感染性疾病的分子诊断.ppt

第八 九章感染性疾病的分子诊断 感染的慨念 感染是病原体和人体之间的相互作用过程病原微生物 致病菌 条件致病菌 微生物 人体 微生物 人体 不同的感染状态 共生状态 在正常情况下 人体的一些腔道和体表均有微生物寄生 感染性疾病 由某种病原体所致 通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病 病原体 病毒 细菌 原虫 支原体 衣原体 立克次体 螺旋体 寄生虫 常规检测方法 免疫学方法微生物学方法受敏感性 特异性限制 不易早期诊断 并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息 感染性疾病的分子诊断策略 一般性策略 检出病原体 判断有无感染是何种病原体感染常用方法 PCR 杂交完整性策略 检出病原体分型 分类 亚型 耐药性常用方法 杂交 PCR 基因芯片 DNA测序 感染性疾病分子诊断标志物 病原体核酸分子 DNA RNA 基因表达产物代谢物免疫应答分子 二 感染性疾病分子诊断的常用方法 根据目的基因是否被放大 可分为杂交法和扩增法 信号放大技术检测方法靶分子数目不变 而检测的探针信号放大采用多酶 多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大 靶分子扩增技术检测方法靶分子 RNA DNA或探针 的扩增PCR 替代扩增 LCR等 图8 3NASBA原理示意图 引物A5 端带有T7RNA聚合酶结合位点 3 端碱基与靶RNA3 端序列互补 引物B的碱基序列与cDNA3 端序列互补 nucleicacidsequence basedamplification NASBA NASBA的特点为操作简便 不需特殊仪器 不需温度循环 整个反应过程由三种酶控制 循环次数少 忠实性高 其扩增效率高于PCR 特异性好 图8 3NASBA原理示意图 引物A5 端带有T7RNA聚合酶结合位点 3 端碱基与靶RNA3 端序列互补 引物B的碱基序列与cDNA3 端序列互补 nucleicacidsequence basedamplification NASBA NASBA的特点为操作简便 不需特殊仪器 不需温度循环 整个反应过程由三种酶控制 循环次数少 忠实性高 其扩增效率高于PCR 特异性好 三 感染性疾病分子诊断的标本处理 标本采集处理主要包括选择合适的标本种类 标本量 抗凝剂等及对标本进行合适的传送 保存和预处理 四 感染性疾病分子诊断的结果解释 1 阴性结果假阴性可能性方法的灵敏度太低方法失败目标分子2 阳性结果假阳性可能性方法的特异性受到污染 3 定性检测结果有时不能提供病原体活力相关信息临床治疗病情缓解后一定时间内 在患者样本中仍可以检测出相应的病原体 有些病原体潜伏在进体内 没有临床症状 4 疾病状况的判断检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因 该病原体可能是一种正常菌群 五 感染性疾病分子诊断的临床应用及评价 用于感染性疾病治疗的监控和预测 病情发展过程的危险性评价及疾病预后等 耐药性的检测细菌的分型流行病调查 第一节病毒的基因检测 人类许多感染疾病由病毒引起 如病毒性肝炎 脑炎 流行性感冒等等 占人类传染疾病的75 左右 400多种不同病毒 病毒结构 大小 20 300nm核心区 核酸 DNA或RNA 外周衣壳 蛋白质包膜 脂质 镶嵌有蛋白质 我国是HBV高流行区 50 70 的人受过感染 8 10 是HBV携带者 肝炎患者中60 是慢性肝炎患者 导致肝硬变 HBV又与原发性肝癌密切相关 外壳 HBsAg 外壳蛋白成分为表面抗原核心 HBcAg DNADNA聚合酶HBcAg 一 乙型肝炎病毒 Dane颗粒 完整的病毒 形态 完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的 核心直径为27纳米 内含DNA双链和DNA多聚酶 一 病毒基因组结构 3 2kb双链DNA病毒不完全双连环状DNA长链L为负链 有4个开放阅读框S C P XS区编码外膜蛋白 HBsAg C区编码HBeAg HBcAgp区编码DNA聚合酶X区位编码X蛋白 可能与病毒蛋白表达有关 短链S为正链 长短不一 pre s1 pre s2 S P C pre c X HBVDNA3 2kb pre S1pre S1蛋白pre S2pre