工业微生物产生菌的分离筛选.ppt

微生物工程工业生产水平的三个决定要素 生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备 获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节 菌种分离与筛选工作程序 发酵工业上使用的微生物菌种 最初都是从自然界中分离筛选出来的 分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤 调查研究 包括资料查阅 筛选工作程序 分离与筛选的设计要求 在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标 1 菌的营养特征 一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料 2 菌的生长温度 3 菌的稳定性 4 菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 5 菌对所采用的设备和生产过程的适应性 6 容易从培养液中回收产物 3 6是用来衡量菌种的生产性能 如能满足这几条 便有希望成为效益高的生产菌株 第二章工业微生物产生菌的分离筛选 菌株分离 separation 就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开 并按照实际要求和菌株的特性采取迅速 准确 有效的方法对他们进行分离 筛选 进而得到所需微生物的过程 工业微生物产生菌的筛选 一是从自然界分离所需要的菌株 二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别 收集和筛选的途径 向菌种保藏机构索取有关的菌株 从中筛选所需菌株由自然界采集样品 如土壤 水 动植物体等 从中进行分离筛选从一些发酵制品中分离目的菌株 如从酱油中分离蛋白酶产生菌 从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等 一 含微生物样品的采集二 富集培养三 好氧微生物的分离四 厌氧微生物的分离 本章内容 一 含微生物样品的采集 1 从土壤中采样土壤是微生物的王国 从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株 细菌 108 放线菌 107 霉菌 106 酵母菌 105 藻类 104 原生动物 103 比较复杂 应根据分离目的来进行灵活掌握 1 根据土壤特点采样 土壤有机质含量和通气状况 有机质含量丰富 耕作土 菜园土和近郊土壤 森林土壤 枯枝落叶多的土壤 微生物类群较多 生长旺盛 细菌 放线菌较多 霉菌 酵母菌生产多 采土样最好的土层是5 25cm 土壤酸碱度和植被状况 偏碱的土壤 pH7 0 7 5 环境 适合于细菌 放线菌生长偏酸的土壤 pH7 0以下 环境下 霉菌 酵母菌生长旺盛番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌葡萄或其他果树根部附近土壤中酵母菌数量增多豆科植物根瘤菌 地理条件 南方北方土壤 工业微生物菌种 如抗生素产生菌 尤其是霉菌 酵母菌 大多从南方土壤中筛选出来 原因 南方温度高 温暖季节长 雨水多 相对湿度高 植物种类多 植被覆盖面大 土壤有机质丰富 造成得天独厚的微生物生长环境 季节条件 冬季温度低 气候干燥 微生物生长缓慢 数量最少 春天随着气温的升高 微生物生长旺盛 数量逐渐增加春季往往雨水多 土壤含水量高 通气不良 7 10个月处在较高的温度和丰富的植被下 土壤中微生物数量比任何时候都多 秋季取样最好 2 采样方法 塑料袋编号并记录地点 土壤质地 植被名称 时间及其他环境条件 样品取回后应马上分离 以免微生物死亡 路途遥远或者取样太多 选择性培养基做好试管斜面 2 根据微生物生理特点采样 森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头 富含纤维素 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长 筛选产低温酶的微生物 可从冰窖 南极 深海等采样分离耐高渗透压酵母菌 可到甜果 蜜饯 甘蔗渣堆积处采样 肉类加工厂附近 饭店排污沟 易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶 糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉 火山爆发处 堆肥等采样 油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株 杨尺蠖 鳞翅目尺蛾科 赤松毛虫 侧柏毛虫 二 含微生物样品的富集培养 富集 enrichment 培养是在目的微生物含量较少时 根据微生物的生理特点 设计一种选择性培养基 创造有利的生长条件 使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖 数量增加 由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种 以利分离到所需的菌株 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件 例如 供给特殊的基质或加入某些抑制剂 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素 分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等 需注意 所需菌型生长的结果有时会改变培养基的性质 从而改变选择压力 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上 移植时间是关键 应在所需菌种确已占优势的情况下进行 1 控制培养基的营养成分 环境中含有较多某种物质 则其中能分解利用该物质的微生物也较多 在分离该类菌株之前 可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源 那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖 其他微生物则由于不能分解这些物质 生长受到抑制 分离水解酶产生菌 可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源 加入含菌样品 