紫外可见分光光度法简介ppt课件

紫外紫外可见分光光度法简介可见分光光度法简介紫外紫外可见分光光度法的特点可见分光光度法的特点物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收影响紫外影响紫外可见吸收光谱的因可见吸收光谱的因素素朗伯朗伯比尔定律比尔定律紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计紫外紫外可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用紫外可见分光光度法 在仪器分析中紫外在仪器分析中紫外可见分光光度法是历史悠久、应可见分光光度法是历史悠久、应用最为广泛的一种光学分析方法。他是利用用最为广泛的一种光学分析方法。他是利用物质的分子或物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸析、定量分析及结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按所吸收光收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外合称为紫外可见分光光度法。可见分光光度法。分光光度法是在分光光度法是在比色法比色法的基础上发展起来的，两者所的基础上发展起来的，两者所依据的原理基本上是相同的。由于分光光度法采用了更为依据的原理基本上是相同的。由于分光光度法采用了更为先进的单色系统和光检测系统，使得分光光度法在灵敏度、先进的单色系统和光检测系统，使得分光光度法在灵敏度、准确度、精密度及应用范围上都大大的优于比色法。准确度、精密度及应用范围上都大大的优于比色法。紫外紫外可见分光光度法有如下特点：可见分光光度法有如下特点：相对其他光谱分析方法来说相对其他光谱分析方法来说 相对其他光谱分析方法来说，其相对其他光谱分析方法来说，其仪器设备和操作都比较简单，仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度较快费用少，分析速度较快。灵敏度较高。如在紫外区直接检测抗坏血酸时，其最低检出灵敏度较高。如在紫外区直接检测抗坏血酸时，其最低检出浓度可达到浓度可达到10-6g/mL。有较好的选择性有较好的选择性。通过适当的选择测量条件，一般可在多种。通过适当的选择测量条件，一般可在多种组分共存的体系中，对某一物质进行测定。组分共存的体系中，对某一物质进行测定。精密度和准确度较高。在仪器设备和其他测量条件较好的情精密度和准确度较高。在仪器设备和其他测量条件较好的情况下，其相对误差可减小到况下，其相对误差可减小到1%2%。虽然相对误差比重量。虽然相对误差比重量法和滴定法大，但对于微量组分的测定已经满足要求。法和滴定法大，但对于微量组分的测定已经满足要求。用途广泛用途广泛。在医药、化工、冶金、环境保护、地质等诸多领。在医药、化工、冶金、环境保护、地质等诸多领域，紫外域，紫外可见分光光度法不但可以进行定量分析，还可以可见分光光度法不但可以进行定量分析，还可以对被测物质进行定性分析和结构分析，进行官能团鉴定、相对被测物质进行定性分析和结构分析，进行官能团鉴定、相对分子质量测定、配合物的组分及稳定常数的测定等等。对分子质量测定、配合物的组分及稳定常数的测定等等。物质对光的选择性吸收：物质对光的选择性吸收：光在与物质作用时，物质可对光产生不同程度的吸收。光光在与物质作用时，物质可对光产生不同程度的吸收。光被吸收后，起能量通常以热的形式释放出来，这种能量很微小，被吸收后，起能量通常以热的形式释放出来，这种能量很微小，一般察觉不到。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收一般察觉不到。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了解物质的特性。来了解物质的特性。物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长的光，也就是说，物质对光的吸收有选择性。的光，也就是说，物质对光的吸收有选择性。例如，当一束白光（复合光）通过硫酸铜溶液时，水合铜例如，当一束白光（复合光）通过硫酸铜溶液时，水合铜离子中的电子发生跃迁，选择性的吸收复合光中的黄光，其他离子中的电子发生跃迁，选择性的吸收复合光中的黄光，其他颜色的光不被吸收而透过溶液，故溶液呈现出黄色的互补色颜色的光不被吸收而透过溶液，故溶液呈现出黄色的互补色蓝色。我们通常见到的有色物质，都是由于他们吸收了可见蓝色。我们通常见到的有色物质，都是由于他们吸收了可见光的部分光，呈现出吸收光颜色的互补色。光的部分光，呈现出吸收光颜色的互补色。分子中的电子跃迁需要的能量在分子中的电子跃迁需要的能量在 之之间，其对应的吸收光的波长范围大部分处于紫外和可见光区域，间，其对应的吸收光的波长范围大部分处于紫外和可见光区域，通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱。不同的分子通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱。不同的分子中的电子跃迁需要的能量不一样，吸收光谱也就不同。为了测中的电子跃迁需要的能量不一样，吸收光谱也就不同。为了测19181.6 103.2 10J 量一种物质的吸收光谱，用经过分光后的不量一种物质的吸收光谱，用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，这种物质可以同波长的光依次透过该物质，这种物质可以是液体，也可以是固体或气体，但大多数情是液体，也可以是固体或气体，但大多数情况都是具有一定浓度的溶液。通过测量物质况都是具有一定浓度的溶液。通过测量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就可波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长范围内的吸收曲线。以得到该物质在测量波长范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光度吸收这种曲线体现了物质对不同波长的光度吸收能力，称为能力，称为吸收光谱吸收光谱。在分子发生电子能级跃迁的同时，总是伴随着振在分子发生电子能级跃迁的同时，总是伴随着振动能级和转动能级的跃迁。