5目的基因转化及筛选

第五章(1)目的基因导入受体细胞第一节 受体细胞外源基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组分子必须导入适宜的细胞中方能使外源基因得以大量扩增或表达。在基因工程飞速发展的今天，原核细胞和真核细胞都可以作为基因工程的受体细胞，选择适宜的受体细胞也已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。受体细胞（receptor cell）又称宿主细胞（host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般来说，受体细胞的选择就符合以下基本条件：便于重组DNA分子的导入。能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。便于重组体的筛选。遗传稳定性高，便于扩大培养或发酵生产。对动物细胞而言，受体细胞应对培养条件有较强的适应性，可以在无血清培养基中进行贴壁或悬浮培养。安全性高，无致病性，不会对环境造成污染。具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。选用内湖内源性蛋白酶基因缺失的细胞或蛋白酶含量低的细胞。在实际应用中，可根据需要重点考虑其中的部分要求。基因工程中常用的受体细胞如下:一、原核生物细胞原核细胞是较为理想的受体细胞类型，这是因为：大部分的原核细胞没有纤维素组成的细胞壁，便于外源DNA分子的进入；没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体重组减少了麻烦；基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；原核生物多数为单核细胞生物，培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。因此，原核细胞广泛作为基因工程的受体细胞。但是，经原核生物细胞来表达真核生物基因也存在一定的缺陷，许多真核基因不能在原核细胞如大肠杆菌中表达出有生物活性的功能蛋白质。原因是：原核生物细胞不具备真核生物细胞的蛋白质折叠复性系统，表达出蛋白产物往往是无特异性空间结构的多肽链；原核细胞缺乏真核细胞的蛋白质加工修饰系统，不能进行多肽的糖基化、磷酸化等；原核细胞内的蛋白酶易降解空间构型不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定。这些缺陷制约了原核细胞作为生物反应器进行异源真核蛋白的大规模生产。 至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。1大肠杆菌作为受体菌大肠杆菌是基因工程中发展最为完善和成熟的载体受体系统。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，一些菌株的染色体DNA已经测序完毕，大部分基因的功能已被鉴定。目前已经实现商品化的多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的，如人胰岛素、生长素、干扰素等。但是，大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。2.枯草杆菌作为受体菌又称为枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性杆菌，作为基因工程受体菌的最大优点是除具有大肠杆菌的优点外，还具有：枯草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物高效分泌到培养基中，大大简化了表达产物的提取和架式处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白在分泌后便具有了天然构象和生物活性。不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。具有芽孢形成能力，易于保存和培养。现已成功地利用枯草杆菌表达了人的b-干扰素、白细胞介素、乙肝病毒核心抗原等。3蓝细菌作为受体菌蓝细菌，也称为蓝藻，作为基因工程受体细胞的最大优点是：蓝藻是一类光能自养微生物，培养简便，营养条件要求低，可用于大规模生产。由于密码子的偏向性和启动子的通用性，某些蓝藻可能成为植物基因表达的宿主。二、真菌细胞 真菌是低等真核生物。在基因工程中常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞等。酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物，分属于子囊菌纲（子囊菌酵母）、担子菌纲（担子菌酵母）和半知菌类（半知菌酵母），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因表达最成熟的原核生物系统，则酵母菌是外源基因最理想的真核生物表达系统。作为一个真核生物表达系统，酵母菌的优势是：（1）基因表达调控机理比较清楚，并且遗传操作相对较为简单；（2）具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；（3）不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿酒酵母等）在食品工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；（4）大规模发酵工艺简单，成本低廉；（5）能将外源基因表达产物分泌至培养基中；（6）酵母菌是最简单的真核生物，利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系。因此，酵母菌的基因工程具有极为重要的经济意义和学术价值。三、植物细胞广泛应用于微生物系统的重组DNA技术在高等植物尤其是农作物的品种改良方面也日益显示出其重大的经济意义。