疫上岗培训ppt课件

免疫检验上岗培训免疫检验上岗培训泸西县人民医院检验科免疫组泸西县人民医院检验科免疫组 徐天云徐天云2021.1.5一、免疫一、免疫ImmuneImmune的定义的定义n免疫的最初概念：免除瘟疫免疫的最初概念：免除瘟疫n免疫的传统概念：抗感染免疫免疫的传统概念：抗感染免疫n现代免疫的概念：是机体识别现代免疫的概念：是机体识别“本身与本身与“非己抗原，对非己抗原，对“非己抗原产生排斥作非己抗原产生排斥作用，对本身抗原构成天然耐受的一种生理功用，对本身抗原构成天然耐受的一种生理功能。能。n 免疫的根本概念免疫的根本概念 正常情况下，这种生理功能对机体有益，正常情况下，这种生理功能对机体有益，可产生抗感染、抗肿瘤和维持机体生理平衡可产生抗感染、抗肿瘤和维持机体生理平衡及稳定的维护作用。及稳定的维护作用。当免疫功能失调时，在一定条件下，也当免疫功能失调时，在一定条件下，也会对机体产生不利的影响，如：超敏反响、会对机体产生不利的影响，如：超敏反响、本身免疫病和肿瘤等。本身免疫病和肿瘤等。二、免二、免 疫疫 的的 功功 能能 免疫功能是免疫系统在识别和去除免疫功能是免疫系统在识别和去除“非己抗原的非己抗原的过程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括：过程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括：1.1.免疫防御免疫防御Immunologic defence)Immunologic defence)：是机体针对外来病原体的抗感染功能。正常时是机体针对外来病原体的抗感染功能。正常时可防御病原体的感染；防御功能过强可产生超敏反可防御病原体的感染；防御功能过强可产生超敏反响，过弱那么表现为免疫缺陷。响，过弱那么表现为免疫缺陷。2.2.免疫自稳免疫自稳(immunologic homeostasis)(immunologic homeostasis)：免疫系统维持机体内环境相对稳定的免疫系统维持机体内环境相对稳定的生理机能。生理机能。正常：可及时去除体内损伤、衰老、变性的细正常：可及时去除体内损伤、衰老、变性的细胞和抗原抗体复合物，而对本身成胞和抗原抗体复合物，而对本身成份坚持免疫耐受；份坚持免疫耐受；异常：可发生生理功能紊乱、本身免疫病等。异常：可发生生理功能紊乱、本身免疫病等。3.3.免疫监视免疫监视(immunologic surveillance)(immunologic surveillance)：是机体免疫系统识别、去除体内突变、畸是机体免疫系统识别、去除体内突变、畸变细胞以及被病毒感染细胞的生理性维护作用。变细胞以及被病毒感染细胞的生理性维护作用。丧失：机体突变细胞失控，能够导致肿瘤丧失：机体突变细胞失控，能够导致肿瘤发生或出现病毒的继续感染。发生或出现病毒的继续感染。三、免疫的类型及其特征三、免疫的类型及其特征一、固有免疫：一、固有免疫：概念：出生时即有的天然免疫，经遗传获得，概念：出生时即有的天然免疫，经遗传获得，非特非特 异性，也称非特异性异性，也称非特异性/先天性免疫。先天性免疫。组成：屏障构造、吞噬细胞、某些体液因子。组成：屏障构造、吞噬细胞、某些体液因子。二、顺应性免疫：二、顺应性免疫：概念：出生后接触特定抗原获得的针对该物概念：出生后接触特定抗原获得的针对该物质质 的免疫，也称获得性的免疫，也称获得性/特异性免疫。特异性免疫。包括包括 体液免疫、细胞免疫。体液免疫、细胞免疫。抗原根底知识抗原根底知识 一、抗原概念一、抗原概念antigenantigen，AgAg 是能刺激机体免疫系是能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应对、统产生特异性免疫应对、并能与相应的应对产物并能与相应的应对产物抗体和抗体和/或效应淋巴细胞或效应淋巴细胞在体内或体外发生特异性在体内或体外发生特异性结合的物质。结合的物质。二、抗原的特性二、抗原的特性 1 1 免疫原性：免疫原性：抗原能刺激特异性免疫抗原能刺激特异性免疫细胞，使之活化、增生、分化，最终产细胞，使之活化、增生、分化，最终产生抗体和效应淋巴细胞的特性。生抗体和效应淋巴细胞的特性。2 2 免疫反响性免疫反响性:抗原可在体内、外与抗原可在体内、外与 相应的抗体相应的抗体/效应淋巴细胞发生特异性结效应淋巴细胞发生特异性结合，产生免疫反响的特性。合，产生免疫反响的特性。三、完全抗原、半抗原、载体三、完全抗原、半抗原、载体1 1、完全抗原、完全抗原 complete antigen):complete antigen):既既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。白质分子。2 2、半抗原、半抗原Hapten):Hapten):又称不完全抗原，又称不完全抗原，单独存在时只具有免疫反响性而无免疫原单独存在时只具有免疫反响性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。性的物质，如二硝基酚、青霉素。3 3、载体、载体 与半抗原结合后使其具有免疫原与半抗原结合后使其具有免疫原性的物质，即半抗原性的物质，即半抗原+载体载体=完全抗原。完全抗原。四、四、耐受原与变应原耐受原与变应原 1 1 耐受原耐受原 (tolerogen):(tolerogen):引起机体引起机体产生免疫耐受的抗原。产生免疫耐受的抗原。