给目的微生物以最佳的培养条件 pH 温度 营养 通气等 进行培养 能分解利用该底物的菌类得以繁殖 而其他微生物则因得不到碳源无法生长 菌数逐渐减少 此时分离将得到所需的微生物 富集培养时 还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基 如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖 配方为 可溶性淀粉4 酵母浸膏0 5 琼脂2 pH6 5 7 0 特别注意酵母浸膏加量 过多会刺激菌丝生长 而不利于孢子的产生 根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点 可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌 比如 降解高浓度苯胺的微生物分离 环己烷降解菌的分离 2 控制培养条件 pH 温度及通气 富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长 也可排除一部分不需要的菌类 分离放线菌时 可将样品液在40 恒温预处理20分钟 有利于孢子的萌发 可以较大的增加放线菌数目 达到富集的目的 筛选极端微生物时 需针对其特殊的生理特性 设计适宜的培养条件 达到富集的目的 厌氧菌需要特殊的装置 3 抑制不需要的菌类 通过高温 高压 加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量 使目的微生物的比例增加 同样能够达到富集的目的 芽孢杆菌的筛选 芽孢具有耐高温特性 100 很难杀死 要在121 才能彻底死亡 可先将土样加热到80 或在50 乙醇溶液中浸泡1h 杀死不产芽孢的菌种后再进行分离 革兰氏阴性菌 富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠 分离厌氧菌时 可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂 它能使培养基氧化还原电势下降 造成缺氧环境 有利于厌氧菌的生长繁殖 筛选霉菌时 可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌 使霉菌在样品的比例提高 从中便于分离到所需的菌株 三 好气微生物的分离 经富集培养以后的样品 目的微生物得到增殖 占了优势 其他种类的微生物在数量上相对减少 但并未死亡 因此 经过富集培养后的样品 也需要进一步通过分离纯化 把最需要的菌株直接从样品中分离出来 分离方法 一类较为粗放 菌落纯 一类较细的单孢子或单细胞分离方法 菌株纯 细胞纯 透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法 1 稀释涂布法和划线分离法 1 稀释涂布法 2 平板划线分离法 采用无菌操作法 以接种环沾取少许待分离的样品 在无菌平板表面进行平行划线 扇形划线或其他形式的连续划线 如果划线适宜的话 微生物能一一分散 经培养后 可在平板表面得到单菌落 2 利用固体平板的生化反应进行分离 利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的 可显著提高分离效率 透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法 1 透明圈法 分离水解酶产生菌时采用较多 如蛋白酶 淀粉酶 脂肪酶 核酸酶等 在平板培养基中加入溶解性较差的底物 使培养基混浊 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈 圈的大小初步反应菌株利用底物的能力 比如分离淀粉酶产生菌 淀粉作为碳源 例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒 以减少不产芽孢的微生物 然后铺在pH8 9的琼脂培养基 含有均匀的不溶性蛋白质 表面 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质 产生一透明圈 分离某种产生有机酸的菌株时 也通常采用透明圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙 使平板呈混浊状 产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解 形成清晰的透明圈 聚赖氨酸产生菌 带正电 加美兰 排斥呈现透明圈 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比 但作为初筛的手段是有意义的 2 变色圈法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌 可在底物平板中加入指示剂或显色剂 使目的微生物菌落周围呈现变色圈 从而能被快速鉴别出来 用含0 2 果胶为唯一碳源的培养基平板 对含微生物样品进行分离 待菌落长成后 加入0 2 刚果红溶液染色4h 具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈 如筛选果胶酶产生菌 甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈 又如分离解脂微生物 吐温为底物 尼罗红作指示剂 豆油作底物中性红 红 黄 6 8 8 0 指示菌落周围呈红色圈 内肽酶产生菌的分离筛选 酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别 吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基中 产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3 羟基吲哚 后者能氧化生成蓝色产物 根据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落 分离乳糖酶产生菌产乙醇菌株的分离筛选 糖为碳源 覆盖一层含有盐类的琼脂 蓝色物质在醇脱氢酶和NAD作用下 电子脱色 生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈 3 生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸 核苷酸和维生素的产生菌 