SOD和POD酶活性的变化.ppt

实验一、超氧化物岐化酶（SOD）对逆境的响应,一、目的和要求 植物在生命过程中不断产生活性氧，但同时又形成了一个完善的清除活性氧的防御系统，即酶促系统与非酶促系统，使植物体内活性氧的产生与清除之间维持在一个动态平衡状态。当植物受到胁迫时，这种平衡将可能被破坏，随着胁迫时间的延长和胁迫程度的加重，活性氧清除系统的功能逐渐降低，活性氧积累得越来越多，最终使细胞膜发生膜质过氧化并发生自由基链式反应，形成丙二醛（MDA），使细胞膜流动性下降，膜功能受到伤害。活性氧酶促清除系统主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（AsAPOD）等，这些酶活性的高低可在不同程度上反应植物抗性的强弱。本试验通过测定正常生长与逆境下植株超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶(POD)活性，了解逆境下SOD和POD酶响应的机制。,二、测定方法 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） 【实验原理】 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2. ，当加入氮蓝四唑(NBT) 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。,三、试剂 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液:0.2mol/LNa2HPO4溶液（mL）； B母液:0.2mol/LNaH2PO4溶液（mL）； 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：91.5A: 8.5B，稀释,2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取0.217g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。 4. 60M核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.055g NBT用PBS定容至3ml（直接用5 ml枪加，不用定容），避光保存。,【实验步骤】 1. 酶液提取 称取0.1g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为SOD粗提液。,2. 酶活性测定 （1）反应混合液配制(以30个样为准)：分别取配好的Met溶液81ml，EDTA-Na2溶液3ml， NBT溶液3ml，核黄素溶液3ml，混合后充分摇匀，放入棕色瓶中，存于冰箱中备用。 （2）分别取3ml反应混合液和100l（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和100l PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和100l PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25下反应20min； （4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）,3. 计算结果 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活单位（U），按下式计算活性 SOD总活性 ( Ack-AE )V/（1/2AckWVt） SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。,【注意事项】 1. 酶液提取须在4下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降； 2. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。 3. 加反应液时最好在暗光下进行；,4. 核黄素产生O2. ，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40molm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）； 5. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50的酶量为一个SOD酶活性单位。） （反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。） 6. 测定数值应在0.30.8之间。,愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定 -愈创木酚法 【实验原理】 在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。,【试剂】 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制： A母液:0.2mol/LNa2HPO4溶液250mL； B母液:0.2mol/LNaH2PO4溶液250mL； 分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100ml PBS(0.2M，pH6.0)； 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：91.5A母液: 8.5B母液，稀释,【实验步骤】 1. 酶液提取 ：称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分两次加入1.6ml （0.8 ml、0.8 ml）0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心15min，上清液即为POD粗提液。 2. 酶活性测定 （1）反应混合液的配制：取100mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入0.037ml愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入0.056ml30的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。 （2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40l酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，,3. 计算结果 以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。按下式计算活性 POD活性=（A470Vt）/（WVs0.01t） (u/g FW) A470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。,【注意事项】 1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。 2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。,三、作业 比较不同处理下叶片SOD和POD酶活性的变化 并分析其原因。,实验二、主要果树和蔬菜作物产品器官的识别与 品质指标测定 一、目的和要求 园艺作物产品器官通常是指作为商品收获的植物器官。除了特殊需求，对于果树作物，产品器官为可供食用的果实或种子；对于蔬菜作物，产品器官可以是花、果实、种子等生殖器官，也可以是根、茎、叶等营养器官及其变态类型；而花卉的产品器官则是可供欣赏的花、茎、叶和果等。本实验通过对主要果树和蔬菜作物产品的观察，了解主要蔬菜作物产品器官的形态特征、内部构造和风味特点，能够通过产品器官特征区分不同种类的果树和蔬菜作物。,二、材料和用具 1材料 果树作物产品器官：苹果、枇杷、桃、荔枝等； 蔬菜作物产品器官：甜瓜、樱桃番茄、黄瓜等。 2用具 天平、水果刀、砧板、糖度计、硬度计、放大镜、直尺、绘图纸、铅笔、橡皮等。,三、实验内容 （一）产品器官分类和特征 1果树作物产品器官分类和特征 果实是由果皮和种子构成的。果实根据果皮是否肉质化分为水果和坚果两大类。水果，成熟时果肉肥厚多汁，主要食用部分是果皮。按果肉构造又可分为仁果、核果、浆果、柑果和荔枝果等。坚果成熟时果皮干燥，果皮开裂或不开裂，食用部位是种子。种子外面多具有坚硬外壳。 2蔬菜作物产品器官分类和特征 蔬菜作物按照食用器官可分为根菜类、茎菜类、叶菜类、花菜类和果菜类，各类食用器官在形态结构和食用品质上存在较大的差别。,（二）产品器官特征观察 1作物产品器官特征观察 根据作业中表1的内容要求，对产品器官特征进行观察，并填写表1中内容。,（三）可溶性固型物含量：用糖度计测量 原理：光线从一种介质进入另一种介质时会产生折射现象，且入射角正弦之比恒为定值，此比值称为折光率。果蔬汁液中可溶性固形物含量与折光率在一定条件下（同一温度、压力）成正比例，故测定果蔬汁液的折光率，可求出果蔬汁液的浓度（含糖量的多少）。常用仪器是手持式折光仪，也称糖镜、手持式糖度计，通过测定果蔬可溶性固形物含量（含糖量），可了解果蔬的品质，大约估计果实的成熟度。 使用方法：手持糖度计一般是圆柱形的，将待测的糖液放入后面可打开的槽中，抹均匀，关上盖子，然后将糖度计对着光，从前面的孔中看，就可以读数了。,（四）果肉硬度：用硬度计测量 水果硬度计（又称果实硬度计或果品硬度计），用来测量苹果、梨、西瓜、香蕉等多种水果的硬度，用以判定水果的成熟程度，对培育良种，采摘时间，加工时间，收获储存，出口运输等采摘的合理掌握。 设计原理：果实硬度是指水果单位面积（S）承受测力弹簧的压力（N），它们的比值定义为果实硬度（P）。 使用方法：测量前转动表盘，使驱动指针与表盘的第一条刻度线对齐（GY-1型的为刻度线2，GY-2和GY-3型的为刻度线0.5）；将待测水果削去1平方厘米左右的皮。用手握硬度计，使硬度计垂直于被测水果表面，压头均匀压入水果内，此时驱动指针开始驱动指示指针旋转，当压头压到刻度线（10毫米）处停止，指示指针指示的读数即为水果的硬度，取三次平均值。测量后旋转回零旋钮，使指针复位到初始刻度线。,（五）果形指数 是指果实纵径与横径的比值。以苹果为例，通常果形指数是0809为圆形或近圆形，0806为扁圆形，0910为椭圆形或圆锥形，10以上为长圆形。 表1产品器官基本特征,