免疫组化总结

免疫组化总结免疫组化定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量 进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry )技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry )技 术。原理免疫组织化学染色方法的原理抗原( antigen)1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫 应答产生的效应物质(抗体和效应细胞)在体内或体外发生特异性结合反应的 物质。抗原具有两种性能：(1) 免疫原性(immunogenicity)指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特 性。(2) 反应原性(reactogenicity)指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答产 物发生特异性反应的特性。2. 抗原的分类 完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原 外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等 临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原抗体(antibody)1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B 淋巴细胞活化、增 殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋 白，称为抗体。大部分抗体电泳后位于Y区带，1972年国际免疫学联合会正 式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白 (immunoglobin， Ig)。2. 抗体的种类:五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。免疫组织化学染色技术 中，使用的抗体主要是IgG,个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。 通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色 剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观 察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子 类物质的存在与否。免疫组织化学染色的显色原理（1）基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为 广泛。直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或 细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。 间接法：是将酶标记在第二抗体上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是 由家兔制备的多克隆抗体，单克隆抗体是由小鼠制备的。第二抗体是第一抗体 的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，同标记的第二抗体结 合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一 抗体的麻烦。通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化 学染色的敏感度。IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。（2）显色的基本程序 一抗孵育切片或细胞涂片 二抗（酶标抗体）孵育切片 发色剂显色（核复染）（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂辣根过氧化物酶（ horseradish peroxidase，HRP）HRP + H2O2 HRP H2O2HRP H2O2+ DH2HRP + D + ZOHRP 催化的酶促反 应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色 剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如：CN （4-chloro-l-naphthol）为蓝色TMB （tetramethyl-benzidine ）为深蓝色AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole)为红色DAB (3, 3-diamino benzidine)为棕色碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是以AS-Mx为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色/红色不 容性沉淀物。ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、 淋巴细胞等的 ICC 染色。由于组织细胞内含有内源性 ALP ，在显色液中需加 入终浓度为2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多数内源性ALP活性可被抑 制。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD )是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为B -D-葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、PMS (phenazinemethyl-sulfate ) 0.167mg 、 0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml ，37C孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片 可经脱水、透 明后封片，长期保存。( 4)核复染在显色后，特别是用 DAB 显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水化 后细胞核显示蓝色，与胞质中的 DAB 棕色形成对比。但用 AEC 显色后不能 用苏木素做核复染，因为配制苏木素染料中使用酒精作为介质，可使 AEC 的 红色终产物褪色，且 AEC 显色后只能用水溶性封固剂封片。石蜡切片的免疫组化主要步骤1. 洗载玻片：将载玻片置于重铬酸钾和浓h2so4混合液中，目的是为了是载玻 片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组 织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小 时左右)，再将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37C温箱中，将 多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷， 从而产生吸附作用。2. 包埋组织：先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋 的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体 石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过 调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为 5um, 如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小 镊子将包含有完整组织的载玻片置于40温水中。4. 捞组织：当组织载玻片置于40*温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以 免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻 片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中 23 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差 就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载 玻片置于架子上，放入37*温箱中烘干。5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90% 酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原 理。一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的 话，就要适当延长脱蜡时间，一般为 12-15min。6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而 除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉h2o2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓 冲液，放入微波炉中蒸煮3min (中火)，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然 后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。7. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置 于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非 特异性的位点封闭起来，然后放入37*温箱中半小时。血清稀释1 0倍( 900ul PBS： 100ul 血清封闭液)。8. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围 的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于 4*冰箱中保存过夜。9. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组 织周围的PBS后加上二抗，然后置于37*温箱中半小时。10. 加SABC：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组 织周围的PBS后加上SABC，然后置于37*温箱中半小时。SABC稀释100倍(990ul PBS： 10ul SABC)。SABC:链霉亲和素-生物素复合物(strept avidinbiotin complex， SABC)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的 免疫组化染色方法。11. 加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组 织周围的 PBS 后加上显色剂。(显色剂的配置：在 1ml 水中加 1 滴显色剂 A，摇匀，然后加1滴显色剂B,摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀)A： DABB： H2O2C：磷酸缓冲液DAB：即：二氨基联苯胺(3, 3 -diaminobenzidine)是过氧化物酶(Peroxidase)的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和 积累，形成浅棕色不溶性产物。12. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一 般动物组织为半分钟，植物组织 3-5min。13. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70%酒精-80% 酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2 min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。14. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后 轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。冰冻切片的免疫组化组织取出后于-80*或-20*保存，进行冰冻切片，切好的冰冻切片于-80*或- 20*保存。需要时取出室温恢复5分钟，参照石蜡切片的染色继续染色。通常 冰冻切片组织是不需要固定的，所以不需要抗原修复。细胞的免疫组化(1) 固定：在细胞玻片上种上细胞，或涂片，用PBS清洗，用冷甲醇、丙酮 固定110 min，或含3-4%多聚甲醛pH 7.4的PBS室温固定15分钟，再用 冷 PBS 冲洗样品 2 次；(2) 通透：若目标蛋白在细胞内表达，则通透是至关重要的一步。将样品在含0.25% Triton X-100 的 PBS 中孵育10 分钟(目标蛋白为膜蛋白时不适用，因 为Triton X-100对细胞膜有损坏作用)，PBS冲洗细胞3*5分钟；(3) 封闭及孵育：细胞在含1% BSA的PBST中孵育30分钟，去封闭液，用 含1% BSA的PBST稀释的一抗在湿盒中室温孵育1小时或4*过夜；弃一 抗，用PBS洗3*5分钟，用含1% BSA的PBST稀释的二抗室温孵育1小时(避光)；去二抗溶液，用 PBS 洗 3*5 分钟；(4) 复染：DAPI (染细胞核)孵育细胞1分钟，PBS冲洗；(5) 封固：在玻片上滴加一滴中性树脂封片，变干后显微镜下观察，于-20* 或 4*避光保存(封闭好的切片于显微镜下观察常会出现下述问题：无染色、高背景和非特异性染色，解决方法可见后续常见问题解答部分）。免疫组化的关键环节 标本固定：固定的目的是：防止标本从玻片上脱落；除去防碍抗原-抗体结合的 类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；固定的标本易于保存。固 定剂的选择一般用 4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用 BouinS 液或 mDF 液效果较好。脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完 全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20 min，然后立即二甲苯1-3分别10 min （这个时间是由二甲 苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60度3-4 h。水化 用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而 产生非特异性背景着色。抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之 间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原 决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种， 高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（分为：中性的、高 pH 的等）。一般用微波修复中6min*4次，注意微波修复后自然冷却30min左右直 至修复液的温度达室温。