常用免疫学相关实验技术及方法

一、免疫学方法的发展史一、免疫学方法的发展史1796年：年：Jenner发明了接种牛痘方法预防天花发明了接种牛痘方法预防天花 2个世纪后被广泛接受个世纪后被广泛接受1979年年 WHO宣布天花灭迹宣布天花灭迹19世纪末期：世纪末期：koch发现发现病原体是感染性疾病病因病原体是感染性疾病病因 促进了实验免疫学的发展促进了实验免疫学的发展19世纪世纪80年代：年代：Pasteur 预防鸡霍乱的疫苗预防鸡霍乱的疫苗 狂犬病疫苗狂犬病疫苗1888：Behring发现了抗体发现了抗体 Methchnikoff发现了巨噬细胞发现了巨噬细胞20世纪初：发现了调理素，体液因素可影响吞噬细胞功能世纪初：发现了调理素，体液因素可影响吞噬细胞功能1900-1930：认识了过敏反应，发现了血清病：认识了过敏反应，发现了血清病 Arthus反应，皮肤反应反应，皮肤反应 调理作用，补体结合反应调理作用，补体结合反应 疫苗研究有了新发展：疫苗研究有了新发展：BCG-结核结核 白喉毒素白喉毒素-白喉白喉1935-1957：抗体纯化，鉴定及测定技术：抗体纯化，鉴定及测定技术 凝胶内沉淀技术，抗原抗体凝胶内沉淀技术，抗原抗体 免疫电泳等血清血技术免疫电泳等血清血技术1959-1974：放射标记免疫技术、酶标免疫技术：放射标记免疫技术、酶标免疫技术 生物素生物素-亲和素标记免疫技术亲和素标记免疫技术 荧光标记免疫技术、金荧光标记免疫技术、金(银银)标记免疫等技术标记免疫等技术 化学发光免疫技术、免疫分子转染技术化学发光免疫技术、免疫分子转染技术 细胞和细胞因子测定技术细胞和细胞因子测定技术20世纪世纪70年代后期：免疫及分子生物学技术发展成熟年代后期：免疫及分子生物学技术发展成熟 单克隆抗体问世，组织相容性抗原单克隆抗体问世，组织相容性抗原 B细胞免疫球蛋白基因重组，细胞免疫球蛋白基因重组，T细胞受体细胞受体1980：PCR技术技术 生物芯片技术生物芯片技术 转基因动物技术转基因动物技术免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反应的过程免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反应的过程基本参与单位有：抗原基本参与单位有：抗原 抗体抗体 免疫细胞和免疫分子免疫细胞和免疫分子一、抗原制备一、抗原制备1.天然抗原制备天然抗原制备(1)粗抗原的提取：冻融法、冷热交替法、超声法粗抗原的提取：冻融法、冷热交替法、超声法(2)粗抗原纯化：粗抗原纯化：w选择性沉淀法：盐析沉淀法、核酸沉淀法选择性沉淀法：盐析沉淀法、核酸沉淀法w凝胶过滤和离子交换层析凝胶过滤和离子交换层析w亲和层析法亲和层析法w蛋白电泳蛋白电泳2.合成抗原制备合成抗原制备化学合成高分子氨基酸聚合物，即多肽化学合成高分子氨基酸聚合物，即多肽合成肽与载体蛋白连接后能有效诱导抗体产生免疫应答合成肽与载体蛋白连接后能有效诱导抗体产生免疫应答常用方法：常用方法：tea bag method纯化方法：反向高效液相色谱法纯化方法：反向高效液相色谱法二、抗体制备二、抗体制备1.多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibody)制备制备w在自然免疫或免疫动物后产生的具有在自然免疫或免疫动物后产生的具有不同特异性和亲不同特异性和亲和性和性的多种抗体混合分子的多种抗体混合分子w具有抗多种不同抗原的表位具有抗多种不同抗原的表位2.单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody)制备制备 w由一个识别由一个识别一种抗原表位一种抗原表位的的B细胞克隆产生的同源抗体细胞克隆产生的同源抗体w产生方法：产生方法：B细胞克隆与小鼠骨髓瘤细胞融合产生细胞克隆与小鼠骨髓瘤细胞融合产生 的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞3.基因工程抗体基因工程抗体(engineer antibody)应用抗体库技术产生应用抗体库技术产生w将某种动物将某种动物所有抗体的可变区基因所有抗体的可变区基因克隆到质粒或噬菌体中克隆到质粒或噬菌体中并表达并表达w利用不同抗原筛选出携带特异抗体的基因克隆，从而获得利用不同抗原筛选出携带特异抗体的基因克隆，从而获得特异性抗体特异性抗体三、抗体的应用及其相应的免疫学技术三、抗体的应用及其相应的免疫学技术(一一)酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISA）w基本原理是利用酶标记抗体或抗原，使之成为酶基本原理是利用酶标记抗体或抗原，使之成为酶标抗体标抗体(或抗原或抗原)w抗原或抗体固定到固相载体表面并保持其免疫活抗原或抗体固定到固相载体表面并保持其免疫活性性w利用抗原、抗体复合物的免疫学反应原理来测定利用抗原、抗体复合物的免疫学反应原理来测定未记标的抗原未记标的抗原(或抗体或抗体)(二二)放射免疫测定放射免疫测定(radioimmunoassay)用于测定组织液和血液中的激素水平用于测定组织液和血液中的激素水平w在固相载体中标记的特异性抗体（在固相载体中标记的特异性抗体（125I来标记）与特定的来标记）与特定的未标记抗原产生特异性免疫结合未标记抗原产生特异性免疫结合w非特异性吸附可以通过加入过量的非特异性卵磷脂蛋白或非特异性吸附可以通过加入过量的非特异性卵磷脂蛋白或洗涤液来封闭洗涤液来封闭w特异性结合的抗原、抗体复合物残留在反应板或试管中，特异性结合的抗原、抗体复合物残留在反应板或试管中，其放射性强度可以直接测定其放射性强度可以直接测定(三三)免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescence