体外放射配基结合分析及临床应用

体外放射配基结合分析及临床应用卢汉平中山大学基础医学院实验核医学教研室E-mail:受体放射配基结合分析受体放射配基结合分析Radioligand Binding Assay of Receptor,RBA 用放射性核素标记配基与相应的受体行特异性结合反应从而对受体进行定性和定量的方法。分离分离配基受体复合物放射配基放射配基 +受体分子受体分子分析受体数量分析受体数量和亲和力和亲和力RBA的分类n定性定性RBARBA：通过反应的量效关系及某些参：通过反应的量效关系及某些参数的变化等来判断受体的类型、单位点数的变化等来判断受体的类型、单位点或多位点系统、受体与配基相互作用的或多位点系统、受体与配基相互作用的特点特点 (可逆或不可逆，受体间的合作作可逆或不可逆，受体间的合作作用用)。n定量定量RBARBA：在已知反应性质的基础上，通：在已知反应性质的基础上，通过结合反应分析组织或细胞中受体数目过结合反应分析组织或细胞中受体数目（binding site,binding site,结合位点数）。结合位点数）。受体的免疫组织化学Immunohistochemistry优点：优点：n强特异性（单个氨基酸水平）强特异性（单个氨基酸水平）n高敏感性高敏感性n高分辨力高分辨力缺点：缺点：n半定量半定量n无法测定亲和力无法测定亲和力RBA相关的基本慨念n 受体(receptor,R)n 配基(ligand,L)：激动剂、激动剂、内源性配基 受体与配基结合反应的质量作用定律 K K1 1V V1 1 R+L RL E R+L RL E K K2 2V V2 2 KD:KD:平衡解离常数平衡解离常数 RT:RT:受体初始浓度受体初始浓度(总浓度总浓度)LT:LT:配基初始浓度配基初始浓度 RL2-RLRT+LT+Kd+RTLT=0(Goldstein)RLRLLTRLRTKD受体与配基结合反应的主要特点：n可饱和性(Saturability)n可逆性(Reversibility)n特异性(Specifity)n与生理效应一致性。受体的分类受体的分类四级分类：四级分类：n类类(class)n亚类亚类（subclass）n型型(type)n亚型亚型(subtype)受受体体的的类类 单单跨跨膜膜区区段段 单单跨跨膜膜区区段段 G 蛋蛋白白偶偶联联 配配基基门门控控 有有酶酶结结构构 无无酶酶结结构构 7 跨跨膜膜区区段段 离离子子通通道道 配配基基举举例例 生生长长因因子子 细细胞胞因因子子 肽肽类类 神神经经递递质质 胰胰岛岛素素 生生长长激激素素 神神经经递递质质 氨氨基基酸酸 泌泌乳乳素素 前前列列腺腺素素 激激酶酶区区段段 可可溶溶性性激激酶酶 第第二二信信使使 离离子子 结构(示意)膜 膜外 膜内 四大类膜受体示意图四大类膜受体示意图五类受体的名称五类受体的名称1 12 23 34 45 5配基门控离子通道受体配基门控离子通道受体 G G蛋白偶联蛋白偶联7 7次跨膜受体次跨膜受体 有酶结构的单次跨膜受体有酶结构的单次跨膜受体无酶结构的单次跨膜受体无酶结构的单次跨膜受体核受体核受体RBARBA的基本原理基本原理 饱和曲线00.0010.0020.0030.0040.0050.00600.10.20.30.40.50.60.70.8配基浓度(nmol/L)复合物浓度(nmol/L)RT=0.005nmol/LKD=0.05nmol/LKD=0.20nmol/LKD=0.10nmol/L渐近线 R RT T-R RL L L L R RT T-R RL L L LT T-R RL L K KD D =-=-R RL L R RL L