-肿瘤免疫治疗临床应用及进展

肿瘤免疫治疗临床应用及进展 肿瘤生物治疗学基础与临床 教学目的与要求 熟悉肿瘤免疫治疗的策略和方法认识免疫治疗在肿瘤综合治疗中的地位和作用了解肿瘤免疫治疗的最新进展 一 肿瘤的免疫治疗 基本原理 提高肿瘤抗原免疫原性 激发和增强机体抗肿瘤免疫应答 提高肿瘤对抗瘤免疫效应的敏感性 在体内外诱生肿瘤特异性效应细胞和分子等 抗肿瘤免疫治疗包括主动免疫治疗 被动免疫治疗 1 干扰素1 I型干扰素 由单核巨噬细胞 病毒诱导的成纤维细胞 转化的B细胞产生种类 IFN IFN IFN IFN 等作用 抑制肿瘤细胞周期 诱导细胞凋亡调节免疫反应感染肿瘤血管生成其它作用 抗病毒2 II型干扰素 由活化的T细胞 原始的Th0细胞和NK细胞产生种类 IFN 作用 激活巨噬细胞 NK细胞等直接杀伤癌细胞延长细胞周期 抑制肿瘤细胞的生长和增殖促进MHC I II类分子和抗原递呈细胞尚共刺激分子的表达在干扰素的调节下 IFN 可诱导Th0向Th1分化 抑制向Th2分化 增强细胞免疫和CTL的杀伤活性临床药物 基因工程产品 已国产化 干扰灵 赛若金 因特芬 派罗欣 一 细胞因子治疗 适应症 干扰素主要用于治疗晚期毛细胞白血病 肾癌 黑色素瘤 kaposi肉瘤 慢性粒细胞性白血病和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤 其他曾用于骨肉瘤 乳腺癌 多发性骨髓瘤 头颈部癌和膀胱癌等 对慢性乙 丙型肝炎也有效 用法 第1周300万单位 皮下注射 每周2 3次 第2周每次加到500 600万单位 第3周加到900 1000万单位连续6周 共8周为1疗程 干扰素亦可局部注射 瘤周浸润 腔内注射 癌性胸腹腔积液 或膀胱内灌注 毒副作用 高剂量干扰素具有一般生物制剂的反应即发热 流感样症状 肌肉酸痛等 其次是轻度骨髓抑制 一般对肝肾功能无影响 少数有转氨酶 血肌酐升高 2 白细胞介素 2 IL 2 来源 主要由激活的T淋巴细胞分泌和表达 此外NK 转化的B细胞和LAK细胞也可产生作用 促进T细胞增殖及相应的细胞因子分泌 刺激NK生长并增强其杀细胞活性 诱导LAK NK TIL扩增及细胞因子的分泌 促进B细胞分化 增殖和产生抗体 参与机体的炎症反应 抗肿瘤免疫反应和移植排斥反应临床药物 基因工程IL 2欣吉尔 德路生 远策欣 适应症 用于肾细胞癌 黑色素瘤 乳腺癌 膀胱癌 肝癌 直肠癌 淋巴瘤 肺癌等恶性肿瘤的治疗 用于癌性胸腹水的控制 用于手术后 放疗及化疗后的肿瘤治疗 可增强机体免疫功能 也用于自身免疫性疾病和病毒性 细菌性疾病的治疗 如乙肝 结核病 用法 1 胸腹腔注射100 200万IU 次 每周1 2次 2 4周为一疗程 2 局部注射根据癌灶大小决定剂量 每次每个病灶不少于610万IU 隔日1次 4周为一疗程 3 皮下注射60 100万IU m3 每日1次 每周5次 4周为一疗程 4 静脉滴注40 80万IUIU m3 每日1次 缓慢滴注 每周5次 4周为一疗程 毒副作用 治疗中常见副反应为发热 寒战 乏力 恶心 轻度食欲下降等 其他少见的副反应包括局部反应 皮疹 血压下降 水潴留 转氨酶升高等 这些副反应多为轻度 易耐受 停药后可自行缓解 必要时可给与消炎痛或给予升压等措施对症处理 3 IL 12主要是由抗原呈递细胞 如单核巨噬细胞 树突细胞及B淋巴细胞产生 作用 诱导Th0分化为Th1 增强细胞免疫应答 促进NK T细胞增殖 诱导LAK TIL产生 并增强上述细胞的杀伤功能 诱导Th1 NK分泌IFN 促进巨噬细胞分泌一氧化氮 杀伤肿瘤细胞 抑制肿瘤血管的生成 增强肿瘤细胞表达MHC III类分子 提高肿瘤细胞对免疫效应细胞的易感性 增加抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈功能 动物试验 应用基因工程技术 将IL 12基因导入肿瘤细胞 树突细胞 成纤维细胞等 制成肿瘤疫苗 使IL 12在局部分泌 诱发机体的抗肿瘤免疫 临床试验 重组人 rHu IL 12治疗慢性乙型肝炎 效应与剂量相关 但较大剂量较易有不良反应 IL 12能恢复由实体瘤转移患者PBMC获得的NK细胞活性 IL 12还能增强毛细胞白血病患者NK细胞活性 IL 12抗肿瘤作用 4 IL 4主要由活化的T淋巴细胞 特别是Th2细胞 产生 作用 促进休止期的B细胞活化 促进B细胞分泌IgE 增加B细胞的抗原递呈功能 促进体液免疫应答 维持胸腺细胞和活化T细胞的生长 诱导Th2产生 抑制Th1分泌细胞因子 诱导NK细胞增殖 激活巨噬细胞 促进其抗原递呈和杀伤肿瘤细胞的作用 诱导外周血单个核细胞分泌M CSF和G CSF 增强中性粒细胞介导的吞噬 