technology)w原理是将荧光色素与特异性抗体原理是将荧光色素与特异性抗体(或抗原或抗原)以化学的方式结以化学的方式结合起来，但不影响该血清抗体的免疫特性合起来，但不影响该血清抗体的免疫特性w将荧光标记抗体在特定的条件下浸染标本，使之与标本中将荧光标记抗体在特定的条件下浸染标本，使之与标本中相应的抗原产生结合反应相应的抗原产生结合反应w反应的结果反应的结果产生含有荧光标记的抗原、抗体结合物，产生含有荧光标记的抗原、抗体结合物，可用荧光显微镜观察可用荧光显微镜观察(四四)免疫组织化学技术免疫组织化学技术(immunohistochemistry)检测组织切片中蛋白分子在细胞中分布的方法检测组织切片中蛋白分子在细胞中分布的方法w用化学的方法将酶与抗体结合起来，将标记的抗体与组织用化学的方法将酶与抗体结合起来，将标记的抗体与组织切片中的抗原产生特异性的结合切片中的抗原产生特异性的结合w结合后的抗原、抗体复合物中含有的酶可将再加入的无色结合后的抗原、抗体复合物中含有的酶可将再加入的无色酶底物通过化学反应呈色，借助显微镜检测各种抗原物质酶底物通过化学反应呈色，借助显微镜检测各种抗原物质(五五)免疫印迹技术免疫印迹技术(immunoblot，Western blot)w基本过程是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离基本过程是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离w通过电转染将已分离的蛋白分子转移到固相膜上通过电转染将已分离的蛋白分子转移到固相膜上w在固相膜上用标记在固相膜上用标记(放射标记或酶标记放射标记或酶标记)的特异性抗体检测的特异性抗体检测蛋白质抗原蛋白质抗原w免疫印迹技术结合了凝胶电泳分辩力高和固相免疫测定敏免疫印迹技术结合了凝胶电泳分辩力高和固相免疫测定敏感、简便、稳定等优点感、简便、稳定等优点OSCCTca8113TbTca8113-MOSC-4OSCCTca8113TbTca8113-MOSC-4A AB B 0 5 10 20 30 60 120 min(六六)免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物是电泳分析与沉淀反应的结合产物w这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应速度，二是将这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应速度，二是将一些蛋白质组分利用其电荷的不同将其分开一些蛋白质组分利用其电荷的不同将其分开w分别与抗体反应，以其沉淀线的最高稀释度为抗体的效价分别与抗体反应，以其沉淀线的最高稀释度为抗体的效价 1.免疫电泳免疫电泳 2.对流免疫电泳对流免疫电泳 3.火箭免疫电泳火箭免疫电泳 4.免疫固定电泳免疫固定电泳 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳一、白细胞的分离一、白细胞的分离w血液中红细胞与白细胞比例为血液中红细胞与白细胞比例为600:11000:1w两者的比重不同，其沉降速度亦异两者的比重不同，其沉降速度亦异w通常用两种方法加以分离。通常用两种方法加以分离。1.自然沉降法自然沉降法 2.聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法二、外周血单个核细胞的分离二、外周血单个核细胞的分离w包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其它细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为其它细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.09左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075-1.090，血小板为血小板为1.030-1.035w利用一种密度介于利用一种密度介于1.075-1.092之间而近于等渗透的之间而近于等渗透的溶液溶液(分层液分层液)做密度梯度离心，使细胞按相应密度梯做密度梯度离心，使细胞按相应密度梯度分布，将各种血细胞加以分离度分布，将各种血细胞加以分离w常用的方法有常用的方法有Ficoll和和Percoll两种两种三、淋巴细胞及其亚群的分离三、淋巴细胞及其亚群的分离1.纯淋巴细胞的采集纯淋巴细胞的采集2.黏附贴壁法黏附贴壁法3.磁铁吸引法磁铁吸引法四、淋巴细胞亚群的分离四、淋巴细胞亚群的分离1.E花环沉降法花环沉降法2.尼龙毛分离法尼龙毛分离法3.亲和板结合分离法亲和板结合分离法4.流式细胞分选法流式细胞分选法五、淋巴细胞的功能分析五、淋巴细胞的功能分析(一一)T细胞功能的检测细胞功能的检测1.T细胞转化试验细胞转化试验(1)非抗原性刺激物非抗原性刺激物(2)抗原性刺激物抗原性刺激物2.细胞杀伤试验细胞杀伤试验(1)形态学检查法形态学检查法(2)放射性核素法放射性核素法(二二)B细胞功能的检测细胞功能的检测1.B细胞早期活性指标的测定细胞早期活性指标的测定2.溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验3.B细胞增殖能力试验细胞增殖能力试验(三三)NK细胞能力的检测细胞能力的检测1.形态法形态法2.酶释法酶释法3.荧光法荧光法4.放射性放射性5.化学发光法化学发光法(四四)吞噬细胞的检测吞噬细胞的检测1.中性粒细胞功能的检测中性粒细胞功能的检测(1)细胞运动功能检测细胞运动功能检测(2)吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测2.巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测(1)炭粒廓清试验炭粒廓清试验(2)吞噬功能的检测吞噬功能的检测(3)巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定