2011化学药物结构确证研究的技术要求与案例分析.ppt

化学药物结构确证研究的技术要求与案例分析 王玉成中国医学科学院医药生物技术研究所 目录 一 结构确证研究的一般原则和要求 二 对不同类别药品结构确证的要求 三 对特殊化学结构药品结构确证的要求 四 各项波谱和测试的技术要求 案例 1 结构确证研究的主要对象2 结构确证研究的基本方法3 结构确证研究的主要内容4 结构确证研究的一般要求 一 结构确证研究的一般原则和要求 1 结构确证研究的主要对象 经化学全合成或半合成 微生物发酵以及从动 植物中提取的原料药 包括新药 进口药和已有国家标准的药品 按来源 化学合成 半合成 天然产物中提取 发酵等 按组分 单一组分 多组分混合物 按分子量 小分子化合物 大分子化合物 按结构特点 成盐化合物和非成盐化合物 手性化合物和非手性化合物 含结晶水 溶剂和不含结晶水 溶剂等 2 结构确证研究的基本方法 化学方法 理化分析 元素分析 化学关联等 物理方法 波谱方法 衍射技术a 射频波 微波与物质的相互作用 核磁共振 电子顺磁共振等 ESP根据谱图中吸收峰的位置 谱线的积分强度 谱线的宽度及超精细结构等信息可以鉴定自由基和过滤金属离子等顺磁粒子的结构状态 检测它们的浓度 可检测到10 14摩 升 b 红外 可见 紫外光与物质的相互作用 红外光谱 紫外光谱 拉曼光谱等c X 射线与物质的相互作用 X 射线衍射等d 电子与物质的相互作用 质谱 电镜等e 其他 热分析 原子吸收 原子发射等 3 结构确证研究的主要内容 骨架 平面 结构 分子中各原子之间的连接顺序和方式 构型 分子中各原子之间的空间相对位置 结晶水 结晶溶剂 与水 有机溶剂通过氢键等结合 晶型 分子 或原子 在晶体中的排列方式 骨架 平面 结构例 氟吗西尼 骨架 平面 结构的研究方法 a 单晶X 射线衍射 b 常规方法 如元素分析 或高分辨质谱 UV IR NMR 包括二维谱 MS等组合 应根据化合物骨架结构的特点及其复杂程度 有无对照品及参考文献 合理选用测试项目 构型 几何构型 双键 环状化合物 常用顺 反 cis trans 或Z E表示例 西尼地平 3 2 甲氧基乙基 5 3 苯基 2 E 丙烯基 2 6 二甲基 4 3 硝基苯基 1 4 二氢 3 5 吡啶二甲酸酯 例 拉米夫定 2R 顺式 4 氨基 1 2 羟甲基 1 3 氧硫杂环戊 5 基 1H 嘧啶 2 酮 几何构型的研究 理化性质差别明显a 理化常数 例如熔点等 b 氢谱 碳谱 c 红外光谱 紫外光谱等 光学异构 由于分子的不对称性引起 常用D L或R S表示 例 那格列奈 N 反 4 异丙基环基甲酰基 D 苯丙氨酸 例 前列腺素E1 1R 2R 3R 3 羟基 2 E 3S 3 羟基 1 辛烯基 5 氧代环戊烷庚酸 光学异构的研究 a 比旋度测定b 手性柱色谱 HPLC GC c 核磁共振 NMR d 单晶X 射线衍射 SXRD e 旋光光谱 ORD 1 决定化合物之绝对立体构造 2 决定蛋白质2级与3级构造 f 圆二色谱 CD g 其他方法对照品法 根据对照品的构型推定化学关联法 利用合成工艺分析例如 左旋西替利嗪的构型确证 手性柱色谱定位 与对照品对比 比旋度数据 光学纯度分析 晶型的研究 晶型是化合物一个重要特性 对于多晶型药物 因晶格结构不同 某些理化性质 如熔点 溶解度 稳定性 可能不同 而且在不同条件下 同一化合物的各晶型之间可能会发生相互转化 对于难溶性固体口服制剂 其原料药晶型可能影响药物的溶解度 稳定性 