绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的测定技术规程-征求意见稿

ICS65.020.30B 44DB15内蒙古自治区地方标准DB 15/ XXXXXXXXX绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的测定技术规程The technical specification for the determination of dietary metablizable lipogenous substances (MLS) in sheep点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/ XXXXXXXXX目次前言II引言III1范围12规范性引用文件13术语与定义14试剂和仪器25试验动物、日粮与饲养管理26稳态下瘤胃VFA基本产生速率的确定原理（以乙酸为例）37测定步骤38数据处理6附录8参考文献9前言本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准归口单位：内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）。本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本标准主要起草人：杜瑞平、卢德勋、高民、凌树礼、马燕芬、胡红莲、王丽芳、羿静。绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的测定技术规程1 范围本标准规定了以绵羊为代表的反刍动物可代谢生脂物质（MLS）指标的定义和测定方法。本标准适用于牛、羊等反刍动物可代谢生脂物质（MLS）指标的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 30431-2013 实验室气相色谱仪3 术语与定义3.1 反刍动物 Ruminants是指有反刍这种消化方式的一类哺乳动物，这类动物具有复杂的瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃，如牛、羊、骆驼、鹿等。3.2 挥发性脂肪酸Volatile fatty acids（VFA）挥发性脂肪酸是日粮中的碳水化合物经瘤胃微生物发酵后产生的重要产物，以乙酸、丙酸、丁酸为主，是反刍动物的主要能量来源及合成乳脂肪和体脂肪的原料。3.3 可代谢生脂物质 Metabolizable lipogenous substances（MLS）指饲料或日粮经动物消化吸收后，可以给动物本身提供的可利用的生脂物质（折合成乙酸总量），单位为g/d。3.4瘤胃VFA产生速率Ruminal VFA production rate指瘤胃中每小时发酵生成的某种VFA数量（mmol/h）。3.5瘤胃VFA流通速率Ruminal VFA flow rate指瘤胃中每小时向后消化道流通的某种VFA数量（mmol/h）。3.6瘤胃VFA吸收速率Ruminal VFA absorption rate 指瘤胃中每小时经瘤胃壁吸收的某种VFA数量（mmol/h）。3.7 瘤胃VFA吸收率Ruminal VFA Fractional absorption rate指瘤胃中每小时经瘤胃壁吸收的某种VFA数量占每小时产生量的百分比（%）。4 试剂和仪器乙酸，丙酸，丁酸，乙酸钴，乙二胺四乙酸，氢氧化钠，过氧化氢，乙醇等均为国产分析纯。电子分析天平（上海精密），酸度计（PHS-3B，上海雷磁），气相色谱仪（GC-7A，岛津），原子吸收仪（TAS-986，北京普析），高速离心机（Beckman）。5 试验动物、日粮与饲养管理要求体况良好、年龄、体重相近的6只以上任一绵羊品种，安装有永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管。试验日粮可对应相应生理阶段参照中国或NRC绵羊饲养标准配制。试验羊每隔3h给予等量混和日粮，日喂8次，每期试验在预饲期和试验期内均单笼饲养， 预饲期15d，预饲期内试验羊自由饮水，试验期停止供水，取而代之用灌注液满足水的需要。其它饲养管理程序相同。6 稳态下瘤胃VFA基本产生速率的确定原理（以乙酸为例）计算瘤胃内VFA产生速率的前提是瘤胃VFA的产生速率与它们从瘤胃的消失保持平衡，然后通过启动灌注和连续灌注VFA的方法，打破瘤胃的稳态使其浓度变化,经过一段时间又达到新的瘤胃VFA浓度的相对稳衡状态，通过瘤胃某VFA浓度的变化计算VFA的基本产生速率(mmol/h)。