分子生物学实验

枯草芽孢杆菌发酵生产淀粉酶一、 实验目的了解枯草芽孢杆菌发酵的基本过程二、 实验原理淀粉酶是一类用途十分广泛的酶,粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业都经常使用。淀粉酶(EC3。2。1）作用淀粉时可从分子内部切开-1,4-糖苷键而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为-构型，故称-淀粉酶.淀粉酶的分子量范围是1501300,通常为450-60000，可分为耐热、耐酸、耐碱和耐盐酶。淀粉酶可由微生物发酵产生,也可从植物和动物细胞中提取,目前工业上都以微生物发酵法进行大规模生产淀粉酶.三、 实验材料和方法1、 菌种枯草芽孢杆菌（Bacilus utlis）2、 种子培养基牛肉膏 1；蛋白胨 ;Nacl 1；pH7.3、 发酵培养基可溶性淀粉 10；（NH4）2S4 2;KH2PO4 57;KHO4 1。7;p 7。0-724、 仪器设备超净工作台、摇床、培养箱、紫外可见分光光度计等。四、 实验步骤（一） 种子培养将冰箱中保存的斜面菌种在30恒温培养箱中活化3,取一环接种至摇瓶中，30下置于摇床中培养1618，即得新鲜种子液。（二） 摇瓶发酵培养00m摇瓶中装有50mL已灭菌的发酵培养基，用无菌的移液管吸取5种子液接入摇瓶，在摇床中与0和20rin条件下培养48h。结束时将培养液离心，收集上清液放入冰箱中冷藏保存,集中测定淀粉酶的酶活大小.五、 实验结果测发酵结束时的细胞生物量和值.此次实验未进行测量.硫酸铵沉淀法分离纯化（透析）-淀粉酶一、 目的和要求1、 了解保有蛋白质活性的浓缩方法。2、 掌握硫酸铵沉淀法浓缩-淀粉酶的方法.二、 实验原理当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。这一技术称为“盐析”.不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀,所以盐析常用于蛋白质的分离纯化.几种因素如pH、温度、蛋白质纯度在测定各种蛋白质的盐析点时起着重要作用。选择硫酸铵是因为它具有一些优良性质，如盐析的有效性、pH范围广、溶解度高、溶解散热少和经济适用.硫酸铵浓度常以百分浓度表示。以X表示所要配制的溶液浓度，表示开始的溶液浓度,所需要的硫酸铵克数按以下公式计算：=51（X）/（107X）(0时1L溶液，用量见附录)大多数蛋白质在5%硫酸铵中沉淀，获得最大量蛋白质沉淀是85%硫酸铵溶液，以不含硫酸铵的100L蛋白质溶液为起始溶液，按以下操作步骤进行盐析.三、 步骤操作（1） 将盛有蛋白质溶液的烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，并置于磁力搅拌器上搅拌；（2） 边搅拌,边徐徐加入8.4g硫酸铵至饱和,该步骤应该在510min内完成；（3） 继续搅拌30n；（4） 1000xg离心10min或300xg离心30in;（5） 弃去上清液，将沉淀悬浮于倍沉淀物体积的缓冲液中，残留的不溶性物质可能是变性蛋白，通过离心除去；（6） 硫酸铵能够通过透析、超滤或脱盐柱除去;（7） 得到纯化后的淀粉酶，溶于20mL缓冲溶液;（8） 紫外分光光度计测定淀粉酶的浓度；（9） 测定淀粉酶的活性，与原酶液的活性进行比较。透析实验一 透析的原理透析是指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程，任何天然的（如腹膜）或人造的半透膜，只要该膜含有使一定大小的溶质通过的孔径，那么这些溶质就可以通过弥散和对流从膜的一侧移动到膜的另一侧。人体内的毒物包括代谢产物，药物，外源性毒物，只要其原子量或分子量大小合适，就能够通过透析清除体外。其基本原理是弥散和对流.弥散就是半透膜两侧液体各自所含溶质浓度梯度及它所形成的不同渗透浓度，溶质从浓度高的一侧通过半透膜向浓度低的一侧移动。对流也称超滤，是指溶质和溶剂因透析膜两侧的静水压和渗透压梯度的不同而跨膜转运的过程。二 透析袋的使用方法（一） 透析袋（前处理方法如下）:1. 把透析袋剪成适当长度(1-cm）的小段。2. 在大体积的2(W/）碳酸氢钠和0mmo/L DTA(h8。）中将透析袋煮沸10分钟。3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。4. 放在1mmol/LEDTA(ph8。0）中将之煮沸10分钟.5. 冷却后，存放于四度,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套。（二） 透析除盐1. 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析,即将蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸)，用缓冲溶液进行透析，并不断的更换缓冲溶液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。2. 0.02oLP7.PBS溶解蛋白质沉淀至m装入透析袋.3. C下，对P充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无N4+为止.4. 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以71型紫外分光光度计测定蛋白质含量.方法如下：蛋白质含量（mg/l）=1.4OD280m-0.4OD60)样品稀释度。四、 仪器（1） 烧杯（2） 磁力搅拌器和搅拌子（3） 离心机和转头五、 试剂（1） 硫酸铵（2） 用于悬浮沉淀物的缓冲液六、 注意事项（1） 搅拌必须是有规则的和温和的.搅拌太快将引起蛋白质变性，其变性特征是起泡.用磁力搅拌器不明显产热,这一点也很重要。（2） 大多数蛋白质在盐溶解后的前20min沉淀,一些蛋白质要经数小时才能完全沉淀。（3） 为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉淀反应至少在50mml/L缓冲液中进行。