杀伤功能和抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应 ADCC 应用 主要用于DC细胞的诱导 扩增 5 肿瘤坏死因子TNF1 TNF 主要来源于LPS 细菌DNA等抗原分子激活的单核巨噬细胞 其它细胞如T淋巴细胞 B淋巴细胞等产生的 作用 影响免疫反应过程 影响非免疫细胞 促进细胞因子分泌 调控细胞凋亡 全身反应2 TNF 主要由Th1 CD8 T细胞和早期的B细胞产生作用 是炎症过程的重要组成成分 6 集落刺激因子是一种低分子量糖蛋白 能够在体内外选择性刺激造血干细胞增生 分化成某一谱系的细胞分类 G CSF M CSF GM CSF IL 3 EPO SCF 7 胸腺素分为 两族作用 1 具有免疫增强作用 可促进T细胞 NK LAK等细胞的增殖及杀伤活性2 参与细胞骨架的形成 通过对肌动蛋白的调节 参与某些肿瘤的转移 二 肿瘤的主动免疫治疗 应用肿瘤抗原或模拟肿瘤抗原的疫苗刺激机体免疫系统 激发或增强机体的抗肿瘤特异性免疫应答 阻止肿瘤生长 扩散和复发 肿瘤疫苗 肿瘤疫苗与传统疫苗在概念上不同 它主要不是用于肿瘤的预防 而是通过瘤苗的接种来刺激机体对肿瘤的免疫应答来治疗肿瘤 该法应用的前提是肿瘤抗原能刺激机体产生免疫反应 对手术后清除微小转移瘤灶和隐匿瘤 预防肿瘤转移和复发有较好的效果 1 肿瘤细胞疫苗 即通过自体肿瘤细胞粗提取物 经物理化学或生物手段处理后抑制其生长能力 保持其免疫原性 需加入佐剂如卡介苗等以增强免疫原性 2 肿瘤基因工程疫苗 肿瘤基因工程疫苗通过基因重组技术 将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗 2 肿瘤基因工程疫苗 1 提高机体抗肿瘤能力 将外源基因导入免疫细胞 其表达产物作用于免疫细胞 促进免疫细胞生长 分化 从而提高机体的抗肿瘤能力 目前研究较多的是细胞因子基因的转导 如IL 2 IL 4 IL 6 IL 12 IL 15 IL 18 IFN 以及GM CSF等 实验显示 在各种细胞因子中 以GM CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗效果最好 这与其诱导DC成熟有关 2 增强肿瘤免疫原性 通过表达肿瘤所缺乏的某些分子 以增强其免疫原性 如将B7基因导入具有肿瘤抗原的肿瘤细胞 不仅能恢复肿瘤特异性免疫反应 也可增强IL 2的抗瘤活性 一些肿瘤相关抗原 TAA 基因的转导研究 显示也可以增强其免疫原性 如CEA AFP gp100 MART 1 3 基因产物直接杀伤瘤细胞 如TNF基因导入肿瘤细胞可使局部持续分泌TNF 从而直接杀伤肿瘤细胞 3 肽疫苗 8 10个氨基酸的多肽是T细胞识别的基础肽疫苗主要包括以下二种 1 癌基因 抑癌基因突变肽疫苗目前已合成的p21 K Ras 125突变肽 EGFRvIII突变肽和Her2 neu肽等 2 病毒相关疫苗如EB病毒与鼻咽癌 Burkitt淋巴瘤 HBV与肝癌 人类T细胞白血病病毒与成人T细胞白血病 Oncophage Vitespen 通过加工 纯化自体肿瘤细胞的gp96等热休克蛋白HSP 获得大量肿瘤抗原 一项III期临床研究中728肾癌术后随机分为观察组和治疗组结果 复发率观察组治疗组P值全部27 3 25 0 0 384I II期27 0 15 2 0 056III IV27 5 32 0 0 686中危患者 30 9 16 3 0 004中危患者 I II期低分化 III期高分化俄罗斯2008 4 9批准Oncophage用于中危肾癌的辅助治疗 Lancet 2008 9633 145 4 核酸疫苗 核酸疫苗是由能引起保护性免疫反应的抗原基因片段及其载体构建而成 包括DNA疫苗和RNA疫苗 4 核酸疫苗 5 抗独特型抗体疫苗 肿瘤抗原可诱导抗体 Ab1 产生 该抗体可变区的独特型决定簇具有免疫源性 可诱导抗体Ab2产生 称为抗独特性抗体 也是一种抗抗体 在这些Ab2中 有的可模拟原来的抗原结构诱导抗原的特异性免疫反应 可作为肿瘤疫苗应用 这种疫苗的特点是 它既不是天然抗原的本身 也不是人工合成的抗原自身 而是抗原本身的 摸拟物 当用这种疫苗接种时 机体虽然没有直接接触抗原 却能产生对相应抗原的免疫应答具有抗原放大效应 已进入 期临床的抗独特型抗体 卵巢癌相关抗原CA125的独特型疫苗 AcA125黑色素瘤的独特性疫苗 BEC2 TriGem等淋巴瘤的独特性疫苗 Id KLH乳腺癌的独特性疫苗 1E10结直肠癌的独特性疫苗 105AD7 6 树突状细胞 DC 疫苗 肿瘤抗原属于内源性抗原 机体主要依靠CTL免疫应答杀伤肿瘤细胞 但肿瘤细胞表面的MHC 抗原肽段复合物表达水平低 