细胞通透：这主要是针对细胞免疫组化而言，目的是使抗体能够充分地进入胞 内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质 进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进 入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（10um厚切片）和免疫细胞化学中 一般用 Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂， 一 般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切 片 4um 左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应 结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等 进行灭活。灭活内源性 POD 一般 3%过氧化氢灭活时间短点，可以 10 min 左 右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般1030 min；用甲醇配置 过氧化氢比双蒸水或 PBS 可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时 间过长易引起脱片；现用现配，配好后 4 度避光保存。血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果 的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先 能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清 等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min，但也要防止封闭过度。一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵 育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、 37度，其中4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h,而4度 过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件： 二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作 液，若是浓缩液还要摸索浓度。一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去 摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4度最佳，反应温和，但时间最好 超过 1624h。抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀 释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体 的多次回收利用较好。建议用专用抗体稀释液，但是使用前需要鉴定稀释的 pH 等，应与抗体相匹配。切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异 性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗 孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意： 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。建议用浸 洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。注意PBS的pH 和离子强度的使用和要求，建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱碱性 条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子 强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色 较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出 现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要 下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深， 还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间 很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过 低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜） ；另一方面就是封闭时间过长。复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素 复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗 原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋 白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是： 染色深则分化时间 稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返 兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作 要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。封片：为了长期保存，一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在 载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角， 而另一手拿对面的 那个拐角， 接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液 体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。免疫组化常见问题石蜡切片和冰冻切片的比较？（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为制作石蜡切片时要高温烤 片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片； 但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不 需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原 弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上 都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者 都可，那就都能做。（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰 冻切片比较麻烦，一定要存在-80 度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的 切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形 态都较冰冻切片好。一抗的选择要点和技巧是什么？（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗 体。单克隆抗体目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命 中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种 克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗 体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，灵敏度相对就低；而 多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染 色（可以通过封闭等避免）。（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于 Western blotting ，或免疫组化、免 疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。（3）种属反应性的选择（ species reactivity ）。这一点很重要，表明这种抗体 可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。（4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有 另外。根据此来源来选择相应的二抗。（5）生产厂家的选择。不同厂商的抗体有专门的应用领域，可以查看该产品引 用文献的情况来判断。免疫组化结果如何分析？（1）阳性着色细胞计数法。在40X光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人 工或机器计数阳性着色细胞，每组 36 张不同动物组织切片，然后进行组间比 较即可。（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相 同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03 分为阴性 着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（ 14 分为 025%、 2650%、5175%、76100%），最终可以分数相加，再进行比较。要想得到正 确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。如何才能充分脱蜡？（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均 匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题， 切 片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力 强，脱蜡时间较短；（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天， 室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5 分钟就足够。如果在冬 天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20 分钟或更长。（3）当天切的切片，烧烤 2 小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加 速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温 10-20 分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果或许更好。总之，操作时 应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是 要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。如何最大限度地降低组织非特异性染色？（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，有条件可以换用单克隆抗体。（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的 组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭 时间和适当增加浓度来加强封闭效果；（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；（6）适当增加 PBS 冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗 尤为重要；（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。脱片产生的原因和如何防止脱片？（ 1 ）多聚赖氨酸玻片质量的问题，尽量选择可靠的供应商。（ 2 ）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀， 或者切片者手法不好等。（ 3 ）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易 脱。（4）没烤好，时间短温度不够之类。（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸 从边缘上慢慢吸水。（6）修复的问题： 抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进 100 度的修复 液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片，应该轻拿轻放。此 外，用 EDTA 修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到 EDTA 的时候也没办法， 只有从另外的问题上着手。（7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用 PBS 的时候尽量用 泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以 减少很多。背景染色较深的原因有哪些？ （1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用 新抗体前应当对其工作浓度进行测试， 使每一抗体个体化， 找到适合自己实 验室的理想工作浓度， 既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书 进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随 身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的 二步法（ Polymer ）敏感很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而 是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）DAB 变质和显色时间太长： DAB 最好现用现配，如有沉渣应进行过滤 后再用。配制好的 DAB 不应存放时间太长， 因为在没有酶的情况下， 过氧 化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好 在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时 或用染色机时， 这样做似乎不现实， 但至少应对一些新的或少用的抗体显色 时进行监控，避免显色时间过长。（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘 记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也 能提高操作速度。（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于 24 小时）：原因上不清 楚， 但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复， 第二天加抗体 进行免疫组化染色， 如果将装有切片和修复液的容器放在 4oC 冰箱过夜， 对 结果无明显影响， 如果放在室温， 特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因 此，不可存放时间太长。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不 显色要麽背景着色。用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比 较。