将相关的单一基因或小型基因蔟导入植物体内，可培育出具有抗病虫害、抗除草剂和抗环境压力等多种优良遗传品质的农作物。目前大量的农作物转基因品种已经问世，其中包括水稻、玉米、马铃薯、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、亚麻、甜菜、甘草、番茄、生菜、胡萝卜、卷心菜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果和葡萄等。不久的将来，人们在超市的货架上还可看到自然界不存在的全新转基因蔬菜和水果。高等植物转基因技术的建立迎来了又一次伟大的绿色革命。许多高等植物具有自我授精的遗传特性，通常能产生大量的后代，而且借助于如风、重力和昆虫等自然条件，授精范围广、速度快、效率高，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。植物在机械损伤后，会在伤口处长出一块称为愈伤组织的软组织。如果取下一小片鲜嫩的愈伤组织，放在含有合适营养成份和植物生长激素的培养基中，愈伤细胞便能持续生长和有效分裂。将这种无性繁殖的细胞悬浮液涂布在特殊的固体培养基上，新长出的幼芽则可重新分化成为根、茎、叶，最终再生出整株开花植物。愈伤组织的细胞分化取决于植物生长激素各组份的相对浓度，包括生长素（Auxins）和分裂素（Cytokinins）。较高的生长素与分裂素之比有利于根部发育；反之则茎部发育。植物细胞具有以纤维素为主要构成成份的细胞壁，因而通常不能直接吸收外源DNA。用纤维素酶处理植物细胞，制备原生质体，后者则可有效接纳重组DNA分子，而且经细胞壁再生后的植物细胞亦可经愈伤组织的形式形成整株植物。但这项技术也有一定的局限性，即大多数单子叶植物（如谷类农作物）的原生质体很难再生。上述特性为利用植物转基因技术生产具有重要经济价值的重组异源蛋白、改良植物尤其是农作物的品质提供了有利条件。然而，许多高等植物拥有比人类更大的基因组，且多以多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物基因组为多倍体，如马铃薯类植物的细胞染色体数目从24至144不等。这种多倍体植物在组织培养中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异，因此由多倍体单细胞再生的植物通常不具有遗传杂合性。四、动物细胞 早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚胎细胞为基因转移的受体细胞，由此培育出一定数量的转基因动物。近年来通过体细胞培养，获得了多种克隆动物。目前用作转基因的受体动物有猪、牛、羊、魚等经济动物和鼠、猴等实验动物。常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等。以动物细胞，尤其是以哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：能识别和除去外源真核基因中的内含子,剪接加工成成熟的mRNA。真核基因的表达产物蛋白在翻译后能被正确加工和修饰，产物具有较好的免疫原性，约为酵母细胞的16-20倍。易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。可将产物分泌到培养基中，便于提取和加工，成七低。缺点是动物细胞培养技术要求高，成功地筛选转化子细胞周期长。第二节 DNA的体外重组（切与接） 分子克隆的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或DNA重组分子）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时打开载体DNA分子，然后将两者连接成杂合分子。有时在外源DNA片段与载体分子拼接前，还需要对连接位点作特殊的技术处理，以提高连接效率。所有这些操作均由一系列功能各异的工具酶来完成，其中一些常用的工具酶本身也已使用基因工程方法产生，如部分的限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶以及Klenow DNA聚合酶等。一、限制性核酸内切酶的切割反应 绝大多数II类限制性核酸内切酶对基本缓冲系统的组成要求相同，包括10-50mM（最终浓度，下同）的Tris-HCl（pH 7.5）、10mM的MgCl2、1mM的DTT（二巯基苏糖醇，用于稳定酶的空间结构），唯一的区别是各种酶对盐（NaCl）浓度的需求不同。据此，可将所有的II类酶分为三大组，即低盐组（0-50mM NaCl）、中盐组（50-100mM NaCl）和高盐组（100-150mM NaCl）。盐浓度过高或过低均大幅度影响酶的活性，最多可降低活性十倍。在对同一种DNA分子进行双酶切时，如果两种酶对盐浓度要求相同，原则上可以将这两种酶同时加入反应体系中进行同步酶切；对于盐浓度要求差别不大的两种酶，比如一种酶属于中盐组，另一种酶属于高盐组，一般也可以同时进行反应，只是选择对价格较贵的酶有利的盐浓度，而另一种酶可通过加大用酶量的方法来弥补因用盐浓度不合适所造成的活性损失；对盐浓度要求差别较大的（如一个高盐，另一个低盐），一般不宜同时进行酶切反应。理想的操作方法是：（1）低盐组的酶先切，然后加热灭活该酶，向反应系统中补加NaCl至合适的最终浓度，再用高盐组的酶进行切割反应；（2）一种酶反应结束后，加入0.1倍体积的5M KAc溶液（pH 5.5）和两倍体积的冰冻乙醇，20放置15分钟，于4高速离心15分钟，干燥，重新加入另一种酶的缓冲液，再进行第二种酶切反应。在某些情况下，两种酶不能同时进行酶切反应，必须先后进行，而且先后次序对酶切效果也相当关键。这种情况多发生在两种酶的识别序列互相重叠的DNA底物上，如pUC18多克隆位点中的KpnI与SmaI识别序列共用两个GC碱基对，若选用SmaI酶切开pUC18分子，则这个线型DNA分子仍能被KpnI酶解；但若先用KpnI切开pUC18分子，得到的DNA线型分子中的SmaI识别序列已遭破坏，因而SmaI不能进一步切割这种底物。