将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养 若某菌株能合成平板所需的营养物 在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈 工具菌 指示菌 是一些相对应的营养缺陷型菌株 如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板 在其上涂布含菌样品保温培养 周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌 只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时 都可采用生长圈法 工具菌用相应的营养缺陷型菌株 由于得到所需营养 凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈 4 抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛选 据估计 筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌 因此 设计一个准确 快速的筛选模型十分重要 抑菌圈法是常用的初筛方法 工具菌采用抗生素的敏感菌 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质 如抗生素等 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈 在青霉素菌种选育中 还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株 做法如下 将产黄青霉孢子进行诱变处理 致死率约为99 分离于琼脂平板上 控制孢子浓度 使长成独立菌落 一直培养到青霉素产量达到顶峰 加入0 106U mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中 铺张于菌落平板表面 凝固后 培养17 20h 测量抑菌圈大小 根据有效指标 抑菌圈直径于菌落直径之比 选出高产突变株 检验菌 抗生素种类多样 得到新的抗生素越来越困难极端环境中采样分离抗生素的产生菌 也采用一些特殊的筛选方法抑菌圈外 稀释法 扩散法 生物自显影法检验菌的选择十分重要 直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素的活性和抗菌谱 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 从土壤到海洋 海洋是新抗生素的重要来源 许多海洋生物体内都含有微生物 这些微生物为宿主抵御病害起着关键作用 因此 从鱼组织和虾消化道里分离筛选抗癌药物和抗炎症药物是一个有效地途径 已从水母体内筛到一种名为salinamide的抗生素 一种抗真菌抗生素istatin也从海洋生物体中分离出 3 组织分离法 组织分离法是由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法 如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉素 从根瘤中分离根瘤菌及从各种食用菌的子实体中分离孢子等 1 对一般有病组织的分离方法 有病组织 切除小块含菌组织 用干净水洗去组织表面污物 以10 漂白粉或0 1 升汞浸泡2 5分钟进行表面消毒 无菌水冲洗 将消毒后的组织移到平皿培养基上 置于适宜温度 25 26 培养一定时间 即可在组织周围四长出微生物 用肉眼或显微镜观察菌落 基本确认后挑入斜面培养基中培养 由这种方法挑选的菌株往往不纯 必须在琼脂平板上再分离纯化 然后挑取单个菌落于斜面 进一步筛选 根瘤菌 取新鲜健壮的根瘤 经漂白粉或升汞溶液等进行表面消毒后 用无菌镊子将根瘤压破 取出汁液少许与分离培养基混合倒入平皿中 摊平 培养后在平板上长出菌落 经镜检观察后确认典型菌落 移入斜面 2 食用菌孢子分离法 1 多孢子分离法 成熟的初生和单生子实体 0 1 0 2 升汞 75 的酒精 孢子采集 培养基上培养 生产性能对比试验 2 单孢子分离法 孢子收集器移到恒温室内培养1 2天 将有大量孢子弹到平皿上 收集孢子 将收集到的孢子用稀释法在马铃薯 蔗糖培养基平板上进行单孢子分离 培养后把单孢子长出的菌落移接到斜面上 进行生产性能比较试验 4 随机分离方法 有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处 因此常随机地分离所需菌种 为此发展了一些快速筛选方法并归纳出高产培养基成分的选择准则如下 1 制备一系列的培养基 其中有各种类型的养分成为生长限制因素 2 使用一聚合或复合形式的生长限制成分 3 避免使用容易同化的碳 如葡萄糖 或氮 如NH4 它们可能引起分解代谢阻遏 4 确定含有所需的辅因子 如Co2 Mg2 Mn2 Fe2 5 加入缓冲液以减少pH变化 5 通过控制培养和培养条件进行分离 各种微生物对营养要求和培养条件是不同的 在分离筛选时若在这两个方面加以调节控制 就能获得更好的分离效果 1 培养基的营养成分 各种微生物对碳源 氮源要求各异 设计一个合理快速的分离培养基 能够收到事半功倍的效果 放线菌 用改良的HV琼脂培养基 土豆 胡萝卜水汁液培养基和淀粉琼脂培养基能取得较好的效果水解酶产生菌 淀粉为碳源的培养基可鉴定菌落能否产生淀粉酶 一种含纤维素粉为碳源的分离培养基 可以鉴别纤维素酶产生菌 用含有酪蛋白为有机氮源的平板培养基 可以鉴别蛋白酶的产生菌 2 培养基的pH 细菌 放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱 霉菌和酵母菌要求偏酸 因此 分离培养基的pH应该调节到被分离微生物要求范围 柠檬酸产生菌碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌培养基的pH要结合营养成分和培养条件来考虑 3 排除不需要的菌类 为了更有效地抑制非目的微生物的生长 要加入一些专一性的抑制剂 分离细菌时 在培养基中加入浓度为50U ml制霉菌素 可以抑制霉菌和酵母菌的生长 分离放线菌时 在样品中加入SDS 抑制细菌的生长 还能激活放线菌孢子的萌发分离霉菌和酵母菌时 在培养基中加入青霉素 链霉素和四环素各30U ml 可以抑制细菌和放线菌生长 分离根霉和毛霉时 去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延 