需要经体内抗原提呈细胞加工 处理 提供诱导T细胞活化的第二信号 才能激发肿瘤特异性CTL的产生 由于DC在诱导体液免疫应答和细胞免疫应答中的重要功能 目前认为 DC在启动抗肿瘤免疫的抗原呈递中发挥重要作用 Dendriticcellsconnectinnateimmunityandadaptiveimmunity 人DC至少有三条来自于不同前体细胞的发育途径 1 CD34 细胞分化为DC2 外周血单核细胞分化为DC3 淋巴样DC前体细胞分化途径 临床应用 治疗恶性淋巴瘤 肿瘤抗原可以基因 多肽 蛋白 甚至完整细胞的形式负荷给DC 因此DC疫苗的制备明显比基因修饰的肿瘤细胞疫苗容易 因而促进了DC疫苗进入临床试验 1996美国斯坦福大学的Hsu等首先采用抗独特型抗体负荷的DC疫苗治疗了4例B细胞型淋巴瘤 3例获部分缓解 抗原冲击DC治疗乳腺癌 I II期临床 病人 高表达HER2的转移性乳腺癌病人16例方法 HER500冲击的自体APC2 108to5 109 二周一次 共三次 副作用 主要为寒战和发热 没有3 4级的毒副反应结果 12个可评价的病人 1例PR结论 HER500冲击的自体DC使用安全 有一定疗效 但效率仍不够高 J W Kylstra etal ASCO2003 治疗转移性肾癌 I II期临床 病人 转移性肾癌15例方法 肿瘤细胞溶解物冲击的DC3 95 106淋巴结内注射副作用 无明显的毒副作用结果 7例进展 7例稳定 1例部分退缩 14 4 106细胞 结论 肿瘤细胞溶解物冲击的DC 即使在有大负荷肿瘤时也有效 在大剂量使用时更有效 无毒副作用 MartenA etal CancerImmunolImmunother 2002 PROVENGE sipuleucel T Provenge是PA2024 GM CSF和PAP的融合蛋白 与自身树突状细胞孵育后获得的自体DC细胞疫苗 III期研究设计 127例无症状激素治疗无效的转移性前列腺癌患者 以2 1比例接受sipuleucel T 2周1次 连续3次 或安慰剂治疗 3月后曲线分离 JClinOncol 2006 3089 DCVax Brain 患者DC细胞经自体肿瘤细胞刺激后获得 胶质瘤手术联合放化疗的MS为14 6个月 TTP为6 9个月 NEnglJMed 2005 987I期和I II期研究中发现胶质瘤经DCVax Brain治疗后 皮下注射 后 3年存活率为53 95 的患者MS超过14 6个月 TTP超过6 9个月 由于大多数肿瘤抗原未被识别 因此肿瘤细胞溶解物负荷的DC疫苗可使更多的患者接受此种方法治疗 直接携带肿瘤抗原的DC作用更为直接 可以活化静息的T细胞 诱导强烈的抗肿瘤免疫反应 三 肿瘤的被动免疫治疗 1 单克隆抗体靶向治疗又称之为生物导弹技术 通过补体系统和自然杀伤细胞起抗肿瘤作用 嵌合型单抗达到95 以上人源化 减少了异种免疫原性 1 抗肿瘤单克隆抗体直接体内应用很多进入临床治疗试验 包括抗白细胞分化抗原CD19 CD20 CD22 CD33 表皮生长因子受体 EGFR MUC 1 前列腺特异性抗原 PSA 前列腺特异性膜抗原 PSMA 癌基因c erbB2产物 神经节苷酯GD3 GM2等抗原的单抗 2 抗肿瘤单克隆抗体与抗肿瘤药物 生物毒素 细胞因子或放射性核素偶联 生物毒素 如假单胞菌毒素或蓖麻毒素 放射线同位素 如131I 186Re 177Lu 90Y 212Bi 67Cu 等单抗作为导向物可增加毒素 放射性同位素等在肿瘤局部的浓度 增加对肿瘤的杀伤力或诱导肿瘤局部的免疫反应 3 基因工程抗体 毒素 或酶 融合蛋白直接杀瘤4 抗肿瘤单克隆抗体和抗效应细胞表面分子的抗体组成双特异性抗体 可引导杀瘤效应细胞向肿瘤灶集中5 胞内抗体在肿瘤细胞内表达 特异性作用于致瘤的癌基因产物或端粒酶 2 肿瘤过继性免疫治疗向肿瘤患者体内输注具有抗瘤活性的免疫细胞 直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫效应 回输的效应细胞包括 在体外用肿瘤抗原或淋巴因子激活的淋巴细胞 CIK TIL等 导入外援细胞因子基因并表达相应产物的淋巴细胞等 11 LAK细胞 LAK细胞是在1980年由美国国立癌症研究所Rosenberg发现 并在1982年由Grimm等命名的 这是一类由IL 2激活的能够杀伤NK抵抗的新型免疫细胞 是一种强烈的 广谱的 具有杀瘤活性的细胞 随后临床上广泛应用于肿瘤等疾病治疗 但由于LAK细胞活性的维持需要IL 2 而IL 2副作用大 而且在以后的临床总结中发现LAK细胞疗效较低 现已基本不用 2 CD3AK细胞 是在LAK细胞基础上 用抗CD3单抗和IL 2联合诱导的杀瘤细胞 