S2蛋白SHBsAgpre CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg HBV基因组结构 HBV基因分型 HBV基因序列差异的多少 可将HBV划分为不同的基因型 至今为止已发现A B C D E F G H共8种基因型 A型主要存在于白人 B型和C型主要存在于亚洲人群E型主要存在于西非F型仅见于中南美洲的土著人G型和H型很少见不同基因型序列长度不同 主要是前S1区的不同 我国流行的主要是B和C基因型 长江以北以C型为主 长江以南以B型为主 另又少量的A型 D型和混合型 西北和西南尤其是西北有较高比例的D型 HBV在肝细胞内的复制 A n mRNA cccDNA HBsAg包膜 负链DNA 包裹后的前基因mRNA 传染性HBV病毒颗粒 传染性HBV病毒颗粒 部分双链DNA 逆转录酶 DNA聚合酶 肝细胞 二 分子诊断 常用的免疫学检测方法 即二对半的检测存在窗口期 不易早期诊断 1 PCR采用普通PCR FQ PCR 竞争性PCR 免疫杂交PCR 可提供直接 准确的病原学诊断证据 引物是根据S C P X基因中高度保守序列设计 决定扩增的特异性和敏感度 扩增位置引物序列扩增片断 bp P X基因5 ATACTGCGGAACTCCTAGC 3 2785 CCGCGTAAAGAGAGGTGCG 3 C基因5 ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT 3 4775 AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC 3 C基因5 GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA 3 2585 ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA 3 有时为了证实扩增产物的特异性 对扩增产物进行以下分析 RLFP斑点杂交Southern杂交 2 支链DNA信号放大技术 bDNA 原理 捕获探针检测 靶探针1体系 靶探针2 bDNA分子 DNA主链上结合多个侧链 捕获探针固化在微孔板上靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交形成复合物 固相支持物 捕获探针 靶探针1CEs 待测核酸 靶探针2LEs bDNA复合物 分支链DNA信号放大技术 bDNA 信号检测 bDNA可结合很多酶标探针 酶催化底物 1 2 二恶二酮 dioxetane 发光 使核酸信号放大 且发光强度与DNA量成正比 优点 放大倍数确定阳性检出率高稳定性和可重复性好操作简便 省时 易于普及 3 基因芯片技术标本经PCR扩增后与芯片上的特异探针进行杂交 可以检测 是否有病毒感染感染病毒的种类及亚型病毒的耐药情况特点 可同时进行大量标本的检测 近年来陆续上市的核苷 酸 类似物对HBV的治疗压力集中在P区 干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C C区及前S区 HBV耐药突变 lamivudine adefovir entecavir telbivudine YMDD 酪氨酸 蛋氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 HBV对拉米夫定耐药是HBVDNA聚合酶突变所致 耐药基因位点 YMDD 位于聚合酶的C区 rtM2041或rtM204V 分别是YMDD中的蛋氨酸 M 被异亮氨酸 I 或缬氨酸 V 所替代 形成YIDD或YVDD变异 拉米夫定作用靶位为HBVDNA聚合酶C区 有研究表明 拉米夫定与HBV逆转录酶的亲和力与位于第552位氨基酸侧链长度有关 异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸 使侧链氨基酸长度缩短 使逆转录酶dNTP结合区增大 不适于拉米夫定结合 从而诱发耐药性 HBV耐药检测 YMDD突变检测方法 YMDD突变检测方法 1 基因测序法2 荧光定量PCR方法基本原理确定探针特定的TM值来区分是否突变常用方法覆盖突变位点荧光双探针杂交 YIDDYMDDYVDD 46 91 54 64 50 74 三 临床意义 1 早期诊断免疫学检测敏感性 0 1 g ml核酸杂交检测敏感性 0 1pg mlPCR检测 