2 2 变应原变应原 (allergen):(allergen):引起机体引起机体产生变态反响的抗原。产生变态反响的抗原。五、五、抗原的特异性与交叉反响抗原的特异性与交叉反响 免疫原性的特异性：某种抗原只能刺激机免疫原性的特异性：某种抗原只能刺激机体产生某种特定的应对产物。体产生某种特定的应对产物。如：伤寒杆菌免疫动物产生抗伤寒杆菌抗体如：伤寒杆菌免疫动物产生抗伤寒杆菌抗体 抗原性的特异性：抗原只能与其相应的抗抗原性的特异性：抗原只能与其相应的抗体或致敏淋巴细胞结合。体或致敏淋巴细胞结合。如：伤寒杆菌只能与抗伤寒杆菌抗体结合如：伤寒杆菌只能与抗伤寒杆菌抗体结合 1 1、表位与抗原决议簇表位与抗原决议簇 抗原决议簇抗原决议簇antigenic antigenic determinant,ADdeterminant,AD:又称表位又称表位epitopeepitope，指抗原分子中决议，指抗原分子中决议 抗原特异性的特殊的化学基团，是抗原分子与抗原特异性的特殊的化学基团，是抗原分子与抗体及抗体及TCR/BCRTCR/BCR受体特异结合的部位，也是被受体特异结合的部位，也是被免疫细胞识别的标志及免疫反响具有特异性的免疫细胞识别的标志及免疫反响具有特异性的物质根底。物质根底。表位的性质、数目和空间构象决议了抗原表位的性质、数目和空间构象决议了抗原 的特异性。的特异性。2 2、抗原抗体反响的特异性、抗原抗体反响的特异性 抗原的特异性是相对的，由于天然的抗原的特异性是相对的，由于天然的抗原分子外表可存在着多种表位，不同的抗原分子外表可存在着多种表位，不同的抗原分子外表存在一样或类似的表位，可抗原分子外表存在一样或类似的表位，可引起交叉反响。引起交叉反响。3 3、抗原结合价：、抗原结合价：能和相应抗体结合的功能性表位的数目能和相应抗体结合的功能性表位的数目 半抗原半抗原 单价单价 天然抗原天然抗原 多价多价 多价抗原可同时与多种多价抗原可同时与多种/多个抗体结合多个抗体结合4 4、共同抗原和交叉反响共同抗原和交叉反响 1 1共同抗原：两种或两种以上抗原共同抗原：两种或两种以上抗原具有的一样或类似的表位。具有的一样或类似的表位。表位表位1 表位表位2表位表位3表位表位1 A抗原B抗原 2交叉反响：抗体与具有一样或类交叉反响：抗体与具有一样或类似的表位的似的表位的抗原之间出现的反响。抗原之间出现的反响。血血 清清(Ab1、Ab2)+AgA 特异特异性反响性反响 Ab1+AgB 交叉反响交叉反响 意义意义 与疾病发生有关：如急性肾小球与疾病发生有关：如急性肾小球肾炎肾炎 用于疾病诊断：如外斐反响用于疾病诊断：如外斐反响表位表位1表位表位3表位表位1A抗原 B抗原表位表位21 1、病原微生物及其代谢产物、病原微生物及其代谢产物1 1病原微生物病原微生物 如细菌、病毒、螺旋体，如细菌、病毒、螺旋体，对机体有较强的免疫原性。对机体有较强的免疫原性。2 2细菌的代谢产物细菌的代谢产物 外毒素：外毒素：类毒素类毒素:外毒素经外毒素经0.3%-0.4%0.3%-0.4%的甲醛处置的甲醛处置后后,使其失去毒性而保管免疫原性的物质。使其失去毒性而保管免疫原性的物质。六、六、医学上重要的抗原医学上重要的抗原2 2、动物免疫血清、动物免疫血清 用类毒素免疫动物后，动物的血清中用类毒素免疫动物后，动物的血清中可含有大量的抗毒素，即动物的免疫血清。可含有大量的抗毒素，即动物的免疫血清。这种抗血清对人体而言既提供特异性抗体，这种抗血清对人体而言既提供特异性抗体，又是异种蛋白。又是异种蛋白。3 3、异嗜性抗原、异嗜性抗原 又称又称ForssmanForssman抗原，指一类与种属无抗原，指一类与种属无关，存在于人、动物、植物和微生物之间关，存在于人、动物、植物和微生物之间的共同抗原。如：溶血性链球菌的共同抗原。如：溶血性链球菌/人肾小人肾小球基底膜之间的共同抗原。球基底膜之间的共同抗原。4 4、同种异型抗原、同种异型抗原 同一种属不同个体之间的不同抗同一种属不同个体之间的不同抗原。如人类的原。如人类的ABOABO、RhRh血型抗原、血型抗原、HLAHLA等。等。5 5、本身抗原、本身抗原 隐蔽的本身抗原与本身免疫系统隐蔽的本身抗原与本身免疫系统隔绝的组织遭到外伤等要素而暴露，隔绝的组织遭到外伤等要素而暴露，如：脑组织、精子外伤暴露。被修饰如：脑组织、精子外伤暴露。被修饰的本身抗本来身组织在理化、生物等的本身抗本来身组织在理化、生物等作用下构造发生改动，如：变性的作用下构造发生改动，如：变性的IgGIgG。6 6、肿瘤抗原、肿瘤抗原 肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原Tumor Specific Tumor Specific AntigenAntigen，TSATSA肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原Tumor Tumor Associated AntigenAssociated Antigen，TAATAA7 7、超抗原、超抗原(super antigen,SAg)(super antigen,SAg)只需极低浓度即可激活只需极低浓度即可激活5%-20%T5%-20%T细胞克隆，细胞克隆，产生极强的免疫应对的抗原。产生极强的免疫应对的抗原。8、其他、其他 有丝分裂原：有丝分裂原：植物血凝素、刀豆蛋白植物血凝素、刀豆蛋白A T细胞细胞 细菌脂多糖、葡萄球菌细菌脂多糖、葡萄球菌A蛋白蛋白 B细胞细胞 七七 佐剂佐剂 概念：概念：一类与抗原一同或预一类与抗原一同或预先注入机体，能加强机体对抗原先注入机体，能加强机体对抗原的免疫应对或改动免疫应对类型的免疫应对或改动免疫应对类型的非特异性免疫加强剂。