由于使用了抗CD3单抗刺激 减少了IL 2的用量 降低LAK治疗的毒副作用 且CD3AK的抗肿瘤活性大大高于LAK细胞 对晚期恶性肿瘤患者输注自体CD3AK细胞1个疗程后 实体瘤组治疗有效率为25 45 临床获益率为74 54 淋巴瘤组有效率为83 33 临床获益率为91 67 在利用外周血淋巴细胞制备免疫效应细胞的研究中 为增加效应细胞的数量和杀瘤活性 常添加一些激活剂如抗CD3单抗 植物血凝素PHA等 以提高免疫治疗疗效 实验显示PHA预刺激虽能促进IL 2激活的杀伤细胞的增殖 但对杀伤活性并无明显改善 而培养15天以上 经PHA预刺激的P LAK和P CD3AK细胞杀伤活性显著提高 且PHA与抗CD3单抗有协同效应 3 TIL细胞 肿瘤浸润的淋巴细胞 肿瘤浸润的淋巴细胞 是从新鲜的肿瘤组织中分离出来 体外经IL 2 抗CD3单抗 TNF等刺激 经20 45天培养 获得的具有一定特异性的抗肿瘤细胞 其局限在于分离困难 体外培养时间过长 我们于1997 1998年选择21例癌性胸腹水患者 其中肺癌4例 乳腺癌5例 肠癌4例 骨癌7例 胰腺癌1例 所有病例均经病理学和细胞学诊断 共抽取33次胸腹水做TIL细胞培养 抽取胸水250 2200ml 腹水量1200 4400ml 21例患者中14例经1 6次的TIL胸腹腔回输治疗 回输期间隔天皮下注射IL 250万单位 14例患者回输治疗结果显示总有效率为78 57 其中3例胸腹水消失 并观察1个月无复发 1个月后检查胸腹水无瘤细胞 8例胸腹水有明显减少 并控制1个月以上 3例仅控制1 2周 4 TAK细胞 TAK是由可溶性肿瘤抗原 抗CD3单抗和IL 2共同诱导的杀瘤细胞 用可溶性肿瘤抗原诱导细胞识别肿瘤 以提高杀瘤亲和性 用抗CD3单抗诱导所有T细胞活化 培养出以CD8 T细胞为主的杀瘤细胞 TAK细胞不仅增加了杀瘤的特异性 且体外增殖快 IL 2用量低 用胃癌可溶性抗原 TSA 联合抗CD3单抗和IL 2共同刺激正常人的外周血单核细胞 培养10天后 经流式细胞仪表型分析 表明其免疫效应细胞以CD8 T细胞为主 其细胞增殖速度 增殖水平与CD3AK和LAK相比明显升高 且对抗原来源的胃癌细胞具有极强的杀伤活性 98 5 高于CD3AK 82 1 和LAK 62 05 我们于1996 1998年 采用静脉或口服化疗和免疫效应细胞输注为主体的化学免疫疗法 治疗晚期原发性肝癌18例 收治的38例晚期原发性肝癌病人中 18例采用化学免疫疗法 甲组 同期收治的晚期肝癌患者 除对症处理外 单用静脉化疗或肝动脉插管化疗20例 列为对照组 乙组 总缓解率 CR PR 甲组22 22 4 18 乙组0 无1例缓解 5 CIK细胞 是将人外周血单个核细胞经体外用各种细胞因子共同刺激培养所获得的免疫细胞 由于同时表达CD3和CD56分子 故又称为NK样T细胞 CIK细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点 其抗肿瘤活性远大于LAK和TIL 因此被认为是新一代肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案 刺激因子除了抗CD3单抗 IL 2外 还需用IFN 和IL 1 等细胞因子 CIK细胞杀伤机制 识别由于CIK的细胞杀伤作用是非MHC限制性的 故CD4 CD8在其识别肿瘤细胞或病毒感染的细胞过程中并非必不可少 细胞表面粘附分子LFA 1ICAM 1在CIK细胞识别过程中起关键作用 对正常细胞无毒性作用 杀伤细胞对肿瘤细胞或感染细胞的直接杀伤 CIK细胞在受到外源性抗原或敏感靶细胞刺激时会释放具有细胞毒性的胞浆颗粒物到膜外空间 其中细胞可产生最大的颗粒释放量 这些胞浆颗粒物对靶细胞具有直接杀伤作用 炎性细胞因子的杀伤活性 培养的细胞可以分泌多种细胞因子 如 肿瘤坏死因子 等 不仅对靶细胞有直接抑制作用 还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤靶细胞 诱导肿瘤细胞凋亡 细胞在培养过程中表达 型跨膜糖蛋白 一方面增强了其对肿瘤细胞引发的凋亡的抵抗性 还可通过对 型跨膜糖蛋白 肿瘤细胞诱导凋亡行使其对肿瘤细胞的慢性杀伤作用 保证抗瘤活性的长期持久 CIK细胞的杀瘤特点 1 增殖速度快CIK细胞中的效应细胞CD3 CD56 细胞在正常人外周血中极其罕见 仅1 5 在体外经多因子培养28 30天 CD3 CD56 细胞迅速增多 较培养前升幅可达1000倍以上 且所占百分比也大幅上升 细胞毒活性亦达峰值 2 杀伤活性高 杀瘤谱广CIK细胞的总杀伤单位 TLU 为LAK细胞的73倍甚至更高 CIK细胞的瘤细胞抑制Log指数为2 5 3 5 