CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性.ppt

厦门大学医学院本科毕业论文 CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性研究 答辩人 罗静指导教师 童卫杭主管药师 主要内容 第一部分研究背景 丙戊酸钠 SodiumValproate VPA 一线抗癫痫药 目前仍无法取代可用于多种类型的癫痫发作 图1 丙戊酸分子结构Fig 1molecularstructureofvalproicacid 研究CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值 CYP2C19最主要的两个突变位点CYP2C19 2 第5外显子681位G ACYP2C19 3 第4外显子636位G A基因型鉴定 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性分析 PCR RFLP PCR 模拟体内DNA复制条件 体外酶促合成特异DNA片段的循环反应 以扩增目的DNA RFLP 某种限制性内切酶特异性识别位点 对DNA切割 基因突变时特异性酶切位点消失 不被限制性内切酶切断 利用电泳检测 观察条带分析基因型 PCR RFLP特点 操作简便 耗时耗费低本实验中将采用准确度受公认的基因测序法验证该法的准确性 第二部分实验方法 一 数据收集2008年9月至2009年4月第二炮兵总医院神经内科 神经外科门诊及住院部服用丙戊酸钠的癫痫患者49例筛选资料齐全的30例记录性别 年龄 体重 治疗药物 治疗剂量 治疗药物血药浓度 合并用药等情况 二 血药浓度检测 荧光偏振免疫法 FIP 美国Abbott公司TDxFLx荧光偏振免疫测定仪及配套试剂盒服用丙戊酸至少5个半衰期 2 2 5天 后 血药浓度达稳态时 于下次服药前 采抗凝静脉血4ml 离心 取上清液 血浆 100 l 进样测定 三 基因型鉴定1 提取DNA 北京QIAGEN公司血液基因组提取试剂盒提取所收集血样DNA北京六一仪器厂DYY II2型电泳仪和电泳槽DNA样品电泳检测紫外灯下判读结果 照相存档2 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 PCR RFLP 2 1PCR反应德国Eppendof公司PCR扩增仪设计并合成CYP2C19引物 CYP2C19 2 前引物F5 AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA 3 后引物R5 ACAAATACGCAAGCAGTC 3 CYP2C19 3 前引物F5 ACTTTCATCCTGGGCTGTGC 3 后引物R5 ACTTCAGGGCTTGGTCAATA 3 建立反应体系 蒸馏水9 l前引物0 5 l 后引物0 5 lHotStarTaqMasterMix12 5 l 包含4种dNTP Mg2 TaqDNA聚合酶 以及Tris Cl KCl缓冲液 DNA模板2 5 lPCR反应条件 CYP2C19 2 94 预变性15min 94 变性40s 51 退火30s 72 延伸30s循环35次 最后72 延伸10min 产物长度458bpCYP2C19 3 94 预变性15min 94 变性30s 56 退火30s 72 延伸30s循环35次 最后72 延伸10min 产物长度233bp PCR产物电泳检测紫外灯下判读结果 目的条带清晰且无非特异扩增者进行下一步实验照相存档 2 2限制性长度多态性 RFLP 美国NewEnglandBiolabs公司内切酶SmaI BamHI酶切反应 CYP2C19 2 用限制型内切酶SmaI30 消化3h SmaI酶切条件 PCR反应产物10ul 水16ul 10 Buffer2ul SmaI2ul CYP2C19 3 用限制型内切酶BamHI37 消化3h BamHI酶切条件 PCR反应产物10ul 水18ul 10 BufferBamHI2ul BamHI1ul 酶切产物电泳检测紫外灯下判读结果 通过条带数目及位置 判断基因型照相存档3 基因测序取前引物6 l 与PCR产物同时送于测序公司分析基因序列四 数据分析Spss12 0standardversion SpssInc 用双侧t检验和 2检验 P 0 05为差异有统计学意义 第三部分实验结果 一 病人一般情况和治疗情况男20例 女10例 男女比例2 1平均年龄33 6 24 60岁 平均体重56 15 18 50kg丙戊酸钠体重剂量范围2 3 27 7mg kg d 平均值为11 74mg 6 10 kg d血药浓度范围7 97 89 96 g ml 平均值为44 59 27 60g ml二 血药浓度监测情况测定血药浓度样品150例次血药浓度有效范围 40 100 g ml低于有效浓度低限共65例次超过有效浓度高限共2例次 三 全血基因组DNA提取与PCR扩增产物1 琼脂糖凝胶电泳显示 提取的基因组DNA条带结果 2 CYP2C19 2 CYP2C19 3PCR扩增结果CYP2C19 2PCR产物长度458bp CYP2C19 3PCR产物长度233bp 目的条带清晰 无非特异性扩增条带 说明PCR扩增较为理想 符合研究要求 四 基因型判定1 限制性片段长度多态性法CYP2C19 2突变位点 681G A当等位基因为681G时 SmaI酶将片断切开成为272bp和186bp两条片断当等位基因为681A时 酶切位点消失 片段不被切开据此分析酶切结果 判断基因型 见图5 GG基因型 也称野生型 272 186bp两条片断GA基因型 