如：羊的非特异性免疫加强剂。如：羊毛脂，石蜡油，内毒素。常见为毛脂，石蜡油，内毒素。常见为福氏佐剂。福氏佐剂。Ab：是由抗原刺激：是由抗原刺激B 淋巴细胞转化为淋巴细胞转化为浆细胞后所产生，并能与相应抗原浆细胞后所产生，并能与相应抗原特异性结合、具有免疫功能的球蛋特异性结合、具有免疫功能的球蛋白，也称为抗体白，也称为抗体antibody,Ab。Ig：把具有抗体活性或化学构造与抗体类：把具有抗体活性或化学构造与抗体类似的球蛋白统称为免疫球蛋白。似的球蛋白统称为免疫球蛋白。Ig与与Ab的关系的关系Ig与与Ab的区别：的区别：Ig是化学构造的概念，是化学构造的概念，Ab 是是生物学功能的概念。一切的生物学功能的概念。一切的Ab都是都是Ig，但，但Ig并并非都有抗体活性。非都有抗体活性。IgAb 二、二、IgIg的根本构造的根本构造1 1、根本构造：由两条一样的重链和两、根本构造：由两条一样的重链和两条一样的轻链经过二硫键衔接而成的条一样的轻链经过二硫键衔接而成的四肽链构造。四肽链构造。抗体的立体模型抗体的立体模型 Ig的根本构造的根本构造2 2、免疫球蛋白的功能区、免疫球蛋白的功能区 VH和和VL：与抗原特异性结合的部位；：与抗原特异性结合的部位；CL和和CH1：某些同种异型：某些同种异型Ig遗传标志；遗传标志；IgG的的CH2、IgM的的CH3：补体补体C1q结合点结合点 激活补体经典激活补体经典途径；途径；CH3/CH4 结合不同细胞外表结合不同细胞外表FcR 不同生不同生物学效应。物学效应。1、IgG血清含量最多；半衰期最长；血清含量最多；半衰期最长；出生后出生后3个月开场所成，个月开场所成，3-5岁接近成人程度；岁接近成人程度；是独一能经过胎盘的是独一能经过胎盘的Ig，发扬自然被动免疫功，发扬自然被动免疫功能；能；具 有 活 化 补 体 经 典 途 径 的 才 干具 有 活 化 补 体 经 典 途 径 的 才 干IgG3IgG1IgG2；具有调理作用、具有调理作用、ADCC作用。作用。是主要的抗感染抗体，具有抗菌、中和病毒和是主要的抗感染抗体，具有抗菌、中和病毒和中和毒素的作用；中和毒素的作用；三五类三五类IgIg的特性和功能的特性和功能2 2、IgMIgM 为五聚体，分子量最大，称为巨球蛋为五聚体，分子量最大，称为巨球蛋白；白；个体发育中最先出现的个体发育中最先出现的IgIg，胚胎晚期，胚胎晚期即能产生，脐带血即能产生，脐带血IgMIgM增高提示胎内感增高提示胎内感染如风疹病毒、巨细胞病毒感染染如风疹病毒、巨细胞病毒感染等；等；抗原刺激机体时，是体内最先产生的抗原刺激机体时，是体内最先产生的IgIg；血清；血清IgMIgM升高阐明有近期感染；升高阐明有近期感染；有强大激活补体才干，在机体免疫防有强大激活补体才干，在机体免疫防御的早期中具有重要作用。御的早期中具有重要作用。3 3、IgAIgA 有单体的血清型和分泌型有单体的血清型和分泌型IgAIgA；分泌型分泌型IgAIgA是机体粘膜部分抗感染免疫的是机体粘膜部分抗感染免疫的重要要素呼吸道和消化道；重要要素呼吸道和消化道；初乳中的初乳中的sIgAsIgA可对婴幼儿发扬自然被动可对婴幼儿发扬自然被动免疫作用。免疫作用。4 4、IgEIgE 属亲细胞抗体，可与肥大细胞、嗜碱性属亲细胞抗体，可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞外表粒细胞外表FcRFcR结合，介导结合，介导I I型超敏反型超敏反响；响；是血清中含量最低的是血清中含量最低的IgIg；主要由呼吸道、胃肠道粘膜固有层的浆主要由呼吸道、胃肠道粘膜固有层的浆细胞产生。细胞产生。5 5、IgDIgD 血清中含量低，其生物学作用尚不清血清中含量低，其生物学作用尚不清楚；楚；SmIgDSmIgD可作为可作为B B细胞分化成熟标志，成细胞分化成熟标志，成熟熟B B细胞同时表达细胞同时表达SmIgMSmIgM和和SmIgDSmIgD。4免疫球蛋白的生物学活免疫球蛋白的生物学活性性(1)(1)特异性结合抗原特异性结合抗原(2)(2)激活补体激活补体 (3)(3)经过与细胞经过与细胞FcRFcR结合发扬生物效应：结合发扬生物效应：(4)(4)选择性传送选择性传送 IgGIgG经过胎盘；经过胎盘；sIgAsIgA穿过粘膜的功能穿过粘膜的功能(5)(5)具有免疫原性具有免疫原性免免疫疫球球蛋蛋白白的的功功能能抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测 抗原抗原-抗体反响包括沉淀反响、凝集反响、抗体反响包括沉淀反响、凝集反响、溶解反响、补体结合反响和中和反响等。溶解反响、补体结合反响和中和反响等。抗原抗原-抗体反响可用知的特异性抗体检测抗体反响可用知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用知的抗原检测未知未知的抗原；也可用知的抗原检测未知的抗体。的抗体。免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标志技术、发光免疫分析等免疫标志技术志技术、发光免疫分析等免疫标志技术提高了抗原抗体反响的敏感性。提高了抗原抗体反响的敏感性。