-expressing and TMRE-loaded HepG2 cells.Sequentialfluorescence images are shown as green(Fcyto c-GFP),red(FTMRE)overlays.Depolarization appears as a loss of the red fluorescence,whereas cyto c release appears as a loss of the green fluorescence.Cyto c-GFP was expressed only in three cells that are shown in the upper right quadrant.Permeabilized cells were pretreated with C2-ceramide(40 lM for 5 min)before addition of Ca2t(50 lM CaCl2)and,subsequently,tBid(25 nM).In the absence of C2-ceramide,a relatively small Ca2t-induced depolarization and no cyto c-GFP release were observed(not shown).The Ca2t-induced mitochondrial depolarization initiated in discrete subcellular regions and propagated as waves through cells(direction of the wave is marked by the white arrow in the upper left image).Time courses of the fluorescence changes are plotted in the graph.66672）MPTP-dependent intermitochondrial calcium signaling Ca2+m the opening of the MPTP release of the accumulated Ca2+subsequently taken up by adjacent mitochondriaThis mechanism may result in a regenerative response that spreads throughout the entire mitochondrial population of the cell.Notably,MPTP-dependent intermitochondrial calcium signaling has been reported to recruit mitochondria to the apoptotic process.683.线粒体钙与活性氧线粒体钙与活性氧活性氧分子活性氧分子ROS:包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基。基。线粒体是细胞产生线粒体是细胞产生ROS的主要场所：的主要场所：complex，Superoxide；Mn-SOD H2O2 or Superoxide+NO ONOO-ROS的产生与线粒体内的产生与线粒体内CaCa2+2+的聚积有关的聚积有关:mito Ca2+MPTP开放开放mthem-dependent complex III-mediated ROS formation.mito Ca2+mNOSNO ONOO-ROS 细胞损伤：细胞损伤：脂质过氧化脂质过氧化细胞膜的通透性细胞膜的通透性 细胞内细胞内Ca2+超载。超载。由此可见，线粒体内由此可见，线粒体内Ca2+超载导致超载导致ROS产生，产生，ROS又又促使细胞内促使细胞内Ca2+超载的发生。超载的发生。6970References:1.Cell Calcium,34(2003)399405:Ca2+signalling in mitochondria:mechanism and role in physiology and pathology.2.Cell Calcium,40(2006)513525:Calcium microdomains in mitochondria and nucleus3.Journal of Physiology(2000),529.1,pp.5768:Mitochondria and calcium:from cell signalling to cell death71细胞内钙稳态与钙超载细胞内钙稳态与钙超载基本要求：基本要求：1.熟悉细胞内钙超载的发生与引起心肌缺血再灌熟悉细胞内钙超载的发生与引起心肌缺血再灌注损伤的机制。注损伤的机制。2.掌握线粒体内钙超载引起心肌缺血再灌注损伤掌握线粒体内钙超载引起心肌缺血再灌注损伤的机制。的机制。3.了解细胞内钙稳态调节机制。了解细胞内钙稳态调节机制。72氧化磷酸化的偶联机制氧化磷酸化的偶联机制-目前多数人支持化学渗透学说目前多数人支持化学渗透学说(chemiosmotic hypothesis)(chemiosmotic hypothesis)，其基本观点是：，其基本观点是：1.1.线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放H+H+是偶联的，即呼是偶联的，即呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的内的H+H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜，这一过程的分子机理还逆浓度梯度泵出线粒体内膜，这一过程的分子机理还不十分清楚。不十分清楚。2.H+2.H+不能自由透过线粒体内膜，在线粒体内膜两侧形成一个不能自由透过线粒体内膜，在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度质子跨膜梯度pHpH，内膜外侧，内膜外侧+，内膜内侧，内膜内侧-，这就是跨膜电，这就是跨膜电位位。底物氧化过程中释放的自由能就储存于。底物氧化过程中释放的自由能就储存于和和pHpH中，若以中，若以P P表示总的质子移动力，那么表示总的质子移动力，那么P=P=-59-59pHpH 3.3.线粒体外的线粒体外的H+H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+H+浓浓度梯度进入线粒体基质中，这相当于一个特异的质子通道，度梯度进入线粒体基质中，这相当于一个特异的质子通道，H+H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATPATP的合成，寡霉的合成，寡霉素能与素能与OSCPOSCP结合，特异阻断这个结合，特异阻断这个H+H+通道，从而抑制通道，从而抑制ATPATP合成。合成。有关有关ATPATP合成的分子机制目前还不十分清楚。合成的分子机制目前还不十分清楚。4.4.解偶联剂的作用是促进解偶联剂的作用是促进H+H+被动扩散通过线粒体内膜，即增被动扩散通过线粒体内膜，即增强线粒体内膜对强线粒体内膜对H+H+的通透性，解偶联剂能消除线粒体内膜两的通透性，解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度，所以不能再合成侧的质子梯度，所以不能再合成ATPATP。总之，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的总之，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是因素是H+H+的跨膜梯度。的跨膜梯度。73活化的caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素c释放，使凋亡信号放大。