S SB B/F F S Sl lo op pe e=-1 1/K Kd d B Bm ma ax x S SB B f fm mo ol l/m ml l S Sc ca at tc ch ha ar rd d 作作 图图受体最大结合容量的表示方式 胞胞浆浆及及胞胞膜膜等等的的受受体体含含量量:f fm mo ol l/m mg g蛋蛋白白 胞胞核核的的受受体体含含量量:f fm mo ol l/m mg gD DN NA A 完完整整细细胞胞受受体体的的含含量量:结结合合位位点点/细细胞胞(s si it te e/c ce el ll l)或或f fm mo ol l/1 10 06 6c ce el ll l RBA的基本方法 制制备备待待测测受受体体的的离离体体标标本本 加加放放射射配配基基温温育育，反反应应达达到到平平衡衡 终终止止反反应应，分分离离结结合合与与游游离离部部分分 测测定定结结合合部部分分的的放放射射性性强强度度 数数据据处处分分理理，求求出出有有关关参参数数 配基的选择n标记配基：高亲和力、高特异性 高比活度 高放化纯度（98%）化学稳定性。n非标记配基 高亲和力 高浓度受体显像配基基本要求n半衰期适中、发射正电子或单光子、半衰期适中、发射正电子或单光子、SASA3.7TBq/mmol3.7TBq/mmoln易穿透生物屏障易穿透生物屏障n代谢行为和作用机制清楚代谢行为和作用机制清楚n特异性高特异性高n亲和力高亲和力高n选择性强选择性强n标记后具完整的生物活性和药理活性标记后具完整的生物活性和药理活性n动态显像时用生理数学模型可作受体密度的模拟定量分析动态显像时用生理数学模型可作受体密度的模拟定量分析受体在医学研究中的应用 疾病时受体的变化：疾病时受体的变化：n受体数目的变化受体数目的变化n受体亲和力的变化受体亲和力的变化n受体特异性的变化受体特异性的变化n受体的自身抗体受体的自身抗体n受体受体-效应器偶联机理异常效应器偶联机理异常受体理论在疾病研究中的应用n探讨疾病的发病机理探讨疾病的发病机理n受体的变化寻找疾病的病因受体的变化寻找疾病的病因n根据受体测定结果选择治疗方案根据受体测定结果选择治疗方案n受体变化作为疾病预后指标受体变化作为疾病预后指标n寻找防治措施寻找防治措施 选择治疗方案选择治疗方案 344344例乳腺癌内分泌治疗效果与、的关系例乳腺癌内分泌治疗效果与、的关系_ 受体状态受体状态 治疗例数治疗例数 有效例数有效例数 有效率有效率%_ER+ER+、PR-91 12 13.2PR-91 12 13.2ER-ER-、PR+10 3 30.0PR+10 3 30.0ER+ER+、PR-125 37 29.6PR-125 37 29.6ER-ER-、PR+118 89 75.4PR+118 89 75.4_ 和与乳腺癌化疗效果的关系和与乳腺癌化疗效果的关系(136(136例例)_受体状态受体状态 治疗例数治疗例数 有效例数有效例数 有效率有效率%_ ER+25 3 12.0 ER+25 3 12.0 PR+8 0 0 PR+8 0 0 ER-45 34 75.6 ER-45 34 75.6 PR-34 22 64.7 PR-34 22 64.7 ER+ER+、PR+24 21 87.5PR+24 21 87.5_ 3232例乳腺癌例乳腺癌ERER状态与激素治疗关系状态与激素治疗关系_cytosol/nuclear cytosol/nuclear 治疗例数治疗例数 反应例数反应例数 无反应例数无反应例数_ 22 18 422 18 4 6 1 56 1 5 3 0 33 0 3 1 0 11 0 1_ 