当两种酶同时切割时（两种酶同属低盐组），由于作用次序的随机性，导致有些产物分子含有两种酶的酶解末端，而另一些产物分子只有KpnI酶的酶解末端。 II类限制性核酸内切酶虽然具有特异性的识别序列及切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称为限制性核酸内切酶的星号活性（Star Activity）。如EcoRI在正常条件下识别5GAATTC3序列，但在底盐（50mM）、高pH（8）和甘油大量存在的情况下，其识别序列除原来的序列以外，还包括5AAATTC3和5GAGTTC3等，导致EcoRI在DNA分子上的切割频率大大增加。能产生星号活性的限制性核酸内切酶还包括BamHI等，在涉及上述两种酶的多酶联合酶解反应的设计时，应充分考虑这一点。 限制性核酸内切酶的反应规模设计主要取决于待酶切DNA的量，由其确定酶量，最后确定反应体积。一个标准单位（U）的任何限制性核酸内切酶的定义为在最佳缓冲系统中，37反应一小时完全水解一微克pBR322 DNA所需的酶量。因此，一个标准的酶切反应设计为：0.1-1.0mg DNA 5ml、十倍的缓冲液2ml、酶1ml（十倍过量），无菌重蒸水12ml，反应总体积为20ml。商品酶一般含有50%的甘油，为了确保甘油在反应体系中不对酶活性及专一性造成影响，酶的加入体积最好不要超过反应总体积的十分之一。有时由于待酶切DNA样品的纯度不够，可以适当扩大反应体积，以降低DNA样品中杂质对酶活性的抑制作用。另外，整个反应体系应尽可能做到无菌，防止痕量存在的DNA酶对酶切产物的进一步降解。微量的金属离子往往会抑制限制性核酸内切酶的活性，这也是在酶切反应中使用重蒸水的原因。酶解反应结束后，有时需要使酶灭活，大多数限制性核酸内切酶可简单地在68保温十分钟灭活，某些酶如BamHI等不易加热灭活，可用等体积的苯酚-氯仿溶液处理反应液，再用乙醚萃取残留的苯酚（苯酚是酶的强烈抑制剂），最后用乙醇沉淀回收DNA。但在一般情况下，无论是走电泳或乙醇沉淀DNA，都不需要酶的灭活这步工序。二、T4-DNA连接酶的连接反应 T4-DNA连接酶催化的连接反应的缓冲系统组成为：50-100mM Tris-HCl（pH 7.5），10mM MgCl2，5mM DTT以及1mM的ATP，过量的甘油同样对连接酶的活性有抑制作用。在连接反应的设计时，同样应以待连接的DNA量为基准。通常一国标单位（U）的T4-DNA连接酶定义为，在最佳缓冲系统及15、一小时之内，完全连接一微克l-DNA的HindIII片段所需的酶量。一般情况下，1ml（1U）的连接酶已经足够，而连接反应总体积则在10-15ml范围内。 影响连接反应的因素很多，包括温度、离子浓度、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。如果待连接的DNA片段携带由限制性核酸内切酶产生的粘性末端，则在较低的温度下，粘性末端退火形成含有两个交叉缺口的互补双链结构。这时的连接可视为分子内反应，其连接反应速度比分子间的连接速度快，因此理论上来说，连接反应温度应以不高于粘性末端的熔点温度（Tm）为宜。虽然Tm值随着粘性末端的长度及碱基成份而变化，但是大多数限制性核酸内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下。另一方面，T4-DNA连接酶连接活性本身的最适温度却是37，5以下活性大为减少，因此在实际操作时，连接反应温度与时间常采用下列几种组合：15-2小时、12-8小时、7过夜。三、重组率及其影响因素 重组率是指在连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比，虽然它与连接反应效率有关，但含义不同。如果外源DNA片段与载体DNA均用同一种限制性核酸内切酶切开，则连接反应产物可存在多种形式，如含有外源DNA片段的重组分子和自我连接的载体分子，后者称为载体的自我环化或空载。连接效率高并不一定等于重组率就高，在连接反应中增加连接酶的用量和延长反应时间，一般只能提高连接效率，但未必对重组率的提高有利。提高重组率可采用下列方法：（1）提高外源DNA片段与载体DNA的分子数之比，理想的比例范围为二比一至十比一，这样可以增加外源DNA片段与载体分子之间的碰撞机会，减少载体DNA分子之间以及载体DNA两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化的能力；（2）在连接反应前，先用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除其5末端的磷酸基团，这样即使载体DNA分子的两个粘性末端发生退火互补，也不能形成共价环化结构，而且这种退火互补与重新开环是可逆进行的，这就为载体分子最大限度地接纳外源DNA片段提供了条件，而外源DNA片段与载体DNA退火后，连接酶仍可借助于外源DNA片段5端的磷酸基团将两者连接在一起，形成在每一条链上各含有一个缺口的准重组分子，两个缺口之间的距离等于外源DNA片段的大小。除非外源DNA片段极小（50bp），一般情况下这种准重组分子在室温下不会开环。在后续的转化中，准重组分子同样可以进入受体细胞（转化效率稍低），并在受体细胞内得到修复，形成完整的重组DNA分子；（3）在连接反应前，用TdT酶在载体分子的3羟基末端聚合一段同种碱基的寡聚核苷酸，防止载体DNA分子之间以及两个末端之间的连接，而在外源DNA片段的3末端加上互补性的寡聚核苷酸，两者退火后甚至不经连接就可导入受体细胞内。四、DNA分子重组/连接的方法1相同粘性末端的连接 如果外源DNA和载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种DNA分子均含有相同的末端（经双酶切后，两种DNA的两个末端序列不同），因此混合后它们能顺利连接为一个重组DNA分子。经单酶处理的外源DNA片段在重组分子中可能存在正反两种方向，而经两种非同尾酶处理的外源DNA片段只有一种方向与载体DNA重组。这两种重组分子均可用相应的限制性核酸内切酶重新切出外源DNA片段和载体DNA，克隆的外源DNA片段可以原样回收。 