较LAK细胞的瘤细胞抑制指数高2个Log 其抗病毒活性大大增强 因没有T淋巴细胞杀伤时的MHC限制性 故对于多种肿瘤细胞系和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性 3 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感CIK细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活性 两者比较无差别 4 杀瘤活性不受CsA FK506等免疫抑制剂的影响免疫抑制剂CsA 环孢霉素A 和FK506 普乐可复 不影响靶细胞诱导的CIK细胞脱颗粒 并且CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低 5 对正常骨髓造血前体细胞毒性很小CIK细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响 对GM CFU 粒细胞巨噬细胞集落形成单位 仅有不足1级的抑制 6 能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas FasL凋亡CIK细胞内有抗凋亡基因表达 并检出多种保护基因 如Bcl 2等和survivin的转录水平上调 CIK细胞具备合成FasL的能力 CIK细胞可以对抗体内FasL阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降 CIK制备 采集 外周血单个核细胞 分离 PBMNC经淋巴细胞分离液分离 洗涤后悬浮于含10 AB血清的RPMI1640中 培养 第一天培养加入 IFN1000U ml 24小时后加入IL 21000U ml 在37 5 CO2孵箱中培养 以后每3天更换培养液补加IL 21000U ml 培养7 10天 无菌检测 细菌霉菌培养阴性 热源检测阴性 收获 收集细胞 加入含1 白蛋白的生理盐水洗涤 回输 洗涤后的细胞悬浮于1 白蛋白生理盐水中 将CIK细胞通过输血器经静脉输给患者 疗程 培养的第8 10天开始 分八袋回输 每次间隔1 2天 自回输CIK细胞前一天起 可每日静脉输注IL 2 每日剂量为100万单位直到回输结束 临床应用 体内回输CIK细胞 可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下 直接杀伤肿瘤细胞 并可调节和增强机体的免疫功能 特别适应于那些对手术 放疗 化疗已无适应证的晚期肿瘤患者 因而成为治疗肿瘤的重要辅助治疗方法 为预防肿瘤复发 改善生存质量提供了新途径 一般在放疗 化疗后间隔2 4周 机体免疫力有所恢复时 输入CIK细胞 可提高肿瘤患者的缓解率并在清除微小残留病灶方面发挥重要作用 6 DC CIK 将外周血来源的CIK细胞和同源DC细胞共培养一段时间后发现 DC和CIK细胞的增殖能力明显增强 共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出2倍左右 共培养24h后 DC细胞白细胞介素 12的分泌量为单独培养时的6 93倍 与DC细胞共培养的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著提高 DC CIK制备流程 7 NK细胞 自然杀伤细胞 naturalkillercell NK 细胞不经致敏可直接杀伤敏感的肿瘤细胞 是宿主抗肿瘤的第一道防线 自然杀伤细胞 黄色 在它们严重破坏机体之前识别并杀死癌细胞 粉红色 或病毒感染的细胞 NK细胞受体和配体 中国肿瘤临床2013 40卷 90例食管癌中晚期患者 TNMIII IV期 接受枯息性手术后 分为单纯化疗组40例 化疗联合NK细胞治疗MCIA阴性组 简称联合MICA 组 25例及化疗联合NK细胞治疗MCIA阳性组 简称联合MICA 组 25例 中国肿瘤生物治疗杂志2013 20卷 体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本方案 恶性肿瘤 手术治疗 可手术 放化疗敏感 常规放化疗 放化疗间隙联合细胞免疫治疗 卵巢癌 乳腺癌 小细胞肺癌和鼻咽癌等 放化疗不敏感 肾癌 前列腺癌 黑色素瘤和肝癌等 放化疗敏感 常规放化疗 放化疗间隙联合细胞免疫治疗 卵巢癌 乳腺癌 小细胞肺癌和鼻咽癌等 细胞免疫治疗 疾病稳定期 细胞免疫治疗联合内分泌或靶向治疗 细胞因子治疗 专科治疗 微创介入 不能手术 期 期 复发者 细胞免疫治疗 疾病稳定期 化疗不敏感 原发性肝癌 肾癌 前列腺癌和黑色素瘤等 细胞免疫治疗联合专科治疗 