药代动力学性质进而可能影响药效 所以对于已有文献报道的多晶型化合物应明确其晶型 晶型的一致性 对于创新药也应注意积累相关研究资料观察有无多晶型现象 晶型的研究 a 粉末X 射线衍射法b 红外光谱法 拉曼光谱法c 熔点法d 热分析e 光学显微镜法 无对照品和文献报道 考察不同结晶条件下 溶剂 温度 结晶速率等 制备样品的熔点 红外光谱 粉末X 射线衍射等 有对照品 对比自制药物与已上市药物的熔点 红外光谱图 粉末X 射线衍射图谱等 有文献报道 对文献资料进行分析 选取能够准确反映产品晶型的测试项目 结晶水 结晶溶剂的研究 药物分子通过氢键等和水 有机溶剂结合形成水合物 溶剂化物 含有不同数量结晶水 结晶溶剂的化合物可能具有不同的物理性质 进而可能影响药物的生物利用度 因此对于原料药应明确其所含的结晶水 溶剂的情况 结晶水 结晶溶剂的研究 a 元素分析b 热分析c 干燥失重 水分检查d 单晶X 射线衍射 创新药 在干燥失重 水分测定研究的基础上 通过热分析 元素分析等确证样品分子中结晶水 结晶溶剂的数量 已上市的药品 采取合适的分析方法对样品进行分析 以确证其结晶水 结晶溶剂的情况与已上市产品一致 小结 在审评过程中专家评价的关注点一般包括 结构确证方案设计的合理性 是否对化合物所有要素进行了考虑 研究内容设置的全面性 所有的结构特征是否已被确证 分析方法选择的正确性 所用方法能否针对性地解决结构问题 研发者在进行结构确证研究时 测试项目的选择要依据化合物结构特点 需要解决的结构问题 各种方法所能解决的结构问题等综合考虑 对测试样品和对照样品的要求 测试样品 a 精制方法测试样品要采用和原料药制备工艺中相同的精制方法 工艺条件进行精制 对于进行晶型分析 结晶水 结晶溶剂分析时尤其需要注意 因为不同的精制方法和工艺条件可能产生不同的晶型 结晶水 溶剂 b 纯度要求大于99 0 杂质含量应小于0 5 对于手性药物 应增加对对映体 非对映体纯度要求 一般不低于99 5 注意点 仿制药物 相关物质大于或等于0 1 要进行结构确证 注意响应因子 创新药物 除了与仿制药物一样之外 尽可能多的罗列所有可能杂质 要与中间体关联 特别注意手性问题 对照品 a 合法来源证明购得的标准品 已有国家标准的药品 市售原料药市售制剂中提取得到的原料药从正规试剂公司购得的试剂等 有的申报资料中 未选择上市原料药或其他合法对照品 而是采用自己单位精制的产品 这种 自身 对照的数据和图谱对于结构确证没有任何帮助 b 精制方法 对于用于晶型 结晶水等信息确证的对照品 不应采用处理后原料药或制剂中提取物作为对照品 因为原料药和制剂在不同溶媒处理后 会对样品真实的晶型和结晶水产生影响 造成误判 c 纯度检查 对照品的纯度检查 申报资料中应提供对照品的纯度检查结果 一般来说 对照品纯度应不低于精制品纯度 以保证对照品对药物结构确证的支持力度 4 结构确证研究的一般要求 对图谱 数据的要求 附图应为原图的复印件或照片 图谱及图谱上的标记 数据应清晰 并有完整的检测日期 各项参数 测试条件 仪器型号及样品编号等记录 各项检测数据应按规定列表说明 注明其顺序 有对照品的应将测试品和对照品同一波谱的数据在一个表中对比列出 如有可作参照的文献数据 也可列在同一表中 质谱应附离子裂解图 二 对不同类别药品结构确证的要求 未知结构的化合物 推论结构已知结构的化合物 验证结构 未在国内外上市销售的原料药 按全新化学单体要求 推论结构a 完成必要的各项测试 b 应提供充分的试验图谱和数据 c 