0 1fg ml因此 在感染早期即可通过DNA检测证实病毒的存在 2 监测治疗效果 HBVDNA 107拷贝 ml提示病毒复制活跃 HBVDNA 104拷贝 ml治疗有一定疗效 HBVDNA 103拷贝 ml HBeAg阴转 转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标 3 判断病情 指导制定合理的治疗方案 4 病毒耐药性的检测乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是病毒产生耐药性的重要原因 通过监测YMDD的突变情况 可以获得病毒耐药性方面的信息 指导抗病毒治疗 二 流行性感冒病毒流行性感冒病毒 Influenzavirus 是引起流行性感冒的病原体 分为甲 A 乙 B 和丙 C 3个型别 根据病毒颗粒表面血凝素 Haemagglutinin HA 和神经氨酸酶 Neuramiridase NA 的抗原性 甲型流感病毒又可分为不同的亚型 甲型流感病毒易发生变异 致病力强 1918年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人 即是由甲型流感病毒引起 Thereare16differentHantigens H1toH16 andninedifferentNantigens N1toN9 一 流感病毒基因组结构单链RNA病毒 RNA为负链 有8个RNA片段或7个RNA片段 所有RNA片段5 末端和3 末端高度保守 两种不同亚型病毒感染宿主时 会生成基因重配的新病毒 RNA基因在复制过程中常会发生点突变 二 分子诊断方法可采用RT PCR FQ PCR检测流感病毒RNA 引物常按流感病毒保守的非结构基因 NS 的序列进行设计 为证实PCR扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度 可用限制性内切酶分析法 斑点杂交法 Southern印迹法进行扩增产物的分析 扩增位置引物序列扩增片段大小NS基因5 AAGGGCTTTCACCGAAGAGG 3 190 bp 5 CCCATTCTCATTACTGCTTC 3 NS基因5 ATGGCCATCGGATCCTCAAC 3 241 bp 5 TGTCAGCTATTATGGAGCTG 3 三 临床意义流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验 这些方法比较费时 灵敏度低 难以作出早期诊断 PCR法敏感 特异 简便 快速 并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查 三 人类免疫缺陷病毒 HIV HIV humanimmunodeficiencyvirusAIDS acquiredimmunodeficiencysyndromeHIV为艾滋病的病原体 现已发现引起艾滋病的病毒有HIV 1 HIV 2 HIV 3三种 1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为3 340万 已死亡1 390万 是全球十大主要死因之一 最外层为囊膜 双层脂蛋白 是病毒识别攻击宿主细胞所必不可少的 其内为核衣壳 2 基因组结构逆转录病毒 两个拷贝的单股正链RNA 每个RNA长约9 7Kb 有5 帽 3 端有多聚尾 HIV是一种高度变异的病毒 含有gag env和pol三个基因以及6种调控基因tat vif vpr vpx nef rev gag基因编码病毒的核心蛋白 pol基因编码病毒复制所需要的酶类 逆转录酶 整合酶和蛋白酶 env基因所编码病毒包膜蛋白 是HIV免疫学诊断的主要检测抗原 调控基因编码辅助蛋白 调节病毒蛋白合成和复制 二 分子诊断方法 抗体的检测 酶联免疫吸附法 ELISA 和免疫荧光检测法 IFA 感染2周后才能逐渐产生病毒抗体 抗原的检测 酶联免疫吸附法 ELISA 检测P24抗原 灵敏度低 1 病毒载量检测感染者体内HIV的定量检测 对病情判断和治疗效果检测极有价值 目前常用三种技术 RT PCR最低检测限50拷贝 mlbDNA最低价测限50拷贝 mlNASBA最低检测限20拷贝 ml PCRRNA逆转录cDNA整合到宿主基因组中复制 以被感染细胞DNA为模板PCR扩增 HIV为高变异病毒 不同患者体内分离的病毒基因结构有差异 引物设计应根据各编码区的保守序列设计 