乳腺癌胞浆不同水平与激素治疗的关系乳腺癌胞浆不同水平与激素治疗的关系_ ERER含量含量(fmol/mg.Pro)(fmol/mg.Pro)有效率有效率%_ 100 81100 81 3 3100 45100 45 3 03 0_ 乳腺癌状态与内分泌治疗效果的关系乳腺癌状态与内分泌治疗效果的关系_ 有效例数有效例数/治疗例数治疗例数 药药 物物 -ER+ER-ER+ER-_ Tamoxifen 32/67 1/5 Tamoxifen 32/67 1/5 Nafoxidene 7/10 0/8 Nafoxidene 7/10 0/8 Stilboostrol 9/12 1/17 Stilboostrol 9/12 1/17 Dophrectomy 28/43 2/74 Dophrectomy 28/43 2/74 Adrenalectomy 15/22 1/9 Adrenalectomy 15/22 1/9 Androgens 10/28 2/22 Androgens 10/28 2/22 Glucocorticoids 15/32 0/19 Glucocorticoids 15/32 0/19 Hypophsectomy 9/14 1/12 Hypophsectomy 9/14 1/12-总有效率总有效率 128/235(54.5%)7/176(4%)128/235(54.5%)7/176(4%)_Degenshein根据乳腺癌受体表达情况和癌转移情况，提出如下治疗方案，并得到临床广泛采用 n，腋下淋巴结无转移，手术治疗外可不用内分泌治疗，要作定期复查；n、腋下淋巴结有转移，要加激素治疗或预防性去势n、腋下淋巴结无转移、绝经前患者，术后加化疗n晚期癌或复发癌，内脏无转移者，用激素治疗；内脏有转移者，用激素治疗再加化疗。ER表达与内分泌治疗不相符：n肿瘤异质性n肿瘤组织类固醇代谢酶的灭活作用n受体本身缺陷 n内存激素变化的影响n雌抑素(estrocolyone)失活 n 受体阳性的标准不准确和不一致 n检测受体的标本的不均一性和代表性。n肿瘤的病因的复杂性或多元神经系统疾病与受体 帕金森氏病 亨廷顿氏病 癫痫 忧郁 精神分裂症帕金森氏病 帕金森氏病患者脑中受体的变化帕金森氏病患者脑中受体的变化 受体的种类 纹状体 黑质 多巴胺D1受体 多巴胺D2受体 未治疗例 左旋多巴治疗 mACh受体 5-HT受体 GABA受体 脑啡肽受体 （只有被壳）阿片(纳洛酮)受体 神经加压索受体 亨廷顿氏病 亨廷顿氏病患者死后脑中受体的变化 大脑皮质 尾状核 被壳 苍白球 黑质GABA-R BDZ-R /DA-R D1-R D2-R mACh-R Glu-R ：明显减少，：减少，：不变，：增加GABA-R=-氨基丁酸受体，BDZ-R=苯二氯卓受体，DA-R多巴胺受体，D1D1受体，D2D2受体，mACh-R蕈毒碱样乙酰胆碱受体，Glu-R谷氨酸受体癫痫癫痫患者的病灶组织、脊髓液中神经递质及受体的变化 病灶组织 脊髓液 多巴胺(DA)高香草酸(HVA)去甲肾上腺素(NA)神 3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)5-羟基吲哚醋酸(5-HIAA)经 乙酰胆碱(Ach)y-氨基丁酸(GABA)递 谷氨酸脱羧酶(GAD)GABA转氨酶 质 牛磺酸 甘氨酸 生长激素抑制素 3HGABA受体 受 1-肾上腺素受体 体 苯二氮卓受体 PET研究 苯二氮卓受体 ：减少，：增加，：不变。