环介导等温扩增技术简介ppt课件

在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术Principle of Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增法为已知基因的检测提供环介导等温扩增法为已知基因的检测提供“简便、快速、简便、快速、准确、廉价准确、廉价”的基因检测方法的基因检测方法在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确什么是环介导等温扩增？什么是环介导等温扩增？n 环介导等温扩增环介导等温扩增 环介导等温扩增是环介导等温扩增是“Loop-Mediated Isothermal Amplifi-cation”的简称，是一种的简称，是一种“简单、快速、准确、廉价简单、快速、准确、廉价”的基因扩的基因扩增方法。增方法。环介导等温扩增的特征是针对目标环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的链上的6个区段个区段设设计计4个不同的引物个不同的引物然后再利用链置换型然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度合成酶在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合合成酶、基质等共同置于成酶、基质等共同置于一定温度下（一定温度下（60-65），经一个步骤），经一个步骤即可完成即可完成。其。其扩增效率极高扩增效率极高，可在，可在1560min内实现内实现1091010倍的扩增。而且由于倍的扩增。而且由于有着高度的特异性有着高度的特异性，只需很据扩增产物的，只需很据扩增产物的有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增有哪些优点？环介导等温扩增有哪些优点？n 优点优点l 不需要使双链不需要使双链DNA先变性成单链，先变性成单链，省时省时。l 扩增反应在扩增反应在等温下可持续进行等温下可持续进行。l 扩增的扩增的效率极高效率极高。l 针对针对6个区段使用个区段使用4种引物，拥有种引物，拥有高度的特异性高度的特异性。l 不需要不需要PCR仪器仪器，仅仅使用一种链置换型，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，聚合酶，成本成本低廉低廉。l 扩增产物是在同一条扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不链上互补序列周而复始形成大小不一的片段，一的片段，检测方法简单检测方法简单。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增引物如何设计？环介导等温扩增引物如何设计？n 引物的设计引物的设计 首先在靶基因的首先在靶基因的3末端设定末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在三个区段，在5末端末端设定设定B1、B2、B3三个区段，针对这三个区段，针对这6个区段个区段可以可以设计设计4个引物个引物。3535F3cF2cF1cB1B2B3B1cB2cB3cF3F2F1Target DNAFIPF3 PrimerBIPB3 PrimerF1cF235F3535353B2B1cB3FIP:FIP引物在引物在3末端含有与末端含有与F2c互补的互补的F2区段，在区段，在5末端含有与末端含有与F1c相同序列的区段。相同序列的区段。F3 Primer:F3引物含有与目标引物含有与目标DNA上的上的F3序列相同的区段。序列相同的区段。BIP:BIP引物在引物在3末端含有与末端含有与B2c互补的互补的B2区段，在区段，在5末端含有与末端含有与B1c相同序列的区段相同序列的区段。B3 Primer:B3引物含有与目标引物含有与目标DNA上的上的B3序列相同的区段。序列相同的区段。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增引物如何设计？环介导等温扩增引物如何设计？n 引物设计要点引物设计要点 关于各引物的设计，需要专门的支持软件：关于各引物的设计，需要专门的支持软件：Primer Explorer。设计。设计中需特别注意碱基组成、中需特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。含量、二次结构等问题。l F2、B2、F3、B3的的3末端应极力末端应极力避免避免AT碱基连续或过多碱基连续或过多。l 扩增领域为扩增领域为F2B2区段间，区段间，引物应该在引物应该在200bp以内以内。l 包含包含F2/B2在内的环状部分的长度在在内的环状部分的长度在4060bp范围内。范围内。l 各区段的各区段的Tm值应该在值应该在6065之间之间。l 若只是为了鉴定靶基因存在与否，若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。的间距可以为零。l 引物应引物应避免二次结构避免二次结构发生。发生。l 各引物的各引物的3端不可含有与其他引物互补的序列。端不可含有与其他引物互补的序列。具体引物设计信息请参照网页：具体引物设计信息请参照网页：http:/primerexplorer.jp/e/在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）解离链解离链解离链解离链哑铃状模板构造形成的过程哑铃状模板构造形成的过程FIPBIPF3 PrimerB3 Primer环状结构环状结构环状结构环状结构环状结构环状结构在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确循环扩增阶段和延伸循环阶段循环扩增阶段和延伸循环阶段在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增反应的体系环介导等温扩增反应的体系n 环介导环介导等温等温扩增法所需的试剂扩增法所需的试剂l 模板模板DNADNA扩增扩增l 引物引物 FIP F3 BIP B3l 链置换型链置换型DNA聚合酶聚合酶l dNTPsl 反应缓冲液反应缓冲液l 模板模板DNARNA扩增扩增l 引物引物 FIP F3 BIP B3l 链置换型链置换型DNA聚合酶聚合酶l dNTPsl 反应缓冲液反应缓冲液l 逆转录酶逆转录酶PS：当模板是：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。一样进行扩增。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增反应的操作过程（标准法）环介导等温扩增反应的操作过程（标准法）n 环介导等温扩增法的操作步骤环介导等温扩增法的操作步骤样本样本DNA/RNA提取提取等温扩增等温扩增检测检测约约0.5h1、试剂配制、试剂配制2、DNA/RNA提取提取3、环介导等温扩增反应（扩增）、环介导等温扩增反应（扩增）4、检测、检测约约1.5h在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确环介导等温扩增反应的检测环介导等温扩增反应的检测n 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增实例扩增实例NTCPS：等温扩增的阳性产物是片段大小不一的梯状条带。：等温扩增的阳性产物是片段大小不一的梯状条带。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确n 应用浊度检测应用浊度检测环介导等温扩增反应的检测环介导等温扩增反应的检测阳性阳性阴性阴性 扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。dNTPsDNA PolymeraseDNA-(dNMP)n+nP2O7P2O74-+2Mg2+MgP2O7(白色沉淀白色沉淀)+在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确n 荧光目视试剂检测荧光目视试剂检测环介导等温扩增反应的检测环介导等温扩增反应的检测 钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出除，发出黄绿色黄绿色荧光。荧光。+钙黄绿素钙黄绿素Mn2+dNTPsMg2+DNA聚合酶聚合酶扩增反应扩增反应钙黄绿素钙黄绿素Mn2+P2O74-焦磷酸锰（白色沉淀）焦磷酸锰（白色沉淀）在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确n 应用浊度的实时检测应用浊度的实时检测环介导等温扩增反应的检测环介导等温扩增反应的检测 如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁）如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁）的浊度进行测定。的浊度进行测定。在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确LAMP与普通与普通PCR的比较的比较n 缺点缺点l 灵敏度高，灵敏度高，一旦开盖容易形成一旦开盖容易形成气溶胶污染气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程，故在进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。l 引物设计要求比较高引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。方法。