灵敏度高 特别是用于无症状HIV感染者 扩增位置引物序列扩增片断 bp gag基因5 GAACTTTAAATGCATGGGTAAA 3 3425 CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA 3 gap基因5 ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC 3 1155 TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC 3 pol基因5 TAGAATTCCTCAGATCACTCTT 3 3605 GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC 3 2 病毒表型和耐药检测 HIV表型主要依据逆转录酶和蛋白酶基因突变的检测最常用的耐药检测方法是基因型检测方法 即查找与病毒耐药有关的基因突变 检测病毒逆转录酶 RT 和蛋白酶 PI 基因的序列 然后把这些结果与已知的没有发生突变的HIV 称为野生株 基因序列进行比较 与之不同的基因序列就认为发生了突变 检测出的任何突变都有可能导致形成HIV耐药性 但具体结果的解释必须要有非常有经验的专家和医师来进行 三 临床意义 1 原位杂交 可以显示病毒感染的部位 2 PCR 可对无症状的感染者进行早期诊断 3 病毒载量检测 在临床进展情况的判定及疗效观察上极有价值 第九章 细菌感染的分子生物学检验 概述正常菌群 存在于人体表及与外界相通部位的细菌 条件致病菌 正常菌群与人体平衡破坏 引起疾病的一类细菌 病原菌 具有毒性和侵袭力的细菌 造成人体感染 病原菌的诊断方法 直接涂片法 生化试验 血清学试验 分离培养 动物实验 分子生物学 灵敏 特异 可进行早期诊断 分型 耐药性检测 不能确诊或进行分型 耐药性的检测 或费时等 全世界1 5人口感染 每年约300万死于结核 中国占70 免疫低下个体特别是HIV感染者更易于感染结核分枝杆菌 结核分枝杆菌为革兰氏阳性菌 细长略带弯曲 分枝状 有荚膜 抗酸染色阳性 对多种抗生素有抵抗力 一 结核分枝杆菌 形态 一 基因组结构1 TBH37Rv株基因组是环状双链DNA 共有4411529bp 2 共有4033基因 功能已知的有1734个 1694个可能为新基因 3 基因组中有许多药物抗性因子的编码序列 包括水解酶或者药物修饰酶 二 分子诊断方法普通PCR FQ PCR 竞争性PCR 免疫杂交PCR扩增靶序列 65KDa抗原基因 细菌细胞壁上蛋白 MPB蛋白基因 结核杆菌复合群特有 rRNA基因 种属鉴定 ISDNA6110插入序列 靶序列引物序列扩增片断 bp IS6110插入5 CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG 3 3175 TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA 3 16SrRNA5 GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC 3 4635 TGCACACAGGCCACAAGGGA 3 DNA重复序列5 CGTGAGGGCATCGAGGTGGC 3 2455 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA 3 TB耐药检测 利福平耐药 RNA聚合酶rpoB基因异烟肼耐药 katG基因链霉素耐药 S12的rpsL基因16SrRNA的rrs基因喹诺酮的耐药 DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或药物修饰酶 内酰胺酶 氨基糖苷乙酰基转移酶和药物外排系统等 细菌耐药基因的检测 细菌耐药性的产生导致治疗失败 感染复发 增加昂贵抗生素的使用 机理 由于细菌基因组的变异 导致1 细菌细胞外膜通透性改变 2 产生灭活酶和钝化酶 如 内酰胺酶 3 药物作用靶位改变 4 代谢途径改变 三 临床意义 1 准确 快速 早期诊断TB2 区分TB与其它分枝杆菌3 疫情监控和抗痨治疗疗效的评价 二 淋球菌 淋球菌是淋病的病原菌 人是淋球菌的唯一自然宿主 淋病在我国性传播疾病种中 发病率居首位 淋球菌耐药菌株的出现和流行对淋病的控制带来很大困难 传播途径 1 直接性接触感染2 间接接触感染 一 