按新化合物要求进行图谱解析和综合解析 如有参考文献资料 可提供作参考 已在国外上市销售但尚未在国内销售的原料药或已有国家标准的原料药 按已知化学结构的药物 验证结构可以使用对照品可以参考文献 a 有合格对照品的化合物 提供测试样品和对照品在完全相同条件和同一仪器上测得的各项图谱和数据 完成所需的各项目测试 若二者完全相同 并对重要的波谱讯号和测试数据进行了正确解析 即可得出二者化学结构一致的结论 b 有详细文献数据的化合物 可对结构确证研究的内容 方法提供线索 并为解析提供参考 但是不能作为结构确证研究的充分证据 仍需要进行较为详尽的图谱解析和综合解析 c 无对照品和文献数据的化合物 除了目标化合物的结构外 缺乏其他支持性资料 因此原则上应按全新化学单体要求进行全面的研究 提供充分的试验图谱和数据 可结合其它研究工作 例如合成工艺路线的确定 以进一步推论化合物的结构 三 对特殊化学结构药品结构确证的要求 1 立体异构体药物 立体异构体 光学异构体a 对映异构体b 非对映异构体 几何异构体 顺 反异构体 手性药物 绝对构型和相对构型a 单一对映体 绝对构型比旋度测定手性柱色谱 手性HPLC和GC 核磁共振单晶X 衍射圆二色谱旋光光谱 b 消旋体 有多个手性中心时要求确定相对构型 c 立体异构混合物 确定异构体的组成和比例 手性药物申报资料及审评要点 药审中心 应注意确证产品的立体构型 可根据手性中心的多少 文献数据是否充足 对照品的有无来选择合适的确证的方法 必要时可采用单晶X 射线衍射进行确证 比旋度是必须的检测项目之一 已知的起始原料的构型和化学合成方法的立体选择性也可作为依据之一 2 具有多晶型的药物 晶型 是指结晶物质晶格内分子的排列形式 多晶型物质晶格内部分子间力的差异可能引起药物各种理化性质的变化 主要对熔点 溶解度及溶出速率 稳定性 有效性的影响 重点 以适宜的方法获得药物晶型的数据 常用方法 粉末X 衍射法红外吸收光谱法熔点热分析光学显微镜 创新药物a 不同结晶条件下 溶剂 温度 结晶速率等 晶型的一致性 b 不同晶型是否影响药物活性和毒性等 结构已知的仿制药品a 力求与被仿制品保持一致 特别是被仿制药为晶型选择性药物 且各晶型的理化性质及生物药剂学性质有明显差异的仿制药品 要重点确定与被仿制品种晶型的完全一致性 熔点 红外吸收光谱 粉末X 射线衍射图等 b 重点关注难溶性固体口服制剂晶型的研究 3 合成多肽类药物 氨基酸分析 证明多肽的组成是否正确 质谱测定 提供相对分子质量及序列的信息 序列分析以及肽图测绘等 紫外 对具有生色团结构的小肽有一定的测试意义 红外 适用于小肽 含三个氨基酸的肽 拟肽等 核磁共振 可对小肽的结构提供部分信息 其他方法 HPLC 比旋度测定等 药物结构中有半胱氨酸 应明确其状态 氧化态或还原态 药物结构中存在二硫键 应明确二硫键的正确连接点 结合合成工艺对中间体的研究 对终产品的结构进行确证 4 多糖类药物 多糖结构的描述包括 多糖的分子量范围 多糖的单糖组分 单糖的连接点类型 单糖和糖苷键的构型 重复单位 确证方法 单糖的分离 鉴定 纸色谱法 TLC HPLC 气 质联用技术等 多糖的相对分子量及分子量分布测定 凝胶色谱法 糖苷键的连接方式及糖苷键的位置 红外 核磁共振 化学反应后产物的分析等 5 多组分药物 明确各组分的组成比例 对影响药效和毒性的主要成分进行结构确证 可使用经典的提取方法或其它分离技术 如制备色谱 TLC HPLC 分离得到主要药效成分单体 按单体项目要求进行化学结构确证 在组分多 