（4） 缓冲液应该含有螯合剂如ETA以除去硫酸铵中微量的重金属离子，因为这些离子对目的蛋白质是有害的。（5） 为确保获得最大量沉淀，使用蛋白质初始浓度至少为g/L。（6） 硫酸铵沉淀反应通常是贮存和稳定蛋白质的良好方法.（7） 少数蛋白质在硫酸铵浓度低于24%时就产生沉淀，而大多数要在80%以上才能沉淀。在纯化的初始阶段，常利用蛋白质在硫酸铵中溶解度的差异分离蛋白质。硫酸铵沉淀可除去RNA和NA。（8） 在蛋白质的等电点其溶解度降低,在此条件下，静电的相互作用可导致蛋白质凝集和沉淀，在蛋白质的等电点，低浓度的硫酸铵就能沉淀蛋白质.（9） 在蛋白质结晶实验中，采用硫酸铵沉淀十分有效。七实验结果与分析 酶活力测定中吸光度的9组测量结果硫酸铵沉淀法测 酶活 OD6平均值空白。42048.4300。424空白20。4740.46430471空白3。490。4970.5050.910760。48004880.410900010.95。93.4564460。4490。45040。504910。480。4870.2.460.400。4360.4770。40466。47270。4604700476.4700500.500.4450。44890750。4810。48。7酶浓度-组测定结果编号浓度 gmlA8013.442。3.4833028037840.290。4105。16023960。42107.16.244800044290.21.24所以本组（7）的酶活力测定结果为1，酶浓度为06 mg/ml常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜.硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来.对酶没有破坏作用。 pH的控制:应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑,在酶等电点时其溶解度最小易沉淀,但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值。一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的H值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的H值，要尽量避免溶液H值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入,硫酸铵尽可能磨成细粉。 温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。 有机溶剂沉淀法分离纯化-淀粉酶一、 目的和要求1、 了解保有蛋白质活性的浓缩方法.2、 掌握有机溶剂沉淀法浓缩-淀粉酶的方法.二、 实验原理将有机溶剂例如丙酮和乙醇加入蛋白质溶液时,和高浓度盐类似产生沉淀,这是因为它们能够降低蛋白质的溶解度.在温度为10左右时蛋白质在有机溶剂中容易变性，所以在沉淀时必须特别注意冷却溶液和离心转头（04为佳）。有机溶剂的浓度按体积百分数计算，累加体积并不精确。例如用简便的方法将100m水溶液要配置成5%（v/v）乙醇溶液,就是向100mL水溶液加00L乙醇溶液。尽管最后总体积是19L.大多数蛋白质的分子量大于15kD，一般用50%有机溶剂进行沉淀。三、 仪器（1） 烧杯（2） 磁力搅拌器和搅拌子（3） 离心机和转头四、 试剂（1） 无水乙醇（2） 再悬浮沉淀的缓冲液五、 操作步骤（1） 在4下，向50mL蛋白质溶液中缓缓加入50m丙酮或乙醇(冷却至-20）,在冰水浴上持续温和的搅拌；（2） 在冰水上持续搅拌15min；（3） 低温离心1000gin；（4） 除去上清液；（5） 用沉淀的2倍体积的冷缓冲液再使沉淀悬浮.实际上变性蛋白质难于溶解，可用过滤或离心的方法除去；（6） 得到纯化后的-淀粉酶，溶于20mL缓冲溶液。（7） 紫外分光光度计测定-淀粉酶的浓度,与原酶液的浓度进行比较。（8） 测定淀粉酶的活性，与原酶液的活性进行比较.六、 注意事项（1） 酸性蛋白质在二价阳离子例如M2存在下,以复合物的形式较易被沉淀。（2） 大分子的蛋白质及亲水的蛋白质往往在较低浓度的有机溶剂中就能析出。（3） 在溶液pH值接近蛋白质的等电点时，蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。七实验结果酶活力测定中吸光度的19组测量结果有机溶剂沉淀 酶活 O660平均值空白1。12 2 1.011019 空白. 102 1.083 .083沉淀0。449 。4600458.450。13 0.45 0.43 0。414 20 0。3140.30 0316 3.466 046 0.4670。4644 0.85 040.48 5021 。26025 0.960490 0.92 0.488 0.9 70.56 0。525 1 .51980.433 0。438 434.435 90。4960。492 0.95 .494 酶浓度19组测定结果编号浓度mg/A2800.120。7。060.130.030064.210.350。110.9660.0500917.6.08180。10.189040089所以本组（7)的酶活力测定结果为0。14,酶浓度为0.06 mg/ml有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等,如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。 有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性,当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活.因此用有机溶剂处理时最好在0以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。文中如有不足，请您指教！11 / 11