用两种同尾酶分别切割外源DNA片段和载体DNA，由于产生的粘性末端相同，因此也可方便地连接。一种极端的例子是外源DNA用同尾酶A和B水解，而载体用这组同尾酶另外两个成员C和D酶切，则两种DNA分子的四个末端均相同，它们都属于最为简单的相同粘性末端的连接。值得注意的是，多数同尾酶产生的粘性末端一经连接，重组分子便不能用任何一种同尾酶在相同的位点切开。例如，BamHI（识别序列为5GGATCC3）水解的DNA片段与BglII（识别序列为5AGATCT3）切开的片段连接后，所形成的重组分子在两个原切点处均不能为BamHI和BglII切割，这种现象称为酶切口的“焊死”作用。只有在少数情况下，由两种同尾酶产生的粘性末端经连接后可被其中一种酶切开。例如，EaeI的识别序列为5PyGGCCPu3，EayI的识别序列为5CGGCCG3，它们形成的粘性末端相同，连接后的重组分子序列5PyGGCCG3仅能为EaeI所识别，显然这种情况依赖于限制性内切酶识别序列的相对专一性。2平头末端的连接 T4-DNA连接酶既可催化DNA粘性末端的连接，也能催化DNA平头末端的连接，前者在退火条件下属于分子内的作用，而后者则为分子间的反应。从分子反应动力学的角度讲，后者反应更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平头末端的5磷酸基团或3羟基与另一个平头末端的3羟基和5磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度比粘性末端慢10-100倍。为了提高平头末端的连接速度，可采取以下措施：（1）增加连接酶用量，通常使用粘性末端连接用量的十倍，但在实际操作中，这种方法并不多用；（2）增加DNA平头末端的浓度，提高平头末端之间的碰撞机率；（3）加入NaCl或LiCl以及PEG；（4）适当提高连接反应温度，平头末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞机率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择20-25较为适宜。 连接体系中高浓度的ATP对平头末端的连接极为不利。ATP浓度超过1mM，会发生腺嘌呤核苷酸在连接位点的随机插入；当ATP浓度升至2.5mM时，又会显著地抑制平头末端连接反应本身。因此，除非需要特异性抑制平头末端的连接，对大多数连接反应而言，0.5mM的ATP浓度是较为合适的。3不同粘性末端的连接 不同的粘性末端原则上无法直接连接，但可将它们转化为平头末端后再进行连接，所产生的重组分子往往会增加或减少几个碱基对，并且破坏了原来的酶切位点，使重组的外源DNA片段无法回收；若连接位点位于基因编码区内，则会破坏阅读框架，使之不能正确表达。不同粘性末端的连接有四种类型：（1）待连接的两种DNA分子都具有5突出末端。在连接反应之前，两种DNA片段或用Klenow酶补平，或用S1核酸酶切平，然后进行连接。前者产生的重组分子多出四对碱基，而后者产生的重组分子则少去四对碱基。一般情况下大多使用Klenow酶补平的方法，因为S1核酸酶掌握不好，容易造成双链DNA的降解反应；（2）待连接的两种DNA分子都具有3突出末端。Klenow酶对这种结构没有活性，可以用T4-DNA聚合酶将这两种DNA的3末端切除，形成平头末端后再连接，所产生的重组分子同样少了四对碱基；（3）一种DNA分子具有3突出末端，另一种DNA分子携带5突出末端。这种情况要求两种DNA分子在连接前，分别进行相应的处理，若5突出末端用Klenow酶补平，而3突出末端用T4-DNA聚合酶修平，则连接产生的重组DNA分子并没有改变碱基对的数目；（4）两种DNA分子均含有不同的两个粘性末端。通常先用Klenow酶补平一种DNA分子的5突出末端，再用T4-DNA聚合酶切平3突出的另一末端，而且两种DNA分子可以混合一同处理。 在有些情况下，含有不同5突出粘性末端的两种DNA分子经Klenow酶补平连接后，形成的重组分子可恢复一个或两个原来的限制性内切酶识别序列，甚至还可能产生新的酶切位点，如XbaI与HindIII的粘性末端（XbaI切点恢复）、XbaI与EcoRI（两者切点均保留）以及BamHI与BglII（产生ClaI位点）。4人工粘性末端的连接 上述不同粘性末端的连接大都破坏了原来的限制性内切酶识别序列，导致重组的外源DNA片段不能回收。为了克服这一困难，可以用TdT处理经酶切的DNA片段，使之在3末端增补核苷酸同聚物，然后进行连接，同时由TdT酶产生的人工粘性末端还可有效地避免载体分子内或分子间以及外源DNA片段之间的连接，以提高重组率。 （1）5突出的末端。若外源DNA片段含有EcoRI的粘性末端，则先用Klenow酶补平，然后用TdT酶加上多聚腺嘌呤核苷酸的人工粘性末端，使得EcoRI酶切口在连接后完好保留；载体DNA分子则在补平后加上多聚鸟嘌呤核苷酸的互补人工粘性末端，两种分子退火粘在一起。由于TdT酶并不能精确控制多聚核苷酸末端的碱基数目，因此在同一DNA分子的两个人工粘性末端以及两个分子之间的人工粘性末端有可能长度不等，但若此时再用Klenow酶填补缺刻，经连接后就能形成完整的重组分子，而克隆的外源DNA片段仍可用EcoRI回收。 （2）3突出的末端。若外源DNA片段带有PstI的粘性末端，则用TdT酶直接加上多聚鸟嘌呤核苷酸的人工粘性末端（目的是保留PstI的酶切位点），而载体分子则加上多聚胞嘧啶核苷酸的互补末端，退火后用Klenow酶填补有可能出现的缺刻，并将之连接成重组分子，此时克隆的外源DNA片段可用PstI回收。 （3）平头末端。DNA分子的平头末端不管是否由限制性内切酶产生，经TdT酶接上同聚物人工粘性末端后，一般情况下不能用限制性内切酶回收插入片段，但可用S1核酸酶从重组分子上切下这个插入片段。其做法是：两种DNA分子分别用TdT酶增补多聚腺嘌呤核苷酸和多聚胸腺嘧啶核苷酸的人工粘性末端，退火后用Klenow酶填补缺刻，并将之连接成重组分子。