CIK输注不良反应 免疫活性细胞回输后患者可出现一过性类流感样症状 如发热 体温37 5 39 5 轻度头痛 乏力 关节酸痛 持续时间均不超过12h 可自行缓解 所有患者均能很好耐受治疗 3 过继性免疫效应细胞治疗的优点 1 免疫细胞在体外处理 可绕过体内肿瘤免疫障碍的种种机制 从而选择性地操作抗肿瘤免疫反应 如新鲜分离的肿瘤浸润性淋巴细胞 tumorinfiltratinglymphocyte TIL 往往缺乏抗肿瘤效应 而在体外一定条件下培养一段时间后可恢复特异性抗肿瘤作用 在体外培养条件下 肿瘤抗原特异性耐受的免疫细胞可被逆转 2 免疫细胞的活化及效应过程往往由一些细胞因子介导 而目前基因工程可大量克隆不同的细胞因子 也可大量克隆肿瘤抗原或多肽 这使体外活化扩增大量的抗肿瘤免疫细胞更为可行方便 3 免疫细胞的体外活化扩增可避免一些制剂体内大量应用带来的严重毒副作用 如 IL 2 TNF IL 4 IL 7 IL 12等具有抗肿瘤作用 抗CD3单克隆抗体 MabCD3 的体内应用可激活T淋巴细胞 但这些制剂由于其复杂的多种作用 在体内大量应用可导致严重的甚至致死性副作用 这也是这些因子难以被批准临床使用的重要原因 而在体外操作可避免这些副作用 4 目前已能在体外大量扩增自体或异基因的抗肿瘤免疫细胞 其数量大于肿瘤疫苗在体内激活的效应细胞数 一些体外培养的免疫细胞已进入临床治疗试验 实验显示肿瘤疫苗在体内应用可增加体内的肿瘤特异性CTL数量 但到一定时候 体内的CTL到达平台期而不再增加 这主要由体内存在的特异性及非特异性免疫调节网络限制了CTL克隆的扩增 而在体外培养可突破此调节网络 大量扩增免疫效应细胞 理想的过继性免疫细胞治疗应具有以下特点 1 可大量获得 实验室研究及临床实践显示 临床治疗量的免疫细胞应在1 1010以上 2 为肿瘤特异性 3 抗肿瘤活性强 4 体内应用可耐受 5 可聚集在肿瘤灶 6 可在体内存活 增殖 二 免疫治疗的作用 肿瘤免疫治疗即能够直接清除体内的残存肿瘤细胞 又能够提高机体的整体免疫功能 还具有将患者个体化的肿瘤抗原信息递呈给体内肿瘤免疫杀伤细胞的独特作用 肿瘤免疫治疗已成为临床上继手术 化疗 放疗之后的第四种最有效的肿瘤治疗方法 在肿瘤综合治疗方案中 免疫治疗成为提高肿瘤治愈率和有效率的一个关键措施 三 免疫治疗的临床地位 免疫治疗是最有前途的抗肿瘤手段之一目前尚未起主导作用定位于手术 放化疗后清除残留病灶目标是预防复发关键是抗原在体内有效地被递呈并激活T淋巴细胞 四 免疫治疗的原则 虽然目前免疫治疗的方法还不是很有效的 只能配合其他疗法作为一种辅助手段 但从肿瘤免疫的理论看 它涉及的是肿瘤发生发展的内部因素和内部矛盾性 随着它的迅速发展 为肿瘤的免疫治疗提出了广泛的可能 从宿主与肿瘤相互斗争这一矛盾出发 从增强宿主对肿瘤的免疫能力 以及消除肿瘤对免疫功能的抑制两个方面入手 并继续在增强机体非特异性免疫能力方面进行研究 肿瘤的免疫治疗是大有希望的 1 增强宿主对肿瘤的免疫能力 1 提纯改造抗原 提高抗原的免疫作用2 发挥细胞免疫的作用进行过继免疫治疗3 利用细胞因子激活抗肿瘤免疫4 抗体导向治疗2 消除肿瘤对免疫的对抗如何清除免疫抑制因子的作用 是肿瘤免疫治疗很有希望的一个方面 五 免疫治疗的评价 1 临床评价 病灶变化 临床查体和影像学检查 CT MRI B超 等 内镜检查肿瘤标志物肝功 肾功 血象等的改善其他 肿瘤标志物 tumormarkers TM 1978年NCI提出1979年确认并开始使用TM是表示肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质TM主要是指那些在血液 体液及组织中可检测到的与肿瘤相关的物质 这些物质达到一定的水平时能揭示某些肿瘤的存在 TM的临床意义 1 诊断 2 复发 3 判断疗效 4 预后 常用肿瘤标志物 甲胎蛋白 AFP 癌胚抗原 CEA 糖类抗原 CA50 CA125 CA15 3 CA199 CA242 CA72 4 2 微球蛋白 2 MG 铁蛋白 Ft 细胞角质素片段抗原21 1 CYFRA21 1 神经元特异性烯醇化酶 NSE 鳞状上皮癌相关抗原 SCC Ag 前列腺特异抗原 PSA 前列腺酸性磷酸酶 PAP 核基质 2 免疫监测 观察CTL的反应 认定CTL反应的细胞类型 等 从而评价机体对免疫治疗的反应1 迟发超敏试验 DTH 体内抗原特异性免疫监测技术2 机体免疫功能检测体液免疫指标 定量分析抗原特异性抗体的数量和功能 检验科细胞免疫功能 FCM技术检测淋巴细胞表面标志CD3 CD4 CD8 CD19 CD28 CD16 CD56 CD25 HLA DR 等等 实验室Th1 Th2类因子检测 应用FCM CBA技术 