也称突变杂合子 458 272 186bp三条片断AA基因型 也称突变纯合子 458bp一条片断 CYP2C19 3突变位点 636G A当等位基因为636G时 BamHI酶将片断切开成为137bp和96bp两条片断当等位基因为636A时 酶切位点消失 片段不被切开据此分析酶切结果 判断基因型 见图6 GG基因型 也称野生型 137 96bp两条片断GA基因型 也称突变杂合子 233 137 96bp三条片断AA基因型 也称突变纯合子 233bp一条片断 2 基因测序法 图7 基因测序图谱 从测序图谱分析 在突变位点只有G峰的 为GG型在突变位点只有A峰的 为AA型在突变位点有G和A双峰的 为AG型 限制性片段长度多态性分析结果与基因测序结果一致两种DNA鉴定方法相互验证 证明所建立的限制性片段长度多态性法准确 可靠 五 等位基因和基因型分布1 基因频率与基因型CYP2C19 2的基因频率与基因型统计结果见下表 CYP2C19 3的基因频率与基因型统计结果见下表 2 双位点基因型理论上应该有九种双位点基因型 CYP2C19 2GG CYP2C19 3GG 纯合野生 无突变 CYP2C19 2GG CYP2C19 3GA 2纯合野生 3杂合子 CYP2C19 2GA CYP2C19 3GG 2杂合子 3纯合野生 CYP2C19 2AA CYP2C19 3GG 2纯合突变 3纯合野生 CYP2C19 2GG CYP2C19 3AA 2纯合野生 3纯合突变 CYP2C19 2GA CYP2C19 3GA 2杂合子 3杂合子 CYP2C19 2GA CYP2C19 3AA 2杂合子 3纯合突变 CYP2C19 2AA CYP2C19 3GA 2纯合突变 3杂合子 CYP2C19 2AA CYP2C19 3AA 2纯合突变 3纯合突变 由于样本量的限制 在此次研究中 只发现了 2GG 3GG 2GA 3GG 2AA 3GG 2GG 3GA 2GA 3GA五种双位点基因型 各基因型频率分布见下表 六 CYP2C19基因型与丙戊酸血药浓度的相关性血药浓度 体重剂量 血药浓度标准化 排除服药剂量和体重对血药浓度的影响进行基因型与血药浓度 体重剂量相关性分析 结果如下1 各种基因型与血药浓度的关系单独分析CYP2C19 2基因位点 血药浓度 体重剂量比值的大小顺序为 GG GA AA单独分析CYP2C19 3基因位点 血药浓度 体重剂量比值的大小顺序为 GG GA带有突变的基因型比值均高于野生基因型 但差异没有统计学意义 见表4 2 各种双位点基因型与血药浓度相关性研究发现 5种双位点基因型中 血药浓度 体重剂量比值大小顺序为 2GG 3GG 2GG 3AG 2AG 3GG 见表5 其中 2AG 3AG和 2AA 3GG都只有1例 2AG 3GG基因型血药浓度 体重剂量比值明显高于 2GG 3GG 其他基因型比值均高于 2GG 3GG 但结果没有统计学差异 第四部分分析讨论 一 关于实验技术的讨论 用于药物代谢酶基因多态性研究的基因分型方法 限制性片段长度多态性 RFLP 分析 基因测序法 单链构象多态性分析 SSCP 变性高效液相色谱 DHPLC 分析 变性梯度凝胶电泳 DGGE 分析 其中 基因测序法结果精准 但费用较高 不适于临床样品常规检测DHPLC法目前已不单独使用 多为结合其他技术作辅助使用 二 关于实验结果的讨论1 基因频率与基因型本研究所得各种基因型与双位点基因型的频率 均与文献报道相似 CYP2C19基因多态性对癫痫患者丙戊酸血药浓度的影响 北大药学院 于洁 邵宏等 基因突变率较高 证实中国人群中研究CYP2C19基因多态性与血药浓度的相关性 有临床研究价值 2 基因型与血药浓度的相关性基于样本量不足 我们对数据进行分析没有统计学差异但在研究中发现 2AG 3GG基因型血药浓度 体重剂量比值明显高于 2GG 3GG 因此可以认为CYP2C19基因多态性影响丙戊酸血药浓度 2GG 3AG的血药浓度 体重剂量比值较之 2AG 3GG 与 2GG 3GG较接近 是因为 3位点上的基因突变率较 2位点的低 在临床使用中 携带 2AG 3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸血药浓度会明显升高 若要达到某一目标血药浓度 携带 2AG 3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸剂量应减少 三 关于下一步实验的设想1 针对目前实验的不足 下一步的工作中可在以下几个方面进行完善 样本量不足 继续收集血样 扩大样本量 进行更广泛深入的研究 相关基因仍有待研究 陆续开展CYP2A6 UGT等与丙戊酸血药浓度相关性研究 未考虑合并用药影响 丙戊酸钠合并用药常为卡马西平 苯巴比妥一类CYP450s诱导剂 影响丙戊酸血药浓度 应纳入研究 未研究不良反应发生率 监察患者不良反应与丙戊酸血药浓度 服药剂量 基因型的关系 2 关于实验的其他设想 在上述工作取得进展后 我认为还可以在如左所述几个方面开展工作 以取得丙戊酸个体化用药研究的新突破 致谢 本文是在临床药学室童卫杭老师的悉心指导下完成的 在此谨对导师的辛勤奉献和热情关怀致以最诚挚的感谢 刘丽宏主任和马萍副主任也对本文进行了严格的督导 丁春雷 雷宁 李鹏飞 吴诚 杨润涛 张晓菲老师在实习期间给予了耐心的教导和无私的帮助 在此表示衷心的感谢 感谢厦门大学领导和老师的教育与培养 为我们提供了良好的学习氛围和文化视野 感谢实习队友张琼娥 林玉香和唐静的陪伴与帮助 谢谢远在家乡的母亲 兄长及各位好友 谢谢他们无私的关爱和支持 厦门大学医学院本科毕业论文 ThankYou 欢迎各位批评与指正