含量少 难于得到单体时 可使用联机分析技术 如气一质联用 GC MS 液 质联用 LC MS 气 付利叶红外联用 GC FTIR 质 质联用 MS MS 辅助组分结构的验证及定量分析 6 不含金属元素的有机盐类或复合物 应同时提供成盐前后的两套波谱和试验数据 对于某些波谱测定有困难或不易说明其结构的盐或复合物 可测定药物酸根或碱基的波谱 并结合其他试验项目进行确证 7 金属盐类和络合物 除通常要求的各项测试外 还应提供确证分子中金属元素的种类 存在形式和含量的有关图谱和分析数据 不适于或不能测试金属盐本身的项目 可以用成盐前的酸分子或配位体的相应测试结果进行佐证 8 半合成化合物 分子母核的结构为已知并可以确证其原分子母核结构在合成过程中未发生改变的 可适当简化对母核部分结构的确证工作 重点对新引入基团进行结构确证 可以结合原料结构和合成路线进行论证和说明 如涉及构型确证 若母核手性中心构型没有改变时 重点在于侧链和取代基中新引入手性中心的构型确定 综合解析举例 FABMS 22mu M H M Na 1 2 3 6 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 6 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 CH CH2 OCH3 1 2 3 6 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2a 2b 3 4 5 9 10 11 13 14 7 8 6 1 2a 2b 3 4 5 9 10 11 13 14 7 8 6 1 2a 3 8 6 4 5 2b 9 7 11 10 14 13 1 2 3 6 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2a 2b 3 4 5 9 10 11 13 14 7 8 6 申报资料的格式和内容 一 新药的化学结构式 分子式及分子量二 供确认化学结构用供试品的纯度及检查纯度的方法三 确证化学结构的方法理化常数元素分析四 各项波谱和测试的技术要求紫外吸收光谱红外吸收光谱核磁共振氢谱核磁共振碳谱质谱差热分析X 射线衍射谱综合解析五 参考文献 一 新药的化学结构式 分子式及分子量 二 供确认化学结构用供试品的纯度及检查纯度的方法 三 确证化学结构的方法 2元素分析 主要应用 确定元素组成 分子式 除氧元素外 其余各种元素一般均能准确测定其含量 可以反映结晶水 结晶溶剂 成盐化合物的酸根和碱基等 C H N元素可采用自动元素分析仪测定 其他元素可采用适宜的物理或化学方法测定 技术要求 a 应详细说明使用仪器 测定方法及条件 特别是对测试样品的预处理方法 条件 b 同一样品测定两次 两次实验数据同时列出 不取平均值 c 应给出计算理论值所依据的分子式 包括结晶水 或结晶溶剂 列表比较实测值与理论值 一般要求误差不超过0 3 初步判定供试品与目标化合物的分子组成是否一致 d 附测试报告单的复印件 仪器型号与测定条件仪器 Carlo Erba1106元素分析仪 意大利 测定条件 1050 催化燃烧载气 N2氧瓶法测定测定结果与解析测定结果 样品测定结果与对照品测定结果见附表1 结果解析 样品与对照品的实测值同理论计算值基本相符 C H N 的误差均在千分之五以内 同含5个结晶水的盐酸大观霉素分子式C14H24ClN2O7 2HCl 5H2O符合 表1样品 020708 