二抗原二抗原-抗体反响受多种要素抗体反响受多种要素影响影响 1 1 电解质：抗原电解质：抗原-抗体反响通常运用抗体反响通常运用0.85%0.85%的氯化钠作为稀释液的氯化钠作为稀释液 ，以供应，以供应顺应浓度的电解质。顺应浓度的电解质。2 2 温度：普通常运用反响在温度：普通常运用反响在3737度水浴度水浴 或孵育箱中进展。或孵育箱中进展。3.3.酸碱度：抗原酸碱度：抗原-抗体反响顺应的酸碱抗体反响顺应的酸碱度度 为为PH6-8PH6-8。4.4.抗原抗体比例抗原抗体比例第二节第二节 抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法 凝集反响凝集反响 沉淀反响沉淀反响 补体溶血反响和补体结合反响补体溶血反响和补体结合反响 中和反响中和反响 用标志抗体或抗原进展的抗原抗体反响用标志抗体或抗原进展的抗原抗体反响一一.凝集反响凝集反响 (Agglutination)(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后构成凝集结合后构成凝集 景象，称为凝聚反响。景象，称为凝聚反响。(1)(1)、直接凝集：将细菌或红细胞与相、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反响，出现细菌凝集或红应的抗体直接反响，出现细菌凝集或红细胞凝集景象。又分为玻片法和试管法。细胞凝集景象。又分为玻片法和试管法。(2)(2)、间接凝集：将可溶性抗原包被在、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒外表，与相应抗体反红细胞或乳胶颗粒外表，与相应抗体反响出现颗粒凝集景象。响出现颗粒凝集景象。血血 球球 凝凝 集集二二.沉淀反响沉淀反响 Precipitation)Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反响称为沉淀反响。沉淀反响可在液体中进展，反响称为沉淀反响。沉淀反响可在液体中进展，如絮状沉淀。大多沉淀反响是用半固体琼脂凝胶如絮状沉淀。大多沉淀反响是用半固体琼脂凝胶为介质，进展琼脂分散故也称免疫分散。为介质，进展琼脂分散故也称免疫分散。1.1.单向琼脂分散实验单向琼脂分散实验 2.2.火箭电泳火箭电泳 3.3.双向琼脂分散实验双向琼脂分散实验 4.4.对流免疫电泳对流免疫电泳三三.免疫标志技术免疫标志技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标志标志抗体或抗原进展抗原抗体或抗原进展抗原-抗体反响。标抗体反响。标志物质与抗体或抗原的化学衔接未志物质与抗体或抗原的化学衔接未改动抗体或抗原的免疫学特性，同改动抗体或抗原的免疫学特性，同时标志物的性质依然存在，因此极大的时标志物的性质依然存在，因此极大的提高了反响的灵敏度，可以对微量物质提高了反响的灵敏度，可以对微量物质进展定量、定性或定位检测。免疫标志进展定量、定性或定位检测。免疫标志技术主要有四种根本类型：免疫荧光技技术主要有四种根本类型：免疫荧光技术、免疫胶体金标志技术、免疫酶技术术、免疫胶体金标志技术、免疫酶技术和同位素标志技术。和同位素标志技术。1.1.免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术 用荧光素常用的有异硫氰酸荧光用荧光素常用的有异硫氰酸荧光素，与抗体衔接成荧光抗体，再与待素，与抗体衔接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反响，置荧光显微镜下察测标本的抗原反响，置荧光显微镜下察看，抗原抗体复合物分发出荧光，借此看，抗原抗体复合物分发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。对标本中的抗原作鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。法。间接免疫荧光法表示图间接免疫荧光法表示图 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用知的荧光抗原标志物称荧光抗体法；用知的荧光抗原标志物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。由于荧光色素不但能与抗体球蛋白法。由于荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实践任务中荧光抗原技术抗体，但是在实践任务中荧光抗原技术很少运用，所以人们习惯称为荧光抗体很少运用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。技术，或称为免疫荧光技术。2.2.免疫荧光测定技术免疫荧光测定技术1 1时间分辨荧光免疫技术时间分辨荧光免疫技术 原理：原理：TRFIA TRFIA 是用三价稀土离子及其螯合是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，如铕剂作为示踪物，如铕Eu3+)Eu3+)来标志抗体、来标志抗体、抗原，待反响体系发生后，用时间分辨荧抗原，待反响体系发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判别反响体光强度和相对荧光强度比值，判别反响体系中分析物的浓度，到达定量分析的目的。系中分析物的浓度，到达定量分析的目的。