PET电子发射断层扫描忧郁 去甲肾上腺素受体 5-羟色胺受体AChR 1 2 5-HT1 5-HT2 mACh三环类抗忧郁药 非三环类抗忧郁药 单 胺 氧 化 酶 抑 制 剂(MA()I)电抽搐疗法 Ach-R：乙酰胆碱受体；mACh：毒蕈碱样乙酰胆碱 慢性或反复处理 通过忧郁病治疗脑内各种受体的变化丙咪嗪结合部位精神分裂症精神分裂症 精神分裂症患者死后脑内多巴胺受体的变化精神分裂症患者死后脑内多巴胺受体的变化 配体配体 配体浓度配体浓度 脑部位脑部位 症例数症例数 置换浓度置换浓度 结果结果 3 3H-H-螺环螺环 O.8nM O.8nM 尾状核尾状核 19 19 丁克吗丁克吗 哌丁苯哌丁苯 (其中不服药其中不服药5)(1uM)5)(1uM)被壳被壳 侧坐核侧坐核 O.5nM O.5nM 侧坐核侧坐核 26 ADTN26 ADTN*(10uM)(10uM)肉桂硫胺肉桂硫胺 (1uM)(1uM)O.5nM O.5nM 尾状核尾状核 服药服药21 21 丁克吗丁克吗 BmaxBmax，Kd Kd 不服药不服药7 (1uM)Bmax7 (1uM)Bmax，KdKd 侧坐核侧坐核 服药服药13 ADTN Bmax13 ADTN Bmax，KdKd 不服药不服药4 (10uM)Bmax4 (10uM)Bmax，KdKd 尾状核尾状核 服药服药12 12 丁克吗丁克吗 BmaxBmax，Kd Kd 不服药不服药4 (1uM)Bmax4 (1uM)Bmax，KdKd 侧坐核侧坐核 服药服药9 ADTN Bmax9 ADTN Bmax，KdKd 不服药不服药13 (10uM)Bmax13 (10uM)Bmax，KdKd 精神分裂症患者死后脑内多巴胺受体的变化精神分裂症患者死后脑内多巴胺受体的变化 配体配体 配体浓度配体浓度 脑部位脑部位 症例数症例数 置换浓度置换浓度 结果结果 0.1nM 0.1nM 尾状核尾状核 11 11 丁克吗丁克吗 被壳被壳 (1uM)Bmax(1uM)Bmax，Kd Kd 颞皮质颞皮质 O.1nM O.1nM 尾状核尾状核 6 6 丁克吗丁克吗 被壳被壳 5 (1uM)Bmax5 (1uM)Bmax，Kd Kd 前部扣带圆前部扣带圆 6 6 1nM 1nM 尾状核尾状核 9 9 丁克吗丁克吗 被壳被壳 (1uM)(1uM)1nM 1nM 尾状核尾状核 27 27 丁克吗丁克吗 被壳被壳 37 (1uM)Bmax37 (1uM)Bmax，KdKd 3 3HH氟哌氟哌 1.7nM 1.7nM 尾状核尾状核 18 18 丁克吗丁克吗 啶醇啶醇 被壳被壳 (100nM)(100nM)2nM 2nM 尾状核尾状核 29 29 丁克吗丁克吗 被壳被壳 (100nM)(100nM)3 3H-H-阿朴阿朴 3.2nM 3.2nM 尾状核尾状核 7 7 丁克吗丁克吗 被壳被壳 (1uM)(1uM)侧坐核侧坐核 3 3 颞皮质颞皮质 ADTN ADTN2-2-氨氨-6,7-6,7-二羟基二羟基-1,2,3,4-1,2,3,4-四氢萘四氢萘PET脑受体研究n多巴胺受体多巴胺受体 11C-N-甲基螺环哌丁苯、甲基螺环哌丁苯、11C-Nomifensine、11C-SCH23390n5-HT受体受体 11C-氟哌喹氟哌喹11C-5羟色胺酸羟色胺酸n阿片受体阿片受体 11C-carfentanil、11C-环丙羟丙吗啡环丙羟丙吗啡n苯二氮卓受体苯二氮卓受体 11C-Ro15-1788、11C-哌硫吡酮哌硫吡酮n载体负荷实验与定量解载体负荷实验与定量解RBA的应用和前景n 阐明药物和激素递质的作用机制阐明药物和激素递质的作用机制n 讨疾病的病因和发病机理讨疾病的病因和发病机理n 新药设计和药物筛选新药设计和药物筛选n 定组织或血液中药物浓度定组织或血液中药物浓度n 受体显像与受体介导治疗受体显像与受体介导治疗