此时或克隆后只需将重组分子稍稍加热，AT配对区域就会出现单链结构，用S1核酸酶处理即可回收插入片段，而重组分子的其它区域一般不会出现大面积连续的AT区域，因此其Tm总是高于AT人工粘性末端（通常由30-50个AT碱基对组成）区域的Tm，只要掌握合适的加热温度，就能保证S1核酸酶作用位点的正确性。五、酶切位点的定点更换 在有些分子克隆实验中，需要将DNA上的一种限制性内切酶识别序列转化成另一种酶的识别序列，以便DNA分子的重组。有两种方法可以达到这个目的。 （1）加装人工接头。接头是一段含有某种限制性内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，通常是八聚体和十聚体。图3-23表示的是一种利用人工接头片段在DNA上更换或增添限制性内切酶识别序列的标准程序。如果DNA分子的两端是平头末端，则将人工接头（Linker）直接连接上去，然后用相应的限制性内切酶切出粘性末端。若要在DNA分子的某一限制性内切酶的识别序列处接上另一种酶的人工接头，可先用前一种酶把DNA切开，然后依照5突出末端用Klenow酶补平以及3突出末端用T4-DNA聚合酶切平的原则，处理DNA末端使之成为平头，再接上相应的人工接头。 （2）改造识别序列。这种方法的原理是利用一种限制性内切酶的识别序列改造另一种酶的识别序列，从而使前者迁移到后者的位置上。例如，将DNA上的AluI识别序列改造成EcoRI识别序列，其操作程序可由图3-24表示：先用AluI切开DNA片段，将任何一段含有EcoRI识别位点的DNA片段用EcoRI切开，并以Klenow酶补平粘性末端，两种DNA分子连接，再用EcoRI切开重组分子，原来的AluI位点即转化为EcoRI位点。这里应区分两种情况：第一，DNA片段上有多个AluI位点需要同时换成EcoRI识别位点；第二，DNA分子上只有一个AluI位点，两种情况的操作方式并不完全相同。由上述操作程序可知，任何能提供3G的限制性内切酶识别序列，包括其粘性末端经Klenow酶补平或经T4-DNA聚合酶切平，均可转变为EcoRI识别序列以及与EcoRI相似的其它酶的识别序列，如：AvaII、BamHI、BstEII等。根据同样的原理，还可将提供3C、3A和3T的限制性内切酶识别序列更换成相应的其它酶识别序列，这些序列的对应关系列在表3-9。第三节 重组体导入细菌细胞（重组DNA分子的转与增） DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化（Transformation）。对于不同的受体细胞，往往采取不同的转化战略，一、重组DNA分子的转化操作 DNA重组技术中的转化仅仅是一个将DNA重组分子人工导入受体细胞的单元操作过程，它沿用了自然界细菌转化的概念，但无论在原理还是在方式上均与细菌自然转化有所不同，同时也与哺乳动物正常细胞突变为癌细胞的细胞转化概念有着本质的区别。重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在DNA重组技术中统称为转化操作。 经典的细菌转化现象是1928年英国的细菌学家Griffich在肺炎双球菌中发现的，并在1944年由美国的Avery形成完整的转化概念。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状，其中来自供体菌的游离DNA片段称为转化因子。在自然条件下，转化因子由供体菌的裂解产生，其全基因组断裂为100Kb左右的DNA片段。具有转化能力的DNA片段常常是双链DNA分子，单链DNA分子很难甚至根本不能转化受体菌。就受体细菌而言，只有当其处于感受态（即受体细胞最易接受外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态）时才能有效地接受转化因子。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。 细菌转化的全过程包括五个步骤：（1）感受态的形成。典型的革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚，形成感受态时细胞表面发生明显的变化，出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等；（2）转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA、双链RNA以及DNA-RNA杂合双链都不能结合在膜上；（3）转化因子的吸收。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中，这个吸收过程为EDTA所抑制，可能是因为核酸酶活性需要二价阳离子的存在；（4）整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处；（5）转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。 革兰氏阴性细菌细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，供体DNA进入受体细胞的转化机制还不十分清楚。革兰氏阴性细菌在感受态的建立过程中伴随着几种膜蛋白的表达，它们负责识别和吸收外源DNA片段。研究表明，嗜血杆菌和萘氏杆菌均能识别自身的DNA，如嗜血杆菌所吸收的自身DNA片段中都有一段11bp的保守序列5AAGTGCGGTCA3。这表明革兰氏阴性细菌在转化过程中对供体DNA的吸收具有一定的序列特异性，受体细胞只吸收它自己或与其亲缘关系很近的DNA片段，外源DNA片段可以结合在感受态细胞的表面，但极少能吸收。与革兰氏阳性菌不同，嗜血杆菌和萘氏杆菌等革兰氏阴性细菌的DNA是以完整的双链形式被吸收的，在整合作用发生之前，进入受体细胞内的双链DNA片段与相应的DNA结合蛋白结合，不为核酸酶所降解，DNA整合同样发生在单链水平上，另一条链以及被取代的受体菌单链DNA则被降解。 原核细菌的转化虽是一种较为普遍的遗传变异现象，但是目前仍只是在部分细菌的种属之间发现，如肺炎双球菌、芽孢杆菌、链球菌、假单孢杆菌以及放线菌等。