优点：技术集酶标志、同位素标志技术优点：技术集酶标志、同位素标志技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标志物制备简便、储存强、稳定性好、标志物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测反复性好、时间长、无放射性污染、检测反复性好、操作流程短、规范曲线范围宽和运用范操作流程短、规范曲线范围宽和运用范围广泛等优点，围广泛等优点，留意：所用试剂和器材务必防尘；留意：所用试剂和器材务必防尘；Eu3+Eu3+标志物的溶解和稀释必需尽标志物的溶解和稀释必需尽 量准确，务必在加样量准确，务必在加样1 1小时内配制。小时内配制。2 2电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析技术技术 原理：电化学发光免疫分析技术是继放射原理：电化学发光免疫分析技术是继放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法后的最先进的析法、化学发光免疫分析法后的最先进的免疫分析方法。电化学发光免疫分析方法。电化学发光ECLECL是一种是一种在电极外表由电化学引发的特异性化学发在电极外表由电化学引发的特异性化学发光反响，实践上包括了电化学和化学发光光反响，实践上包括了电化学和化学发光两个过程。直接以两个过程。直接以Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+标志抗体，标志抗体，反响时标志物直接发光。且反响时标志物直接发光。且Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+在电极外表的反响过程可以周而复始进展，在电极外表的反响过程可以周而复始进展，产生许多光子，使光信号得以加强。产生许多光子，使光信号得以加强。优点：非放射性标志物防止了放射性核优点：非放射性标志物防止了放射性核素的污染；磁性微粒素的污染；磁性微粒2.82.8m m为固相为固相载体外表积大，吸附率高，近似均相免载体外表积大，吸附率高，近似均相免疫反响；疫反响；链霉亲和素与生物素是最特异链霉亲和素与生物素是最特异及结实的结合；运用范围广；检测敏感及结实的结合；运用范围广；检测敏感度高；检测所需样本量少。度高；检测所需样本量少。2.2.酶免疫测定酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)(Enzyme Immunoassay,EIA)是用酶常用的有辣根过氧化物酶是用酶常用的有辣根过氧化物酶HRPHRP和和碱性磷酸酶碱性磷酸酶AP)AP)标志的抗体进展的抗原抗标志的抗体进展的抗原抗体反响。体反响。EIAEIA将抗原抗体反响的特异性与酶将抗原抗体反响的特异性与酶催化作用的高效性相结合，经过酶作用于催化作用的高效性相结合，经过酶作用于底物后显色来断定结果。常用的方法有酶底物后显色来断定结果。常用的方法有酶联免疫吸附实验和酶免疫组化法，前者测联免疫吸附实验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织或细定可溶性抗原或抗体，后者测定组织或细胞外表的抗原。胞外表的抗原。(1).(1).酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(ELISA)(ELISA)将知的抗原或抗体吸附在固相载体聚苯乙烯微量反响将知的抗原或抗体吸附在固相载体聚苯乙烯微量反响板外表，使抗原抗体反响在固相外表进展。用洗涤法将液板外表，使抗原抗体反响在固相外表进展。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-BAS-ELISAELISA等。等。(2)ELISA(2)ELISA方法有方法有:a.a.双抗体双抗体 /抗原夹心法测抗原抗原夹心法测抗原 /抗体抗体:包被在固相载体上的抗体包被在固相载体上的抗体 /抗原与参与的待测抗原抗原与参与的待测抗原 /抗体及酶标抗体抗体及酶标抗体 /抗原三者在一定条件下进展温育反响，抗原三者在一定条件下进展温育反响，假设待测样本中含有特异性抗原假设待测样本中含有特异性抗原 /抗体，那么在孔内构成抗体，那么在孔内构成抗体抗体 /抗原抗原-抗原抗原 /抗体抗体-酶复合物酶复合物,经过严厉洗涤后经过严厉洗涤后,复复合物与底物作用后将显色。合物与底物作用后将显色。b.b.间接法测抗体：间接法测抗体：将抗原包被在固相载体上，样本将抗原包被在固相载体上，样本中含有特异性抗体那么结合成抗原中含有特异性抗体那么结合成抗原抗体复合物，再与参与的酶标志抗抗抗体复合物，再与参与的酶标志抗抗体结合体结合,构成抗原抗体酶标抗抗构成抗原抗体酶标抗抗体复合物。酶催化底物显色。体复合物。酶催化底物显色。C.C.竟争法测抗体：竟争法测抗体：包被抗原于固相载体上，检测时包被抗原于固相载体上，检测时参与样本和酶标志抗体，如样本中含参与样本和酶标志抗体，如样本中含有特异性抗体将与酶标志抗体竟争与有特异性抗体将与酶标志抗体竟争与包被的固相抗原结合构成抗原抗体包被的固相抗原结合构成抗原抗体复合物，固相上无酶催化底物，而不复合物，固相上无酶催化底物，而不显色。显色。