所以，在分子的电动能级和转动能级的跃迁。所以，在分子的电子光谱中，包含有不同振动能级跃迁产生的若子光谱中，包含有不同振动能级跃迁产生的若干吸收谱带和转动能级跃迁产生的若干吸收谱干吸收谱带和转动能级跃迁产生的若干吸收谱线。一般情况下由于线。一般情况下由于 ,分辨分辨不出电子光谱中振动能级和转动能级跃迁所产不出电子光谱中振动能级和转动能级跃迁所产生的谱线结构，观察到的只是这些谱线展宽后生的谱线结构，观察到的只是这些谱线展宽后合并在一起形成的较宽的吸收带。所以通常又合并在一起形成的较宽的吸收带。所以通常又将分子的电子光谱称为带状光谱。将分子的电子光谱称为带状光谱。eVrEEE 有机化合物的紫外有机化合物的紫外可见吸收光谱可见吸收光谱1 有机化合物的电子跃迁有机化合物的电子跃迁 有机化合物的紫外吸收光谱，取决于分子中外层电子有机化合物的紫外吸收光谱，取决于分子中外层电子的性质。与紫外的性质。与紫外可见吸收光谱有关的电子有三种，可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的即形成单键的电子、形成双键的电子、形成双键的电子以及未参与成电子以及未参与成键的键的n电子（孤对电子）。处于基态的分子在吸收一定电子（孤对电子）。处于基态的分子在吸收一定波长的光后，分子中的成键电子和非键电子可被激发波长的光后，分子中的成键电子和非键电子可被激发跃迁至跃迁至*和和*反键轨道，其跃迁类型有反键轨道，其跃迁类型有*、n*、*和和n*四种，其相对能量大小次序为：四种，其相对能量大小次序为：*n*n*有机物最有用的吸收光谱是基于有机物最有用的吸收光谱是基于n*和和*跃迁而跃迁而产生的，这两类跃迁所需要的辐射能量大多处于波长产生的，这两类跃迁所需要的辐射能量大多处于波长大于大于200nm的区域。它们要求分子中含有不饱和键，的区域。它们要求分子中含有不饱和键，这种含有不饱和键的基团称为这种含有不饱和键的基团称为生色团生色团。n*跃迁发生在含有杂原子的不饱和化合物中，其最大摩跃迁发生在含有杂原子的不饱和化合物中，其最大摩尔吸光系数尔吸光系数max（表示物质对光吸收能力大小的参量）比较（表示物质对光吸收能力大小的参量）比较小，吸收峰随溶剂极性增加而向短波方向移动，即产生小，吸收峰随溶剂极性增加而向短波方向移动，即产生蓝蓝移移，下表列出了一些常见生色团，下表列出了一些常见生色团n*跃迁的吸收特性。跃迁的吸收特性。生色团生色团化合物化合物溶剂溶剂羰基羰基正己烷正己烷28016羧基羧基乙醇乙醇20441硝基硝基CH3NO2异辛烷异辛烷28022亚硝基亚硝基C4H9NO乙醚乙醚66520max/nmmaxH3CCCH3OH3CCOHO*跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，其最大摩尔吸光率很大，吸收峰随溶剂极性增加向长波中，其最大摩尔吸光率很大，吸收峰随溶剂极性增加向长波方向移动，即产生方向移动，即产生红移红移。下表列出了一些常见生色团。下表列出了一些常见生色团*跃迁的吸收特性。跃迁的吸收特性。生色团生色团 化合物化合物溶剂溶剂羰基羰基正己烷正己烷188900烯烯正庚烷正庚烷17713000炔炔正庚烷正庚烷17810000max/nmmaxH3CCCH3OC6H13CHCH2C5H11CCCH3当一个分子中含有两个或两个以上的生色团时，按相互间的位置当一个分子中含有两个或两个以上的生色团时，按相互间的位置可以分为可以分为共轭共轭和和非共轭非共轭两种情况：非共轭时，各个生色团各自独两种情况：非共轭时，各个生色团各自独立吸收，吸收带由各生色团的立吸收，吸收带由各生色团的吸收带叠加吸收带叠加而成；共轭时，生色团而成；共轭时，生色团原有的原有的吸收峰会发生改变吸收峰会发生改变，可产生新的吸收峰。下表列出了一些，可产生新的吸收峰。下表列出了一些有关共轭结构的化合物的吸收特性。有关共轭结构的化合物的吸收特性。化合物化合物共轭双键数共轭双键数11955000220010000221721000325425000325835000C H3C HC H2C O O HH(CHCH)3HH2CC HC HC H2CH2CHCO O HCH2CH2max/nmmax另有一些基团，本身并不产生吸收峰，但与生色团共存于同一分另有一些基团，本身并不产生吸收峰，但与生色团共存于同一分子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助助色团色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。化合物化合物取代基取代基苯苯254300氯苯氯苯264320溴苯溴苯262325苯酚苯酚2731780苯甲醚苯甲醚2722240max/nmmaxClBrOHOCH3有有机化合物的吸收带机化合物的吸收带吸收带吸收带(absorption band):在紫外光谱中，在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。型。(1)R吸收带吸收带(2)K吸收带吸收带(3)B吸收带吸收带(4)E吸收带吸收带镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。响。1.f电子跃迁吸收光谱电子跃迁吸收光谱过渡金属的电子跃迁类型为过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同电子在不同d轨轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。强烈受配位环境的影响。例如例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。2.d电子跃迁吸收光谱电子跃迁吸收光谱3.电荷迁移光谱电荷迁移光谱 某些分子既是电子给某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。苯酰基取代物在光作用下的异构反应。CROhvCRO-影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，等）不同，吸收光谱的吸收光谱的形状形状、吸收峰的位置吸收峰的位置、吸收强度吸收强度等都可能发生变化。等都可能发生变化。1.温度温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。