4 控制培养温度 高温微生物 最适温度在50 60 中温微生物 它们的最适生长温度是20 40 超过50 就停止生长 细菌 放线菌最适温度为25 37 霉菌和酵母最适温度为20 28 低温微生物 它们的最适温度为15 或更低 6 一些生物活性物质产生菌的分离 抗生素抗肿瘤药物酶抑制剂生长因子等等 抑菌圈法 扩散法 生物自显影法等 试验菌的选择是关键 关系到灵敏度 活性 抗菌谱等 采用联合试验菌 枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌 分离到黄霉素 采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用机制相关的酶 酶抑制剂 激活剂等建立的筛选技术如棒酸 clavulanicacid 的发现 通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对 内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用 1 抗生素产生菌的分离 临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 现发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法 如生化诱导分析法 2 抗肿瘤药物产生菌的分离 生化诱导分析法 Biologicalinductionanalysis BIA 将E colilacZ连接在 噬菌体的PL启动子下 当DNA损伤时 诱发 阻遏蛋白CI分解 PL启动子启动lacZ基因转录 表达出 半乳糖苷酶 测定 半乳糖苷酶活性 可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在X Gal 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl D galactopyranoside 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 作显色底物 反应后呈蓝色 3 酶抑制剂产生菌的分离 某些酶与病理相关 如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶 它就可能在体内有药理作用 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶 靶区靶酶抗高血压血管紧张素转移酶抗糖尿病 淀粉酶 蔗糖酶等抗血脂症缩合酶抗组氨组氨酸脱羧酶 组氨 N 甲基转移酶 4 生长因子产生菌的分离 通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长 来检测生长因子产生菌 分离培养基上培养 被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈 四 厌气微生物的分离 好气菌要在有氧条件下培养 嫌气菌要在厌氧状况下才能生长 丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌 白酒增香用的丁酸菌 己酸菌及用于环境污水处理和水产养殖用的光合菌 反硝化菌 脱氮排硫杆菌等 它们生长于水底层及沉积物中 要从样品中分离这类菌 需采取厌气培养法 否则菌体因接触氧气而死亡 因此 培养过程中要除去氧气 1 加还原剂法 分离培养基内加入还原剂 如半胱氨酸 D型维生素C 硫化钠等 操作时以最快的速度划线分离 然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内 充CO2或N2也可 于室温培养 2 焦性没食子酸法 焦性没食子酸和NaOH互相反应除去氧气 操作时 先将焦性没食子酸放在容器中 把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内 然后加入NaOH溶液 立即盖上盖子 并用石蜡或凡士林密封 放到室温下培养 要除去100ml空气中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10 NaOH溶液10ml 3 平皿厌气培养法 取无菌培养皿一套 在皿盖内到上分离培养基 凝固后 皿底一侧放焦性没食子酸固体 另一侧放10 NaOH溶液 使二者不相接触 准备完毕 在凝固的琼脂平板上迅速把含厌氧菌样品进行划线 然后盖上皿盖并密封 摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混合 发生化学反应 除去皿内的氧气 置适宜温度下进行培养 4 试管厌气培养法 两头开口的玻璃管橡皮塞密封穿刺法接种 5 生物吸氧法 燕麦 举例 红螺菌的分离 富集培养 取暴露在日光下富含有机物的淤泥 放适量淤泥于50ml的带玻璃塞的磨口瓶中 加满液体培养基 塞好塞子 隔绝空气 置于30 的照明箱中培养 通常在3d内可看到深处培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红色的生长物 从微红色处取数毫升的富集培养物 接种于第二瓶的富集培养基中 培养2d 分离培养 培养基成份和配置 接种 取富集培养物于分离平板上划线或涂布分离 或用摇管法于柱状培养基中分离 举例 反硝化细菌的分离 富集培养 在富集培养液的试管中分别加少量的海泥或池泥 河泥 在20 或25 30 下培养5 15d 分离培养 将培养液倾入硅酸胶平板上 用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上 于适温 厌氧条件下培养至长出足够大的菌落 五 野生型菌株的筛选和鉴定 初筛 平板筛选 摇瓶发酵筛选 复筛 琼脂平板活性测定法菌株鉴定 经复筛 目的野生菌株获得后 对菌株要进行鉴定 六 极端环境微生物的分离筛选 采集样品 根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样样品的富集培养 选择性培养基 创造有利的生长条件 使目的微生物在最适的环境下迅速生长 菌株分离 嗜热菌是一种耐高温的需氧或厌氧菌 在分离嗜热菌时 往往为了防止固体平板水分蒸发过快 使培养基破裂 可以通过增加培养平板的厚度和增加培养基中琼脂的含量来降低水分的蒸发 选育方法 微生物的自然选育 作业 1 简述微生物样品采集的具体过程 2 叙述微生物富集需采取的措施 3 简述利用平皿中的生化反应进行微生物分离的方法 完 Thankyou Seeyounext