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RNA提取及常见失败原因 研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞 中分离纯化 RNA。 RNA质量的高低常常影响 RT- PCR、 cDNA 库构建 和 Northern Blot等分子生物学 实验的成败。 Trizol是一种新型总 RNA抽提试剂,内含异硫氰 酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出 的核酸酶。 目的 主要试剂 1. Trizol试剂含有苯酚,具有 毒性和刺激性 ,注意操作。 2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉, 注意配带 手套 ,样品尽可能盖严; 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后 得率,因为一部分 RNA会残留在未裂解的细胞中。细 胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。 在清洗和裂解细胞时最好在 低温下操作 ,防止在操作过 程中释放的内源 RNase降解了 RNA。 4. 酵母和一些细菌由于 细胞壁 的特殊结构,可以加入 Trizol试剂同时加入无 RNase的玻璃珠并剧烈振荡,使 细胞裂解充分。 2-8 避光 保存一年。 准备工作 RNA酶( Rnase)是导致 RNA降解最主要的物质。 此酶非常稳定,在一些极端的条件下只可暂时失活, 但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭 菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的 Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上,因此制备 RNA时必须 戴 手套 。 2. RNase 的又一污染源是 取液器 。根据取液器制造 商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基 本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 ( 1) 塑料制品 :尽量使用一次性无菌塑料制品。已标 明 RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不 必再处理。 处理的步骤如下: 在玻璃烧杯中注入去离子水,加入 DEPC使其终浓度 为 0.05%0.1%( DEPC-H2O)。( DEPC二乙基焦碳 酸酯为活性很强的剧毒物,须在通风橱中小心使用) 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中, 注入 DEPC-H2O,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶 液中,在通风柜中 37 或室温下处理过夜。 将 DEPC-H2O小心倒入废液瓶中,将装有 DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸 汽灭菌至少 30分钟。 灭菌塑料制品烘烤干燥,置洁净处备用。 ( 2) 玻璃和金属物品 250 烘烤 3小时以上。 DEPC是 RNA酶的化学修饰剂 ,它和 RNA酶的活性基团组 氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物 ,因而使用时需小心。 试验所用试剂也可用 DEPC处理 ,加入 DEPC至 0.1%浓度 , 然后剧烈振荡 10分钟 ,再煮沸 15分钟或高压灭菌以消除残存 的 DEPC,否则 DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA活性。 但 DEPC能与胺和巯基反应 ,因而含 Tris和 DTT的试剂不能 用 DEPC处理。 DEPC(二乙基焦碳酸酯 ) 实验步骤如下: 1. 取 50100mg的组织 ,加入 1 ml Trizol试剂,用匀浆器 打匀 (Trizol 先放于冰上 )。 2. 将匀浆室温放置 5 min。 3. 加入 200 l 氯仿 ,剧烈 震荡混匀 30s,冰上静置 3 min。 4. 12000 rpm, 4 离心 15 min。 5. 将上清液小心转移到新的 1.5 ml离心管中(取 400 l ),加入等量体积的异丙醇,上下颠倒几次混匀, 室温下放置 15 min。(此步中注意:不要吸取任何中 间层物质,宁缺勿烂。) 6. 12000 rpm, 4 离心 15 min 。 7. 小心移去上清液,防止 RNA沉淀丢失。 8. 用 70%乙醇( DEPC处理的水配制)洗涤 1次,加入 700 l乙醇,将 RNA沉淀弹起,漂洗。(此时 RNA是 不溶解的) 9. 8000 rpm,室温离心 10min。 10. 尽可能彻底地吸走上清, 防止 RNA沉淀丢失。 11. 真空离心干燥 35分钟,或放在室温下使乙醇完全 挥发掉。 12. 沉淀用 30 l DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶, 68 处理 10 min。 13. RNA检测 (1)测定样品在 260 nm和 280 nm的吸光值 按 1OD=40 g/ ml RNA计算 RNA的产量。 OD260/OD280在 1.8-2.0 。 (2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 ,确定 RNA的完整性和污染情况。 28S 18S 5S 低得率 A样品裂解或匀浆处理不彻底 B最后得到的 RNA沉淀未完全溶解 A260/A2801.65 A检测吸光度时, RNA样品不是溶于 TE,而 是溶于水。低离子浓度和低 pH条件下, A280 值会较高。 B样品匀浆时加的试剂量太少。 C匀浆后样品未在室温放置 5分钟。 D水相中混有有机相。 E最后得到的 RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解 A组织取出后没有马上处理或冷冻 B样品或提取的 RNA沉淀保存于 -5 -20 , 未在 -60 -70 保存。 C细胞在胰酶处理时被破坏。 D溶液或离心管未经 RNase去除处理。
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