假定乙酸的基本产生速率为P(mmol/h)，用U(mmol/h)代表乙酸的消失速率，C(mmol/ml)代表基本稳态下瘤胃中乙酸的浓度。在瘤胃VFA产生处在稳态下，可假定瘤胃乙酸的消失与乙酸的库容量成正比(Bergman等,1990)，可得出如下瘤胃乙酸的产生与消失的平衡方程: P=U=kCV (1)式中:k(/h)为比例常数；V(ml)为瘤胃液相体积。所谓瘤胃乙酸库是指瘤胃液相通常存留的的乙酸数量，其值的大小反映了乙酸边产生边被瘤胃上皮吸收和流失等综合平衡后的结果。通过向处在基本稳态的瘤胃连续灌注一定浓度的乙酸溶液打破其稳态，并假定乙酸灌注的连续恒定速率为I(mmol/h)，如果VFA的灌注不改变瘤胃基本发酵模式，则新的稳态平衡方程为:P+I=U=kCV (2)式中: U、C、V分别表示在新的稳态下乙酸的消失速率、乙酸的浓度和瘤胃液相体积。将方程(2)减去方程(1)得到比例常数k:k=I/(CV-CV) (3)用k值取代(1)则得到稳态下乙酸的基本产生速率(mmol/h):P=I/(CV/CV-1) (4)由于乙酸的浓度CC可以测定，连续灌注前后瘤胃液相体积V、V可用液相标记物(Co-EDTA)测定。因此可用式(4)计算乙酸的基本产生速率。这就是非标记酸灌注下VFA产生速率的测定原理。7 测定步骤7.1标记物的制备、投放与乙酸、丁酸的灌注7.1.1 标记物的制备Co-EDTA的制备根据Uden等(1980)介绍的方法进行: 称取25g乙酸钴，29.2g乙二胺四乙酸和4.0g氢氧化钠放入一个2升烧杯中，加入200ml蒸馏水，加热至80进行溶解，冷却后再加入20ml 30%过氧化氢溶液，室温放置4h后加入300ml 95%(V/V)乙醇溶液，置于冰箱12h，然后经定性滤纸过滤并用85%(V/V)乙醇溶液冲洗数遍。最后收集滤纸上粉红色物质于瓷盘中，置于100烘箱中烘干即可。实测该CoEDTA标记物Co 含量为14.08%。7.1.2 灌注前标记物的投放连续饲喂15d后，第16d晨6点采集20ml瘤胃液后将1g CoEDTA溶于50ml蒸馏水中经采样管通过瘤胃瘘管灌入绵羊瘤胃内不同位点，灌注完毕再抽取瘤胃液反复冲洗采样管3次，并将冲洗瘤胃液回灌瘤胃内。此后2h、4h、6h、9h、12h、18h和24h分别抽取瘤胃液20ml，用以测定Co、pH和VFA。7.1.3 灌注后标记物的投放与乙酸丁酸的灌注上述Co-EDTA投放后继续连续饲喂一周，第8d晨6：00开始启动灌注，将100ml启动灌注液通过注射器经采样管迅速注入瘤胃内不同位点，灌注完毕用采样管尽量充分搅匀瘤胃液，并抽取瘤胃液反复冲洗采样管和注射器，冲洗瘤胃液应及时回灌瘤胃内，紧接着进行连续灌注。连续灌注3h后开始从瘤胃和小肠取样：瘤胃液从9:00 开始，每2h采一次，直至下午18:00结束；连续灌注在18:00采样后结束。紧接着灌注水溶液，灌注速率不变，持续至21:00结束，灌水中间每小时采瘤胃液一次，结束后让羊自由采食，自由饮水。7.1.4 启动-连续灌注液剂量及灌注液中乙酸丁酸浓度和标记物的确定启动灌注的目的是为了迅速提高瘤胃的某VFA浓度达到一个新的水平，并接上连续灌注后在较短的时间内趋向新的稳定状态。同时也使液相中标记物的浓度趋于稳定。启动和连续灌注液见附录表1、表2。7.2 样品处理及分析方法7.2.1瘤胃液样品处理 采集的瘤胃液立即用四层纱布过滤，取4ml瘤胃液和1ml（25%）的偏磷酸，静置30分钟，3000rpm下离心10分钟，直接上机测定VFA和Co或-20冰箱保存。7.2.2 VFA测定用日本岛津GC-7A气相色谱仪依内标法进行测定，内标物为巴豆酸。取瘤胃液10ml 4000转/分钟离心15分钟，取上清液4ml加入25%的偏磷酸与甲酸按3:1配制的混合液1ml，静置40分钟后，取1ml混和液加入2克酸性吸附剂(Na2SO4:50%H2SO4:硅藻土W/V30:1:20)和4ml巴豆酸溶液(31.25mm，溶剂为CHCl3)，摇匀、澄清后上机测定。色谱条件：色谱柱为内3mm，长2mm不诱钢柱，担体为10%的FFAP(聚乙醇20ml与2-硝基对苯二甲基的反应物)加1% H3PO4的Chromosob W(AW)。柱温150，汽化室温度为230。空气压力为0.35kg/cm2，流量为140ml/分钟；氢气压力为1.2kg/cm2，流量为14ml/分钟，N2(载气)流量为55ml/分钟。进样量为1微升。7.2.3 Co的测定 原子吸收法测定。