RNA提取及常见失败原因.ppt

RNA提取及常见失败原因 研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞 中分离纯化 RNA。 RNA质量的高低常常影响 RT- PCR、 cDNA 库构建 和 Northern Blot等分子生物学 实验的成败。 Trizol是一种新型总 RNA抽提试剂，内含异硫氰 酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出 的核酸酶。 目的 主要试剂 1. Trizol试剂含有苯酚，具有 毒性和刺激性 ，注意操作。 2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉， 注意配带 手套 ，样品尽可能盖严； 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后 得率，因为一部分 RNA会残留在未裂解的细胞中。细 胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。 在清洗和裂解细胞时最好在 低温下操作 ，防止在操作过 程中释放的内源 RNase降解了 RNA。 4. 酵母和一些细菌由于 细胞壁 的特殊结构，可以加入 Trizol试剂同时加入无 RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使 细胞裂解充分。 2-8 避光 保存一年。 准备工作 RNA酶（ Rnase）是导致 RNA降解最主要的物质。 此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活， 但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭 菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的 Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备 RNA时必须 戴 手套 。 2. RNase 的又一污染源是 取液器 。根据取液器制造 商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基 本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （ 1） 塑料制品 ：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标 明 RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不 必再处理。 处理的步骤如下： 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC使其终浓度 为 0.05%0.1%（ DEPC-H2O）。（ DEPC二乙基焦碳 酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用） 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中， 注入 DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶 液中，在通风柜中 37 或室温下处理过夜。 将 DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有 DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸 汽灭菌至少 30分钟。 灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。 （ 2） 玻璃和金属物品 250 烘烤 3小时以上。 DEPC是 RNA酶的化学修饰剂 ,它和 RNA酶的活性基团组 氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物 ,因而使用时需小心。 试验所用试剂也可用 DEPC处理 ,加入 DEPC至 0.1%浓度 , 然后剧烈振荡 10分钟 ,再煮沸 15分钟或高压灭菌以消除残存 的 DEPC,否则 DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA活性。 但 DEPC能与胺和巯基反应 ,因而含 Tris和 DTT的试剂不能 用 DEPC处理。 DEPC(二乙基焦碳酸酯 ) 实验步骤如下： 1. 取 50100mg的组织 ,加入 1 ml Trizol试剂，用匀浆器 打匀 (Trizol 先放于冰上 )。 2. 将匀浆室温放置 5 min。 3. 加入 200 l 氯仿 ,剧烈 震荡混匀 30s，冰上静置 3 min。 4. 12000 rpm， 4 离心 15 min。 5. 将上清液小心转移到新的 1.5 ml离心管中（取 400 l ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀， 室温下放置 15 min。（此步中注意：不要吸取任何中 间层物质，宁缺勿烂。） 6. 12000 rpm， 4 离心 15 min 。 7. 小心移去上清液，防止 RNA沉淀丢失。 8. 用 70%乙醇（ DEPC处理的水配制）洗涤 1次，加入 700 l乙醇，将 RNA沉淀弹起，漂洗。（此时 RNA是 不溶解的） 9. 8000 rpm，室温离心 10min。 10. 尽可能彻底地吸走上清， 防止 RNA沉淀丢失。 11. 真空离心干燥 35分钟，或放在室温下使乙醇完全 挥发掉。 12. 沉淀用 30 l DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶， 68 处理 10 min。 13. RNA检测 (1)测定样品在 260 nm和 280 nm的吸光值 按 1OD=40 g/ ml RNA计算 RNA的产量。 OD260/OD280在 1.8-2.0 。 (2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 ,确定 RNA的完整性和污染情况。 28S 18S 5S 低得率 A样品裂解或匀浆处理不彻底 B最后得到的 RNA沉淀未完全溶解 A260/A2801.65 A检测吸光度时， RNA样品不是溶于 TE，而 是溶于水。低离子浓度和低 pH条件下， A280 值会较高。 B样品匀浆时加的试剂量太少。 C匀浆后样品未在室温放置 5分钟。 D水相中混有有机相。 E最后得到的 RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解 A组织取出后没有马上处理或冷冻 B样品或提取的 RNA沉淀保存于 -5 -20 ， 未在 -60 -70 保存。 C细胞在胰酶处理时被破坏。 D溶液或离心管未经 RNase去除处理。