LBA4404烟草叶盘法转化

LBA4404 烟草叶盘法转化(copyright by Haoli Ma)1、菌的准备（Day 1）：将含有已构建好质粒的LBA4404菌液在LB+Str+Kana平板上划线，28C 36h，挑单克隆至3-5 ml YM培养基中250 rpm 28C 36h，按照1： 100-1： 50的比例扩大培养 50ml 3-5h至OD=0.5,然后将菌液离心，用MS0液体培养基（50m 1）悬浮菌体至OD=0.2-0.4用于 侵染；2、外植体的预培养（Day 2）：选取第一片完全展开的健康叶片（4-5周），用手术刀切成0.5cm 见方大小（切掉叶缘避开主脉，20片/皿），叶片上表面朝下在MS1固体培养基上25C暗培养 2-3d （以外植体膨大至两到三倍为准）；3、侵染（Day 4）:将预培养过的烟草叶片加入到菌液中，涡旋振荡确保叶片切口被菌液浸没， 静止5-10min，用无菌滤纸吸去附着的菌液；4、共培养（Day 4）：将侵染过的叶片上表面朝下置于MS1固体培养基上28C暗培养3d （在共 培养固体培养基上垫一层灭菌滤纸）；5、选择培养（Day 7+14*x, x=2或3）：将叶片上表面朝上转移至含有抗生素（Cp+HygB）的MS1 固体培养基上 25C 16h light/d ark 2 weeks， subculture/2 weeks；6、生根培养（Day 7+14*x，x=2或3之后）：当叶缘长出芽并可以分离时（1cm以上），将芽切下 转移至含有抗生素（Cp+HygB）的MS2固体培养基中，两周后长出根，打开育苗盒的盖子练苗 一周后转入温室培养。MS 培养基（MS0）： MSMS 分化培养基（MS1）（共培养培养基，co-culture media）： MS + 0.5mg/L IAA + 2.0 mg/L BA + 3 % sucrose + 0.6-0.8%Phytagel （固体加液体不加）PH=5.8MS 生根培养基（MS2）： MS + 0.5 mg/L IAA + 3% sucrose + 0.6-0.8%Phytagel （固体加液体不加） PH=5.8Str （50 mg/L） Kana （50 mg/L） Cp（cephalothin,头抱霉素，500 mg/L） Hyg B（hygromycin B,潮霉 素B, 50 mg/L）注 1：步骤 5 中，选择培养筛选周期视情况而定。注 2：固体培养基中琼脂粉要用组织培养用的琼脂，且加入的浓度与琼脂的质量及厂家有关。 例如有的琼脂质量比较好，加到 0.5%就比较好了，有些厂家要加到 0.8%，不可太浓，太浓吸 收营养及筛选压力不够。注3：筛选时，叶片边缘要与培养基接触以提供营养和筛选。 1卡弼素和潮素对券分化频率的彫响Tabb I Elfctts （ KaiiEJuyciij jid Hygnmycuj U unfrequency cf shuut r曾ritzBtkixi抗生鴛隊度 cojqe仇直砒曲in antilaotvs (rn/JCahoot(requecisyJCM)卡那索0(CKS3. 41080, 131- 72042- I16. 450山51-6751.30100001500Q20000