采用磁珠微阵列技术 同时测定血清中4 6种免疫相关因子的水平 实验室 3 T细胞增殖反应 3H测定法4 T细胞毒性检测 51Cr释放试验LDHMTT WST 1 5 T细胞限制性稀释分析法 LDA 分析未知频率的淋巴细胞克隆 定量检测外周血中最初抗原T特异性淋巴细胞的数目或频率 操作复杂 被ELISPOT等新技术所取代 6 细胞因子检测 测定T淋巴细胞分泌的因子ELISA 酶联免疫技术 检测T淋巴细胞分泌于细胞外的因子ELISPOT 酶联免疫斑点技术 检测T淋巴细胞分泌于细胞外的因子FCM 流式细胞术 检测T淋巴细胞胞内细胞因子 7 其他P MHCtetramer技术 检测细胞表面受体 TCR 与MHC分子递呈的多肽的相互作用定量PCR技术 检测细胞因子基因 T细胞受体复合物基因等表达水平 反应T淋巴细胞功能状态 六 肿瘤免疫治疗的新进展 1 免疫卡控点抑制剂CheckpoimtinhibitorCTLA4 PD 1 PD L12 TCR T和CAR T T B7 CD28 MHC I Ag TCR TCR Ag MHC I IL 2 APC Tumor T T T T T 耐受 激活 CD28 协同刺激分子作用示意图 T 1 T细胞免疫卡控点治疗 有两种受体存在于T细胞表面B7CD28低亲和力受体CTLA 4高亲和力受体B7传递阳性或阴性信号决定于T细胞上的配基B7 CD28结合 产生阳性信号 增强免疫反应 封闭CD28依赖的T细胞激活 下调免疫反应 B7 CTLA 4结合 产生阴性信号 下调免疫反应 封闭CTLA 4促进抗肿瘤反应 TheBiologyofCancer 抗CTLA 4抗体治疗黑色素瘤肺转移患者 Ipilimumab治疗复治转移性黑色素瘤 fullyhuman IgG1monoclonalantibody anti CTLA 4 结果提示 Ipilimumab能够延长转移性黑色素瘤患者的总生存 故2011年通过FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤 入组标准 二线治疗 化疗或细胞因子治疗失败 HLA A 0201排除标准 既往CTLA 4抗体或疫苗治疗 免疫抑制剂或自身免疫疾病 脑转移 脉络膜黑色素瘤 EarlyResponsetoTherapy CancerInvestigation 30 712 720 2012 Gradual DelayedResponse CancerInvestigation 30 712 720 2012 2011年 Nature 杂志指出 肿瘤免疫治疗的时代已经来临 抗PD 1抗体治疗黑色素瘤肺 肝转移患者 Thenewenglandjournalofmedicine CD8 RECIST 为38 44 117例 CheckpointInhibitor Nivolumab BMS 936558 fullyhuman IgG4monoclonalantibody anti PD 1 DurableORwasobservedinpatientswithmelanoma NSCLCandRCC 该研究中NSCLC患者的给药浓度分别为1mg kg 3mg kg和10mg kg 76例可评价疗效NSCLC患者的ORR达18 鳞癌与非鳞癌患者的ORR分别为33 6 18 和12 7 58 2 TCR T和CAR T 基本概念 1 T细胞 抗原 受体 Tcellreceptor TCR TCR为所有T细胞表面的特征性标志 以非共价键与CD3结合 形成TCR CD3复合物 TCR的作用是识别抗原 2 TCR TTCR基因转染的T细胞免疫治疗3 嵌合抗原受体 CAR 是通过基因改造的T细胞抗原受体 赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力 CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原 tumor associatedantigen TAA 结合区 通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段 一个胞外铰链区 一个跨膜区和一个胞内信号区 目标抗原的选择对于CAR的特异性 有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素 4 CAR T全称是ChimericAntigenReceptorT CellImmunotherapy 嵌合抗原受体T细胞免疫疗法 经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标 TCR转染CTL细胞治疗 