包被抗体于固相载体上，检测时参与样本、包被抗体于固相载体上，检测时参与样本、中和抗原和酶标志抗体，如待测样本中含有特中和抗原和酶标志抗体，如待测样本中含有特异性抗体将与固相抗体竟争中和抗原结合构成异性抗体将与固相抗体竟争中和抗原结合构成抗体抗原抗体复合物，固相上无酶催化底抗体抗原抗体复合物，固相上无酶催化底物，而不显色。物，而不显色。d.d.固相捕获法测固相捕获法测IgMIgM抗体：抗体：将抗抗体抗人将抗抗体抗人链包被于固相载体链包被于固相载体上，如样本中含有特异性抗体那么结合成抗抗上，如样本中含有特异性抗体那么结合成抗抗体抗体复合物，参与抗原及酶标志抗体那么体抗体复合物，参与抗原及酶标志抗体那么进一步构成抗抗体抗体抗原酶标志抗体进一步构成抗抗体抗体抗原酶标志抗体复合物。酶催化底物并显色。复合物。酶催化底物并显色。ELISA原理及分类原理及分类3.3.胶体金法胶体金法 胶体金法，又称金标法，是一种常用的胶体金法，又称金标法，是一种常用的标志技术，是以胶体金作为示踪标志物标志技术，是以胶体金作为示踪标志物运用于抗原抗体的一种新型的免疫标志运用于抗原抗体的一种新型的免疫标志技术。目前在医学检验中的运用主要是技术。目前在医学检验中的运用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法，具有免疫层析法和快速免疫金渗滤法，具有简单、快速、准确和无污染等优点。各简单、快速、准确和无污染等优点。各类快速检测试纸均采用免疫层析法，大类快速检测试纸均采用免疫层析法，大量以塑料为载体的快速检测块均采用快量以塑料为载体的快速检测块均采用快速免疫金渗滤法速免疫金渗滤法 层析法免疫胶体金检测试剂构造表示图层析法免疫胶体金检测试剂构造表示图 C1金标志鼠抗人HCG;T金标志鼠抗人HCG+HCG+抗HCG;(测定区)C2-多余金标志鼠抗人HCG+羊抗小鼠HCG.(质控区)此图为双抗体夹心法，显色为阳性；竞争法相反。肝炎标志物检测一一.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒HBVHBV是具是具有复杂构造的有复杂构造的DNADNA病毒，中心内含病毒，中心内含有一双股有一双股DNADNA和和DNADNA聚合酶，外面有聚合酶，外面有一层含有外表抗原一层含有外表抗原HBsAgHBsAg的外的外衣衣 HBVHBV的抗原复杂，其外壳中有外的抗原复杂，其外壳中有外表抗原，中心成分中有中心抗原和表抗原，中心成分中有中心抗原和e e抗原，感染后可引起机体的免疫抗原，感染后可引起机体的免疫反响，产生相应的抗体。反响，产生相应的抗体。HBVHBV感染感染的种属范围很窄，只局限于人和黑的种属范围很窄，只局限于人和黑猩猩。猩猩。1.1.乙型肝炎外表抗原乙型肝炎外表抗原(HBsAg)(HBsAg)和和外表抗体外表抗体(抗抗-HBs)HBsAg-HBs)HBsAg存在于病存在于病毒颗粒的外壳以及小球形颗粒和管毒颗粒的外壳以及小球形颗粒和管状颗粒。于感染后状颗粒。于感染后2-122-12周，丙氨酸周，丙氨酸转氨酶转氨酶(ALT)(ALT)升高前，即可由血内升高前，即可由血内测到，测到，HBsAgHBsAg有有“a a、“b b、“y y、“r r、“w w等多种抗原等多种抗原决议簇，其中决议簇，其中“a a是共同的抗原是共同的抗原决议簇，在我国的主要是决议簇，在我国的主要是adradr亚型。亚型。乙肝病毒解剖模型乙肝病毒解剖模型1 乙肝病毒解剖模型2 抗抗-HBs-HBs对同型感染具有维护作用。近期感染者所产对同型感染具有维护作用。近期感染者所产HBsHBs属属IgMIgM，而长期存在血中的为抗，而长期存在血中的为抗-HBsIgG-HBsIgG。前前S1S1及前及前S2S2蛋白具有与蛋白具有与HBsAgHBsAg不同的抗原。完好的不同的抗原。完好的HBVHBV颗颗粒含有粒含有S S蛋白及前蛋白及前S2S2蛋白，而缺陷病毒颗粒那么无前蛋白，而缺陷病毒颗粒那么无前S1S1蛋白。蛋白。血清中出现前血清中出现前S1S1、前、前S S抗原是抗原是HBVHBV活动性复制的标志。活动性复制的标志。HBsAgHBsAg阳性患者原发性肝癌的发病概率为正常人的阳性患者原发性肝癌的发病概率为正常人的200200倍以上；倍以上；2.HBcAg2.HBcAg主要存在于受染的肝细胞核内，复制后被释至胞主要存在于受染的肝细胞核内，复制后被释至胞浆中，由胞浆中构成的浆中，由胞浆中构成的HBsAgHBsAg包裹，装配成完好的病毒颗粒包裹，装配成完好的病毒颗粒后释放入血。血液中普通不能查到游离的后释放入血。血液中普通不能查到游离的HBcAgHBcAg。血中的。血中的DaneDane颗粒经去垢剂处置后可以查到其中心部分的颗粒经去垢剂处置后可以查到其中心部分的HBcAgHBcAg和和DNADNA聚合酶。聚合酶。早期出现者主要是抗早期出现者主要是抗-HBcIgM-HBcIgM，是近期感染的重要，是近期感染的重要标志；抗标志；抗-HBcIgG-HBcIgG出现较迟，但可长期存在。抗出现较迟，但可长期存在。抗-HBcHBc对对HBVHBV感染无维护作用。血清中抗感染无维护作用。血清中抗-HBcIgM-HBcIgM阳性阳性阐明体内有阐明体内有HBVHBV复制，且有肝细胞损害；假设抗复制，且有肝细胞损害；假设抗-HbcIgGHbcIgG阳性且滴度高，伴以抗阳性且滴度高，伴以抗-HBs-HBs阳性，那么为乙阳性，那么为乙型肝炎恢复期；假设抗型肝炎恢复期；假设抗-HBcIgG-HBcIgG呈低滴度，抗呈低滴度，抗-HBcIgMHBcIgM阴性，而抗阴性，而抗-HBs-HBs阳性，那么是既往感染的标阳性，那么是既往感染的标志。