7.2.4 瘤胃液pH值 pH酸度计直接测定。7.3 计算公式（以乙酸为例）(1) 灌注前后的瘤胃液相小时稀释速率K和K（/h）：Co(t)Co(0)*e-KtCo(t)Co(0)*e-Kt(2) 灌注前后的瘤胃液相流通速率F和F(L/h)：FV*KFCo连续灌注速率(mg/h)/连续灌注后稳态下液相Co浓度(mg/L)(3) 灌注前后的瘤胃液相体积V和V（L）：V一次投放的Co量(mg)/ Co(0)(mg/L)VF/K注：Co(0)为上述公式回归出的投放时间Co浓度(4) 灌注前后的瘤胃乙酸流通速率AFR和AFR（mmol/h）：AFRC*FAFRC*F(5) 灌注前后的瘤胃乙酸产生速率P和P（mmol/h）：PI/(CV/CV-1)PPI注：式中I为乙酸连续灌注速率（6）灌注前后的瘤胃乙酸吸收速率AAR和AAR(mmol/h):P = AAR + AFRAAR = P AFRAAR= P- AFR(7) 灌注前后的瘤胃乙酸吸收率A和A(%):AAAR/PAAAR/P（8）可代谢生脂物质（MLS）的计算MLS(g/d)=0.72*k1*Ac+1.8*k2*Bu +1.14*k3*Fat注：k1为乙酸瘤胃吸收率， k2为丁酸瘤胃吸收率，k3为过瘤胃脂肪的小肠吸收率，Ac为乙酸瘤胃产生量(mmol/d)，Bu为丁酸瘤胃产生量(mmol/d)，Fat为过瘤胃脂肪数量（以总脂肪酸数量表示，mmol/d)。0.72为乙酸合成脂肪酸的效率，1.8为丁酸和乙酸的能值之比2.50再乘以0.72所得，1.14为脂肪酸和乙酸能值之比。8 数据处理均应用SAS软件(SAS for Windows，Release 6.12)中的ANOVA过程进行方差分析，多重比较用Duncan法进行比较。_A附 录表1 乙酸启动连续灌注液中各项指标的计算启动液连续液体积（ml）100连续灌注速率（ml/h）125乙酸浓度（mM）955乙酸浓度（mM）480加入乙酸量（ml）5.77乙酸灌注速率（mmol/h）60 Co浓度（ppm）422.4Co浓度（ppm）35加入Co-EDTA量（g）0.3加入Co-EDTA量（mg）52.5NaHCO3（g/L）78加入乙酸量（ml）42KHCO3（g/L）38自由饮水速率（ml/h）125NaCl（g/L）7Co连续灌注速率（mg/h）4.375表2 丁酸启动连续灌注液中各项指标的计算启动液连续液体积（ml）100连续灌注速率（ml/h）125丁酸浓度（mM）320丁酸浓度（mM）80加入丁酸量（ml）2.82丁酸灌注速率（mmol/h）10 Co浓度（ppm）422.4Co浓度（ppm）35加入Co-EDTA量（g）0.3加入Co-EDTA量（mg）52.5NaHCO3（g/L）78加入丁酸量（ml）10.33KHCO3（g/L）38自由饮水速率（ml/h）125NaCl（g/L）7Co连续灌注速率（mg/h）4.375参考文献a) 卢德勋.系统动物营养学导论.M.北京:中国农业出版社,2004.b) Preston T R and R A Leng. Matching ruminant production systems with available resources in the tropics and subtropicsArmidale, Australia, Penambul Books. 1987.c) 熊本海.1998.生长肥育羊瘤胃内VFA产生、吸收规律及模型参数研究.博士学位论文.中国农业科学院.d) 孙海洲.1999.生长肥育羊葡萄糖营养整体优化规律的研究.博士学位论文.内蒙古农业大学.e) 苏鹏程.2003.不同代谢葡萄糖水平日粮条件下白绒山羊体内蛋白质(氨基酸)分配规律的研究.博士学位论文.内蒙古农业大学.f) 韩飞.2002.反刍动物常用饲料丙酸产量和吸收率的测定及其模型化研究.硕士学位论文.内蒙古农业大学.g) 王玲.2003.内蒙古白绒山羊适宜代谢葡萄糖水平的研究.硕士学位论文.内蒙古农业大学.h) 张红瑞.2006.生长育肥绵羊日粮代谢葡萄糖内部POEG与BSEG适宜比例的研究.硕士论文学位论文.内蒙古农业大学.i) 杜瑞平.2006.绵羊瘤胃乙酸和丁酸的产生、吸收规律及可代谢生脂物质（MLS）的测定.硕士论文学位论文.内蒙古农业大学.j) SAS.1984.SAS Users Statistic.SAS Inst, Cary.Nc.k) NRC.1984.Nutrient Requirements of Sheep. National Academy Press, Washington, DC._9