转导识别特异性肿瘤抗原的TCR基因至T细胞 强制性其表达独特性TCR 经大量扩增 成为具备特异性杀伤活性的CTL 识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的肿瘤细胞 InaHLA dependentway 嵌合体抗原受体 CAR 改造的CTL细胞治疗 嵌合抗原受体 CAR 是将识别肿瘤相关抗原 TAA 的单链抗体和T细胞的活化序列结合为一体 通过基因转导方法转染T淋巴细胞 使其能特异性地识别和杀伤肿瘤细胞 nonHLA dependentway TCR与CAR的结构比较 4 1BB OX 40 受MHC限制性 不受MHC限制 aCD19 Fig2 Completeremissions CRs ofchemotherapyrefractorylarge celllymphomasinpatientsreceivinganti CD19chimericantigenreceptorTcells A Positronemissiontomography PET computedtomography CT scansshowCRofchemotherapyrefractoryprimarymediastinalB celllymphoma PMBCL inpatientNo 2 B PET CTscansdemonstrateCRoflymphomainpatientNo 8whohadchemotherapyrefractoryPMBCLwithextensiveliverinvolvement C PET CTimagesshowCRofdiffuselargeB celllymphoma nototherwisespecified inpatientNo 14 whohadextensivespleniclymphoma Chemotherapy RefractoryDiffuseLargeB CellLymphomaandIndolentB CellMalignanciesCanBeEffectivelyTreatedWithAutologousTCellsExpressinganAnti CD19ChimericAntigenReceptor StevenA Rosenberg JClinOncol 2014Aug25 pii JCO 2014 56 2025 抗CD19CAR T治疗难治性弥漫大B淋巴瘤 15例CR8 PR4 80 2011年美国宾夕法尼亚大学的研究人员将通过慢病毒载体构建的以CD19为靶点的CAR 包含CD19 CD137和CD3 导入患者自身T淋巴细胞中 体外扩增培养后回输 用于治疗3名CLL患者 结果发现这群T细胞可以在体内持续作用达6个月 骨髓监测到特异性免疫反应 治疗后的缓解期达10个月 CD19CARs应用于淋巴细胞白血病的治疗 应用 慢性淋巴细胞白血病Blood116 2010 4099 4012 ScienceTranslationalMedicine3 2011 95ra73 Blood119 2012 2709 2720 其他应用 黑色素瘤 MorgenRA Science 2006 ParkhurstMR MolTher 2011 卵巢癌 KandalaftLE JTranslMed 2012Aug3 CAR T存在的问题 优点 抗体特异性识别与T细胞杀伤功能结合 人为增加了杀伤肿瘤特异性T细胞 对血液系统B细胞来源的肿瘤效果较好 问题1 抗CD19 CD20对正常B细胞功能损伤 2 CAR修饰基因的免疫原性 引起自身抗CAR免疫 3 对实体瘤表面独特性抗原选择难 许多TAA通过MHC I分子呈递 非抗体识别 对抗肿瘤的异质性难 4 实体瘤微环境障碍 富集差 活性受到抑制 正在研究对策 2013年12月20日出版的 Science 杂志 将肿瘤免疫治疗列入2013年最值得关注的6大科学领域 2014年4月 Science 杂志再次强调肿瘤免疫治疗的重要性 ImmunityandCancer AntibodiesagainstCTLA 4AntibodiesagainstPD 1Chimericantigenreceptor CAR therapy 七 精准免疫治疗 精准癌症免疫疗法 Combinationofboth 转化医学的概念和地位 快速有效的将生物医学基础研究的最新成果转化为临床医学技术和产品 并把临床医疗的实际情况反馈给实验室并开展研究的双向过程 即 从实验室到病房 benchtobedside 和 从病房到实验室 besidetobench 的双向通道研究 简称为B2B 是国际医学领域近年来提出的一个新的理念 临床应用 基础研究 谢谢