而在肠杆菌科的一些细菌间很难进行转化，其主要原因是一方面转化因子难以被吸收，另一方面受体细胞内往往存在着降解线状转化因子的核酸酶系统。另外，细菌自然转化是自身进化的一种方式，通常伴随着DNA的整合，因此在DNA重组的转化实验中，很少采取自然转化的方法，而是通过物理方法将重组DNA分子导入受体细胞中，同时也对受体细胞进行遗传处理，使之丧失对外源DNA分子的降解作用，确保较高的转化效率。二、细菌受体细胞的改造与选择 野生型的细菌一般不能用作基因工程的受体细胞，因为它对外源DNA的转化效率较低，并且有可能对其它生物种群存在感染寄生性，因此必须通过诱变手段对野生型细菌进行遗传性状改造，使之具备下列条件：1限制缺陷型 野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统。如果从大肠杆菌C600株中提取的质粒DNA，用于转化大肠杆菌K12株，后者的限制系统便会切开未经自身修饰系统修饰的质粒DNA，使之不能在细胞中有效复制，因此转化效率很低。同样，来自不同生物的外源DNA或重组DNA转化野生型大肠杆菌，也会遇到受体细胞限制系统的降解。为了打破细菌转化的种属特异性，提高任何来源的DNA分子的转化效率，通常选用限制系统缺陷型的受体细胞。大肠杆菌的限制系统主要由hsdR基因编码，因此不具有hsdR-遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的能力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。2重组缺陷型 野生型细菌在转化过程中接纳的外源DNA分子能与染色体DNA发生体内同源重组反应，这个过程是自发进行的，由rec基因家族的编码产物驱动。大肠杆菌中存在着两条体内同源重组的途径，即RecBCD途径和RecEF途径，前者远比后者重要，但两种途径均需要RecA重组蛋白的参与。RecA是一个单链蛋白，在同源重组过程中起着不可替代的作用，它能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换，recA-型的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低106倍。大肠杆菌的recB、recC和recD基因分别编码不同分子量的多肽链，三者构成一个在同源重组中的统一功能单位RecBCD蛋白（核酸酶V），它具有依赖于ATP的双链DNA外切酶和单链DNA内切酶双重活性，这两种活性也是同源遗传重组所必需的。以外源基因克隆、扩增以及表达为目的的基因工程实验是建立在DNA重组分子自主复制基础上的，因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因型为recA-、recB-或recC-，有些大肠杆菌受体细胞则三个基因同时被灭活。3转化亲和型 用于基因工程的受体细胞必须对重组DNA分子具有较高的可转化性，这种特性主要表现在细胞壁和细胞膜的结构上。利用遗传诱变技术可以改变受体细胞壁的通透性，从而提高其转化效率。在用噬菌体DNA载体构建的DNA重组分子进行转染时，受体细胞膜上还必须具有噬菌体的特异性吸附受体，如对应于l噬菌体的大肠杆菌膜蛋白LamB等。4遗传互补型 受体细胞必须具有与载体所携带的选择标记互补的遗传性状，方能使转化细胞的筛选成为可能。例如，若载体DNA上含有氨苄青霉素抗性基因（Apr），则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感，当重组分子转入受体细胞后，载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，以区分转化细胞与非转化细胞。更为理想的受体细胞是具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征，这样便可直接筛选到外源基因表达的转化细胞。5感染寄生缺陷型 相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有感染和寄生效应，重组DNA分子导入这些细菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体内，并广泛围传播，如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手段制造生物武器不在此例。 受体细胞选择的另一方面内容是受体细胞种属的确定。对于以改良生物物种为目的的基因工程操作而言，受体细胞的种属没有选择的余地，待改良的生物物种就是受体；但对外源基因的克隆与表达来说，受体细胞种类的选择至关重要，它直接关系到基因工程的成败。三、细菌细胞转化方法1Ca2+诱导转化 1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收l噬菌体DNA，此后不久，Cohen等人用此法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序是：将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，Hanahan除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。2PEG介导的细菌原生质体转化 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌、霉菌甚至植物等真核细胞有效。只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。3电穿孔驱动的完整细胞转化 电穿孔（Electroporation）是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。具体操作程序因转化细胞的种属而异。对于大肠杆菌来说，大约50ml的细菌与DNA样品混合后，置于装有电极的槽内，然后选用大约25微法拉第、2.5千伏和200欧姆的电场强度处理4.6毫秒，即可获得理想的转化效率。