志。3.HBeAg3.HBeAg仅存在于仅存在于HBsAgHBsAg阳性者的血液中，通常伴阳性者的血液中，通常伴有肝内有肝内HBVDNAHBVDNA的复制，血中存在较多的复制，血中存在较多DaneDane颗粒和颗粒和HBVDNAHBVDNA聚合酶活性增高，因此，聚合酶活性增高，因此，HBeAgHBeAg阳性是病毒阳性是病毒活动性复制的重要目的，传染性高。急性肝炎患者活动性复制的重要目的，传染性高。急性肝炎患者假设假设HBeAgHBeAg继续阳性继续阳性1010周以上，那么易于转为继续周以上，那么易于转为继续感。感。HBV HBV是经过接触、血液及血制品、母婴垂直传播是经过接触、血液及血制品、母婴垂直传播等方式传播。在我国约有等方式传播。在我国约有6060的乙肝病毒携带者是经的乙肝病毒携带者是经过母婴垂直传播的。过母婴垂直传播的。二二.甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒HAVHAV HAVHAV属微小核糖核酸病毒属微小核糖核酸病毒 (RNA)(RNA)主要引起急性感主要引起急性感染，经粪口途径传播，有季节性，可引起迸发流行。染，经粪口途径传播，有季节性，可引起迸发流行。三三.丙型肝炎抗体丙型肝炎抗体(HCV)(HCV)测定丙型肝炎抗体是断定急、慢性丙型肝炎的重测定丙型肝炎抗体是断定急、慢性丙型肝炎的重要目的。丙型肝炎病毒要目的。丙型肝炎病毒HCVHCV是一种具有脂质外壳是一种具有脂质外壳的的RNARNA病毒病毒 HCVHCV感染者血中的感染者血中的HCVHCV浓度极低，抗体反响浓度极低，抗体反响弱而晚，血清抗弱而晚，血清抗-HCV-HCV在感染后平均在感染后平均1818周阳转，至肝功周阳转，至肝功能恢复正常时衰退，而慢性患者抗能恢复正常时衰退，而慢性患者抗-HCV-HCV可继续多年并可继续多年并具有传染性。具有传染性。在2个月左右的埋伏期后，只需大约四分之一的病人会出现食欲差、疲倦、黄疸等病症；而大部分的患者却没有任何觉得。而且，感染后大约要经过二十年左右才会出现肝硬化。因此，有很多人根本不知道本人经感染。而丙肝可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可开展为肝硬化甚至肝细胞癌HCC，对患者的安康和生命危害极大 HCV主要经过输血和血制品来进展传播。四四.丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒(HDV)(HDV)是一种缺陷的嗜肝单链是一种缺陷的嗜肝单链RNARNA病毒，病毒，需求需求HBVHBV的辅助才干进展复制，因此的辅助才干进展复制，因此HDVHDV和和HBVHBV同时或重叠感染。同时或重叠感染。五五.戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒HEVHEV HEVHEV对氯仿敏感，在对氯仿敏感，在44或或2020下易被破坏，下易被破坏，在硷性环境中较稳定。在硷性环境中较稳定。HEVHEV存在于替伏末期及发病存在于替伏末期及发病初期的患者粪便中。有明显的季节性，多分发于雨初期的患者粪便中。有明显的季节性，多分发于雨季后，粪口传播是主要的传播途径。季后，粪口传播是主要的传播途径。甲型和戊型肝炎病毒主要引起急性感染，经粪口途甲型和戊型肝炎病毒主要引起急性感染，经粪口途径传播，有季节性，可引起迸发流行。径传播，有季节性，可引起迸发流行。乙、丙、丁型肝炎常表现为慢性经过，主要经血液传乙、丙、丁型肝炎常表现为慢性经过，主要经血液传播，无季节性，多为分发，并可开展为肝硬化和肝播，无季节性，多为分发，并可开展为肝硬化和肝细胞癌。细胞癌。类风湿性因子类风湿性因子RFRF：是一种以变性：是一种以变性IgGIgG为靶抗原的本身抗体，主要存在于类风湿为靶抗原的本身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性种抗变性IgGIgG的抗体，可与的抗体，可与IgGFcIgGFc段结合。段结合。检测方法普通有胶乳凝集实验、双抗原夹检测方法普通有胶乳凝集实验、双抗原夹心心ELISAELISA法、速率散射比浊法。法、速率散射比浊法。胶乳凝集实验胶乳凝集实验 ：将变性：将变性IgGIgG包被于聚苯乙包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血清中的清中的RFRF相遇时，即发生肉眼可见的凝集。相遇时，即发生肉眼可见的凝集。正常人正常人1 1：2020稀释血清为阴性，操作要求稀释血清为阴性，操作要求56305630分钟灭活，灭活分钟灭活，灭活C1qC1q以阻止假阳以阻止假阳性凝集。性凝集。类风湿诊断 临床意义：未经治疗的类风湿性关节炎患者其阳性率为80%，且滴定度常在1：160以上。RF不是仅在RA患者中出现，在SLE、进展性全身性硬化症等本身免疫性疾病患者和部分老年人中RF的阳性率可达28.9%-50%，因此RF对RA患者并不具有严厉特异性，抗链球菌溶血素抗链球菌溶血素“O O，简称抗，简称抗“O O或或ASO ASO 溶血性链球菌产生的一种代谢产物能溶血性链球菌产生的一种代谢产物能溶解红细胞，所以这种产物被取名为溶解红细胞，所以这种产物被取名为“O O溶血溶血素，人体感染了素，人体感染了A A组溶血性链球菌后，组溶血性链球菌后，“O O溶溶血素在体内作为一种抗原物质存在。为了测定血素在体内作为一种抗原物质存在。