响不大。2.溶剂溶剂 注意如下几点：注意如下几点：（1）同一种物质由于使用的溶剂不同，得）同一种物质由于使用的溶剂不同，得到的紫外到的紫外可见吸收光谱的峰形和最大吸收可见吸收光谱的峰形和最大吸收位置可能不一样，所以在测定物质的吸收光位置可能不一样，所以在测定物质的吸收光谱时，一定要注明所使用的溶剂谱时，一定要注明所使用的溶剂（2）尽量选用低极性溶剂；）尽量选用低极性溶剂；（3）能很好地溶解被测物，并且形成的溶）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；液具有良好的化学和光化学稳定性；（4）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。3.PH 设入射光强度为设入射光强度为I0，吸收光强度为，吸收光强度为Ia,透透射光强度为射光强度为 It，反射光强度为，反射光强度为Ir，则，则 I0=Ia+It+Ir由于反射光强度基本相同，其影响可相互由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：抵消，上式可简化为：I0=Ia+It一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度吸光度吸光度:为透光度倒数的对数，用为透光度倒数的对数，用A表示，表示，即即 A=lg1/T=lgI0/It透光度透光度：透光度为透过光的强度：透光度为透过光的强度It与入射与入射光强度光强度I0之比，用之比，用T表示：表示：即即 T=It/I0二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律朗伯朗伯-比尔定律比尔定律：当一束平行单色光通过含有当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比物质浓度、液层厚度乘积成正比，即，即 A=cl 式中比例常数式中比例常数与与吸光物质的本性吸光物质的本性，入射，入射光光波长波长及及温度温度等因素有关。等因素有关。c为吸光物质浓度，为吸光物质浓度，l为为透光液层厚度透光液层厚度。朗伯朗伯-比尔定律是紫外比尔定律是紫外-可见分光光度法的可见分光光度法的理论基础。理论基础。三、吸光系数三、吸光系数当当l以以cm，c以以g/L为单位，为单位，称为吸光称为吸光系数，用系数，用 a表示。表示。A=a cla的单位为的单位为L/(g.cm)当当l以以cm，c以以mol/L为单位，为单位，称为摩称为摩尔吸光系数，用尔吸光系数，用 表示。表示。的单位为的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度，它表示物质的浓度为为1mol/L，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶液的吸光时，溶液的吸光度。度。摩尔吸光系数摩尔吸光系数比吸光系数比吸光系数比吸光系数是指百分含量为比吸光系数是指百分含量为1%，l为为1cm时的吸光度值，用时的吸光度值，用 表示。表示。%11cmE%111.0cmrEM四、偏离朗伯四、偏离朗伯-比耳定律的因素比耳定律的因素（1）入射光为非单色光）入射光为非单色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。均造成光径不一致，从而与定律偏离。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的保护胶体，实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计一、主要部件的性能与作用一、主要部件的性能与作用基本结构基本结构:光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统 样品样品 在紫外可见分光光度计中，常用的光源在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源有两类：热辐射光源和气体放电光源 1 光源光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。氢灯和氘灯。单色器的主要组成：入射狭缝、出射单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。狭缝、色散元件和准直镜等部分。2 单色器单色器 单色器质量的优劣，主要决定于单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。和光栅。吸收池又称比色皿或比色杯，按材吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。者不能用于紫外区。3 吸收池吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以之间，其中以1cm光径吸收池光径吸收池最为常用。最为常用。4 检测器检测器 检测器的作用是检测光信号，并将检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。为检测器。5 信号显示系统信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。字显示装置等。紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用 紫外紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。结构分析。1.定性分析定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。难。2.纯度的鉴定纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。的。如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。的比值，鉴定其纯度。3.结构分析结构分析 紫外紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。该物质无共轭结构和芳香结构。参考文献：参考文献：实用仪器分析实用仪器分析 北京大学出版社北京大学出版社