虽然电穿孔法转化较大的重组质粒（100Kb）的转化效率比小质粒（3Kb）低一千倍，但这比Ca2+诱导和原生质体转化方法理想，因为这两种方法几乎不能转化大于100Kb的质粒DNA。对于几乎所有的细菌均可找到一套与之匹配的电穿孔操作条件，因此电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程序。4接合转化 接合（Conjugation）是指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由结合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码。在DNA重组中常用的绝大多数载体质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合方法转化受体细胞，然而如果在同一个细胞中存在着一个含有接合功能区域的辅助质粒，则有些克隆载体质粒便能有效地接合转化受体细胞。因此，首先将具有接合功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的细胞中，然后将这种供体细胞与难以用上述转化方法转化的受体细胞进行混合，促使两者发生接合作用，最终导致重组质粒进入受体细胞。 整个过程涉及到包括受体菌在内的三种菌株的混合，即受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。三者混合后，接合质粒即可从辅助菌株转移至供体菌，也可直接进入受体菌。含有两种相容型质粒的供体菌再与受体菌或辅助菌发生接合反应。此时细菌混合液中已出现多种形式的细胞，因为任何菌株接合发生频率都不可能达到100%。为了迅速而准确地筛选出仅接纳了重组质粒的受体细胞（即接合转化细胞），必须依赖于所使用的菌种和质粒上相应的遗传标记，例如携带接合质粒的菌株A不能在最小培养基上生长，且对抗生素X敏感；含有待转化的重组质粒的菌株B，也不能在最小培养基生长，它如果失去含有X抗性基因的重组质粒，则同样对X敏感；受体细胞C能在最小培养基中生长，且在抗生素X和Y存在时不能生长。三种菌株首先在无抗生素的完全培养基中进行混合，短暂培养启动接合转化，然后迅速涂布在含有抗生素的最小培养基上进行筛选。此时，只有接纳了重组质粒的受体细胞才能长成菌落（克隆），其中为数极少的菌落含有双质粒。随机选择几个菌落，将之涂布在含有抗生素的最小培养基上，凡是在这种培养基中不能生长的菌落即为只含有重组质粒的受体转化克隆，因为只有接合质粒所携带的Y抗生素抗性基因能赋予受体细胞对Y的抗性。应当特别指出的是，在接合转化过程中使用的重组质粒与接合质粒必须具有互为相容性，否则两者难以稳定地存在于供体菌中。5l噬菌体的转染 以l-DNA为载体的重组DNA分子，由于其分子量较大，通常采取转染的方法将之导入受体细胞内。在转染之前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使之成为具有感染活力的噬菌体颗粒。用于体外包装的蛋白质可以直接从大肠杆菌的溶原株中制备，现已商品化。这些包装蛋白通常分成分离放置且功能互补的两部分，一部分缺少E组份，另一部分缺少D组份。包装时，只有当这两部分的包装蛋白与重组l-DNA分子三者混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装溶液被重组分子污染后均不能包装成有感染活力的噬菌体颗粒，这种设计也是基于安全考虑。整个包装操作过程与转化一样简单：将l-DNA与外源DNA片段的连接反应液与两种包装蛋白组份混合，在室温下放置一小时，加入一滴氯仿，离心除去细菌碎片，即得重组噬菌体颗粒的悬浮液。将之稀释合适的倍数，并与处于对数生长期的大肠杆菌受体细胞混合涂布，过夜培养即可用于筛选与鉴定。四、转化率及其影响因素1转化率的定义 转化率是转化（包括感染）效率的评估指标，通常有两种形式表征转化率，一是在待转化DNA分子数大于受体细胞数的条件下，转化细胞与细胞总数之比，例如在标准条件下，利用Ca2+诱导法转化质粒DNA的最大转化率为10-3，即平均每一千个受体细胞中有一个细胞接纳了质粒DNA，如果假定处于感受态的受体细胞能100%地接纳DNA分子，则这种转化率直接反应了受体细胞中感受态细胞的含量；转化率的另一种表示形式是在受体细胞数相对于待转化DNA分子数大大过量时，每微克DNA转化所产生的克隆数。由于在一般规模的转化实验中，所观测到的每个受体细胞只能接纳一个DNA分子，因此上述转化率的定义也可表征为每微克DNA进入受体细胞的分子数。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108/mg DNA，其含义是每微克pUC18只有108个分子能进入受体细胞，一微克pUC18中共有6.021017/2,6866603.41011个分子，也就是说，每3,400个pUC18分子中只有一个分子进入受体细胞。如果能够准确确定转化一微克pUC18所用的受体细胞的总数，则上述两种转化率是可以换算的。2转化率的用途 利用已知的转化率和重组率参数可以帮助设计DNA重组实验的规模。例如，某一连接系统的重组率为20%，转化率为107/mg DNA，经体外切割与连接处理后的载体DNA或重组分子的转化率比直接从细菌中制备的载体DNA低100倍，若载体DNA和重组DNA分子的转化率差异忽略不计，则欲获得104个含有重组DNA分子的克隆，至少应投入0.5mg的载体DNA，其计算方法如下：104/20%10-2107。按外源DNA片段与载体DNA分子数十比一的要求，即可推算出外源DNA片段的用量。如果转化培养液全部涂板筛选，理论上可形成5104个转化克隆，若使每块平板上平均含有1,000个克隆，则需涂布50块平板。涂布过密会给后继筛选带来很大困难，涂布太稀，既浪费又给筛选造成不必要的麻烦。3转化率的影响因素 转化率的高低对于一般重组克隆实验关系不大，但在构建基因文库时，保持较高的转化率至关重要。影响转化率的因素很多，其中包括： （1）载体DNA及重组DNA方面。载体本身的性质决定了转化率的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化率明显不同。