基因组结构1 染色体分子量980M 可编码约5000个基因 GC含量为50 2 无操纵子结构3 含有1至数个质粒 2 6MDa 24 5MDa 通过质粒介导耐药性在不同菌株间的转移 二 分子诊断 1 PCR 扩增的靶序列 编码外膜蛋白 的结构基因 或16SrRNA基因 CPPB基因 同时存在于染色体及质粒上 靶序列引物序列扩增片断 bp CPPB基因5 GTTTGGCTGGTTGATTCAAG 3 6335 GCAAGATTTCCGATTTGGCG 3 外膜蛋白 5 TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG 3 4945 TTTTCACATCTACGCGGCGG 3 5 CCGAAGCTCAAGACAACCTC 3 181 2 LCR Ligasechainreaction 连接酶链反应 Ligasechainreaction LCR 是一种新的DNA体外扩增和检测技术 主要用于点突变的研究及靶基因的扩增 原理 在PCR反应体系中加入二对引物 加热 94 95 使DNA变性 双链打开 然后降温退火 65 引物与模板DNA结合并留下一缺口 如果引物与模板完全互补 DNA连接酶即连接封闭缺口 PCR反应接着进行 扩增出大量的目标DNA 若有点突变 引物不能与模板精确结合 缺口附近核苷酸的空间结构发生变化 连接酶不能封闭缺口 PCR反应不能进行 无扩增产物生成 据此可判断模板DNA中有无突变 三 临床意义1 分子诊断技术具有灵敏性高 快速 特异性好的优点 可检测极微量的淋球菌 2 应用于以下几方面 对菌株进行分型和耐药性分析 抗生素治疗效果的观察 进行流行病学分析 对疑似病例的诊断和鉴别诊断 衣原体的基因检测衣原体是介于立克次氏体与病毒之间 能通过细菌滤器 专性活细胞内寄生的一类原核生物 沙眼衣原体是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体 常导致人泌尿生殖道疾病及眼病 有15种血清型 一 基因组沙眼衣原体 血清型D 基因组大小1042Kbp GC含量为41 3 另有一个7493bp的质粒 整个基因组有894个蛋白编码基因 其中604个 68 编码蛋白的功能已明确 35个 4 编码基因在GenBank收录的其他细菌中有同源序列 但功能不清 剩下的255个 28 在GenBank中没有检索到同源序列 二 分子诊断1 PCR扩增靶序列主要有外膜蛋白 MOMP 基因 特有质粒DNA和rRNA基因序列 rRNA基因5 GAAGGCGGATAATACCCGCTG 3 5 GATGGGGTTGAGCCATCC 3 MOMP基因5 GATAGCGAGCACAAAGACTAA 3 5 CCATAGTAACCCATACGCATGCTG 3 2 LCRLCR的扩增效率与PCR相当 其产物的检测也较方便灵敏三 临床意义沙眼衣原体感染常缺乏特异症状 易形成隐匿感染 分子诊断技术敏感性和特异性高 适用于早期诊断和无症状携带者的检查 支原体的基因检测 肺炎支原体 mycoplasmapulmonis MP 是原发性非典型肺炎的病原体 一 基因组结构肺炎支原体M129株基因组有816394bp G C含量为40 含677个开放阅读框 39个RNA编码基因 二 分子诊断方法1 PCR扩增靶序列常选在16SrRNA基因组可变区与保守区 特异的染色体DNA片段 P1蛋白基因区 2 核酸杂交特异的寡核苷酸探针与样品DNA进行斑点杂交 特异性好 但灵敏度不如PCR法 三 临床意义因肺炎支原体与其他支原体存在共同抗原 免疫学方法检测可出现假阳性和假阴性 PCR方法简便快速 特异 敏感 适于早期快速检测MP 螺旋体的基因检测梅毒螺旋体 syphilisspirochete 是人类梅毒的病原体 一 基因组结构基因组大小约1000kb 为最小的原核基因组之一 GC含量为52 8 共有1041个开放阅读框 占整个基因组的92 9 每个ORF的平均大小为1023bp 二 分子诊断方法1 PCR扩增的靶序列有tpp47 bmp tpf1 tyf1 tmpA等基因 2 核酸杂交用同位素或非同位素 如生物素 地高辛 标记的探针与待测标本的DNA或扩增后的DNA进行斑点杂交 三 临床意义血清学试验对早期梅毒诊断不敏感 对先天性和神经性梅毒的诊断特异性差 分子诊断的方法可早期诊断梅毒感染的病人 尽早根治梅毒 思考题 感染性疾病分子诊断的临床意义乙型肝炎病毒的基因组结构及分子诊断