BCA蛋白检测方法

BCA蛋白检测方法Bicinchoninicacid(BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与 Lowery 法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与 Cu2+ 络合并将 Cu2+ 还原成 Cu1+。BCA 与 Cu1+ 结合形成稳定的紫蓝色复合物， 在 562nM 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery 法相比，BCA 蛋白测定方法灵敏度高，操作简单， 试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比， BCA 法的显着优点是不受去垢剂的影响。BCA 定量中的 A和B液BCA 定量中的A 和 B 液的成分是什么，作用是什么？试剂 A ： BCA(bicinchoninincacid) 碱性溶液试剂 B：硫酸铜溶液作用：BCA 与二价铜离子的硫酸铜溶液等其他试剂组成的试剂，混合后显示苹果绿色。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为 Cu+，一个 Cu+螯合两个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物。试剂(1)试剂 A: 含 1%BCA 二钠盐、 2% 无水碳酸钠、 0.16%酒石酸钠、 0.4%氢氧化钠、 0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH 至 11.25。（ 2）试剂 B：4% 硫酸铜。（ 3）BCA 工作液：试剂 A100mL+ 试剂 B2L ，混合。（ 4）蛋白质标准液：准确称取 150mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1.5mg/mL 的蛋白质标准液。(5)待测样品。1、将上述各管混匀后于37 C 保温 30 分钟，用 562nm 波长比色测定吸光度值。2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L) 。待测样品浓度在502000 微克毫升浓度范围内有较好的线性关系BCA 蛋白检测BCAProteinAssay 是基于在碱性条件下，Cu2+被蛋白还原成Cu+，进而发生高敏感性和选择性的颜色变化，通过分光测定，精确定量蛋白质浓度。此方法与Bradford 蛋白检测一道，并列成为当今世界上最为常用的两种蛋白浓度检测方法。特点：1高兼容性，尤其适用于表面活性剂存在下的蛋白浓度检测，如细胞或组织的蛋白提取物。2高敏感度。可精确定量12000 g/ml 蛋白样品。3.受温度和时间影响较大，需准确定时、定温，以保证蛋白的精确定量。 4.检测蛋白提取物或纯化蛋白样品，应使用相应的缓冲液制备蛋白标准曲线。同时样品的检测条件要与蛋白标准曲线的检测条件保持一致，如37放置 30 分钟。5.562nm 测定，也可用接近的波长检测，如570nm。6.此检测试剂不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可兼容样品中高达5% 的 SDS，5%的 TritonX-100 ，5%的 Tween20 ，60， 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA 低于 1mM ， -巯基乙醇低于 10mM ，无 EGTA ，二硫苏糖醇低于 1mM ， -巯基乙醇低于 1mM 。