载体分子的空间构象对转化率也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往具有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化率低，到目前为止，大于30Kb的重组质粒很难进行转化。 （2）受体细胞方面。受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还应与所转化的载体DNA性质相匹配，如pBR322转化大肠杆菌JM83株，其转化率不高于103/mg DNA，但若转化ED8767株，则可获得106/mg DNA的转化率。 （3）转化操作方面。受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。对于Ca2+诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12-24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。对于原生质体转化而言，再生率的高低直接影响转化率，而原生质体的再生率又受诸多因素的制约。在一次转化实验中，DNA分子数与受体细胞数的比例对转化率也有影响，通常50-100ng的DNA对应于108个受体细胞或原生质体，在此条件下，加大DNA量并不能线性提高转化率，甚至反而使转化率下降。不同的转化方法导致不同的转化率，这是不言而喻的，五种细菌常用的转化方法的最佳转化率范围列在表3-12中，其中电穿孔法的转化率与质粒大小密切相关，但明显优于Ca2+诱导的转化，接合转化虽然转化率较低，但对于那些不能用其它方法转化的受体细胞来说不失为一种选择，如光合细菌大多数种属的菌株均采用接合转化方式将重组DNA分子导入细胞内。五、转化细菌细胞的扩增 转化细胞的扩增是指受体细胞经转化后立即进行短时间的培养，如Ca2+诱导转化后的受体细胞在37培养一小时、原生质体转化后的细胞壁再生过程以及l重组DNA分子体外包装后与受体细胞的混合培养等。转化细胞的扩增具有下列三方面的内容：（1）转化细胞的增殖，使得有足够数量的转化细胞用于筛选环节；（2）载体DNA上携带的标记基因拷贝数扩增及表达，这是进行筛选单元操作的前提条件；（3）克隆的外源基因的表达，如果重组DNA分子的筛选与鉴定依赖于外源基因表达产物的检测，则外源基因必须在转化细胞扩增期间表达。总之，转化细胞扩增的目的只有一个，即为后续的筛选鉴定等操作创造条件。第四节 外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1. 菌株选择转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。 常用的如如：ura3-52、 trp1-289、leu2-3、leu2-112。2. 酵母的转化方法（1）利用原生质球进行转化 （2）利用Li+盐进行转化二、导入植物细胞1. 叶盘法（leaf disk)2. 电击法（electroporation)3.基因枪法（gene gun） 4. 农杆菌（agrobacterium）介导三、导入哺乳动物细胞1. 磷酸钙沉淀法2. 脂质体（lipofectin）载体法3. 显微注射法(microinjection)第六章(3)目的基因导入受体细胞第五节 转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化。由于重组率和转化率不可能达到100%的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组分子的非转化细胞）、重组子（含有重组DNA分子的转化子）与非重组子（仅含有空载载体分子的转化子），以及期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期望重组子（不含目的基因的重组子）。在一般情况下，经转化与扩增操作后的受体细胞总数（包括转化子与非转化子）已达109-1010，从这些细胞中快速准确地选出期望重组子的战略是将转化扩增物稀释一定的倍数后，均匀涂布在用于筛选的特定固体培养基上，使之长出肉眼可分辨的菌落或噬菌斑（克隆），然后进行新一轮的筛选与鉴定。一、载体遗传标记筛选法 载体遗传标记法的原理是利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。由于标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，即可保证转化子显现（长出菌落或噬菌斑），而非转化子隐去（不生长），这种方法称为正选择。经过一轮正选择，往往可使转化扩增物的筛选范围缩小成千上万倍。如果载体分子含有第二个标记基因，则可利用这个标记基因进行第二轮的正选择或负选择（视标记基因的性质而定），从众多转化子中筛选出重组子。（一）抗药性标记筛选法 抗药性筛选法实施的前提条件是载体DNA上携带有受体细胞敏感的抗生素的抗性基因，如pBR322质粒上的Ampr和Tetr。如果外源DNA是插在pBR322的BamHI位点上，则只需将转化扩增物涂布在含有Amp的固体平板上，理论上能长出的菌落便是转化子；如果外源DNA插在pBR322的PstI位点上，则利用Tet正向选择转化子。 正选择获得的转化子中会含有重组子与非重组子。为了进一步筛选出重组子应再第二轮负选择。用无菌牙签将Ampr的转化子分别逐一挑在只含一种抗生素的Tc和Ap两块平板上。由于外源DNA片段在BamHI位点的重组，导致载体DNA的Tcr基因插入灭活，选择的重组子具有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr，因此重组子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生长。只要比较两种平板上各转化子的生长状况，即可在Ap板上挑出重组子，但是如果转化子有成千上万个，这种方法非常耗时。其改