为了测定这种能中和链球菌溶血素这种能中和链球菌溶血素“O O的抗体含量，就的抗体含量，就称为抗链球菌溶血素称为抗链球菌溶血素“O O实验。实验。临床意义临床意义:溶血性链球菌感染、猩红热、溶血性链球菌感染、猩红热、丹毒、链球性咽炎、扁桃体炎。对风湿丹毒、链球性咽炎、扁桃体炎。对风湿热、急性肾小球肾炎有间接诊断价值、热、急性肾小球肾炎有间接诊断价值、假设多次检测结果递增，并伴红细胞沉假设多次检测结果递增，并伴红细胞沉降率加快可有助于诊断。降率加快可有助于诊断。免疫学检验室内质量控制免疫学检验室内质量控制 ELISA质量管理的根本要求质量管理的根本要求 l 免疫检验要保证检验结果的准确、可靠、及时、有效，并尽能够使各实验室间检验结果l可比性，这是免疫检验质量保证的根本目的。ELISA实验室内质控的重点是对低值弱阳性标本检测的精细性进展检测。临床免疫学检验主要采用血清标本，检验工程既有传染性病原体的抗原及抗体，还有肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子、治疗药物等；既有定量检测，又有定性检测。一、分析前质量保证一、分析前质量保证 l 主要是患者预备、标本的正确采集、保送主要是患者预备、标本的正确采集、保送及保管。防止溶血、乳糜血、血液污染，治疗及保管。防止溶血、乳糜血、血液污染，治疗药物及激素测定还应留意采集标本的时间，甚药物及激素测定还应留意采集标本的时间，甚至患者体位都能影响检测结果。溶血标本会添至患者体位都能影响检测结果。溶血标本会添加非特异性显色呵斥假阳性。加非特异性显色呵斥假阳性。l 仪器坚持最正确任务形状。所要控制的仪器坚持最正确任务形状。所要控制的仪器包括移液器加样枪，水浴箱温箱，仪器包括移液器加样枪，水浴箱温箱，洗板机和酶标仪。洗板机和酶标仪。l1.加样：加标本运用微量移液器，按规定的加样：加标本运用微量移液器，按规定的量加至微孔板孔底的量加至微孔板孔底的 1/3 处，防止加在孔壁处，防止加在孔壁上部，并留意不可溅出，不可产生气泡。加上部，并留意不可溅出，不可产生气泡。加每份标本应改换吸嘴，干吸头预先在样本中每份标本应改换吸嘴，干吸头预先在样本中抽吸三次。滴瓶滴加试剂时，应先将滴瓶摇抽吸三次。滴瓶滴加试剂时，应先将滴瓶摇匀并挤去第匀并挤去第 1 滴有气泡的试剂，留意垂直加滴有气泡的试剂，留意垂直加样，并力求量的一致。样，并力求量的一致。一、分析中质量保证一、分析中质量保证 2.2.温育温育应严厉按照试剂盒要求选择温育次数和应严厉按照试剂盒要求选择温育次数和间，力求准确、一致。间，力求准确、一致。温育采用能使反响液迅速到达平衡的水浴温育采用能使反响液迅速到达平衡的水浴法。为减少边缘效应，水要浸至板条的法。为减少边缘效应，水要浸至板条的1/31/3处，不可将板条叠加放置。可加封膜条以处，不可将板条叠加放置。可加封膜条以防止蒸发。防止蒸发。3.洗涤洗涤l甩去孔内反响液。甩去孔内反响液。l用洗涤液过洗一遍即注满孔后即刻甩去。用洗涤液过洗一遍即注满孔后即刻甩去。l将微孔重新注满洗液后浸泡将微孔重新注满洗液后浸泡 1-2 1-2 分钟，间歇摇动。分钟，间歇摇动。l甩去孔内液体，点头，用纸彻底吸干。甩去孔内液体，点头，用纸彻底吸干。l反复以上操作至少反复以上操作至少 5 5 次，留意各种试剂盒的洗涤液次，留意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。尽量不要混用。l洗板机洗涤时一定按要求设置洗涤参数，务必要板洗板机洗涤时一定按要求设置洗涤参数，务必要板架放平架放平 ，填充孔不能高于标本孔，标本孔不能有凝，填充孔不能高于标本孔，标本孔不能有凝块，以免堵孔。块，以免堵孔。4.显色及判读结果显色及判读结果l留意加显色液次序和显色时间。l比色前务必擦干板底。l留意灰区值的断定及处置。一、分析后质量保证一、分析后质量保证 钩状效应景象假设样本中抗原浓度过高，会出钩状效应景象假设样本中抗原浓度过高，会出现高浓度后带景象，此时免疫反响被明显抑制，测现高浓度后带景象，此时免疫反响被明显抑制，测定结果偏低。要消除此干扰，只需对样本进展适当定结果偏低。要消除此干扰，只需对样本进展适当稀释后重新测定。对双抗体夹心法那么抗原时出现稀释后重新测定。对双抗体夹心法那么抗原时出现的假阴性标本需稀释的假阴性标本需稀释1 1：250250、1 1：500500、1 1：10001000后重测。后重测。l 灰区值需反复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，灰区值需反复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内那么报告阳性。如仍落在灰区范围内那么报告阳性。l 一步法一步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线抗原浓度与显色变化的反映曲线 二步法二步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线抗原浓度与显色变化的反映曲线对某些稀有方式，必需进展复查。对某些稀有方式，必需进展复查。试剂盒阴性、阳性对照或规范浓度系列：阴性对试剂盒阴性、阳性对照或规范浓度系列：阴性对照值照值 0.05，阳性对照值，阳性对照值 0.8，阳性对照，阳性对照值阴性对照值值阴性对照值 0.8；规范浓度落在；规范浓度落在 2S范范围内。围内。谢谢大家！谢谢大家！l多加强与临床的沟通