与对照品 DJS 的元素分析数据 四 各项波谱和测试的技术要求 1 红外吸收光谱 IR 基本原理 分子中化学键振动能级的跃迁 主要应用 a 鉴定化合物的结构 有对照品 标准图谱b 推测化合物的结构 确定特征官能团 区分晶型等 技术要求 a 按药典规定方法校正和检定仪器 b 正确选择测试方法和条件固体样品首选溴化钾压片法 离子交换 氯化钾压片 晶型变化 糊法 c 准确 合理 充分的图谱解析 d 按要求格式列表和撰写资料 仪器型号与测试仪器 NicoletImpact 400型红外分光光度计仪器测试 用聚苯乙烯膜仪器的测定条件测定条件 样品测定用溴化钾压片法测定图谱 图1 2附图3 聚苯乙烯膜红外吸收光谱 资料撰写格式仪器测试条件仪器校正和检定数据表解析 2 紫外吸收光谱 UV 基本原理 电子跃迁 主要应用 推测共轭体系的骨架结构 发色团 助色团 紫外光谱 定性吸收系数 定量 技术要求a 按药典规定方法校正和检定仪器 b 通常要求三种溶剂 中性 0 1NHCl 0 1NNaOH c 要求定量 准确计算摩尔吸收系数 d 归属主要吸收谱带 e 数据列表说明 资料撰写格式仪器测试条件仪器校正和检定数据表解析 3 核磁共振氢谱 1H NMR 基本原理 利用原子核的核自旋现象 通过一定振动频率的电磁波照射时 原子核吸收电磁波从低能态向高能态跃迁 即核磁共振 主要应用可提供供试品中氢原子数目 周围化学环境 相互间关系 空间排列等信息 技术要求a 应使用200MHz以上高分辨NMR仪 b 对各项测试条件应有明确 详尽的说明 如仪器型号 规格 溶剂 内标 c 对分子中全部H原子均要有明确的解析和归属 d 对复杂结构化合物 应考虑采用合适的其它技术加以佐证 资料撰写格式仪器溶剂 内标给出原子编号的分子结构式数据表 如有对照品或文献数据可以对比列入表中 解析 4 核磁共振碳谱 13C NMR 基本原理 利用原子核的核自旋现象 通过一定振动频率的电磁波照射时 原子核吸收电磁波从低能态向高能态跃迁 即核磁共振 主要应用 可提供供试品中碳原子的数目 所处的不同化学环境信息 技术要求a 对各项测试条件应有明确 详尽的说明 如仪器型号 规格 溶剂 内标 b 在图谱复杂时 应使用质子噪声去偶或偏共振去偶技术 使图谱简化 c 对分子中全部C原子均要有明确的解析和归属 d 对复杂结构化合物 可与类似结构化合物的化学位移进行计算比较 确定合理结构 资料撰写格式仪器溶剂给出碳原子编号的分子结构式数据表 如有对照品或文献数据可以对比列入表中 解析 5 其他核磁共振谱 DEPT谱 可区分碳原子的类型 1H 1Hcosy 可以显示相隔2 3键相互之间存在偶合的质子对信息 C Hcosy HMQC 异核多量子相关谱 可以了解分子中C H联结情况 HSQC 异核单量子相关谱 用于测定1H 13C相关信息 可以直接明确C H之间的连接关系 HMBC 异核多重键相关谱 可以显示1H 13C之间远程偶合的信息 即相隔二键和三键的1H 13C之间相关信号 解析化合物中存在的结构单元 推测化合物中各官能团 结构单元之间的连接关系 19F 31P等 可提供相应元素的种类及数目 在分子中所处的化学环境等信息 常用的二维核磁共振测试包括H Hcosy H HCorrelatedspectroscopy HMBC 1H detectedmultiple bondheteronuclearmultiple quantumcoherence HMQC 1H detectedheteronuclearmultiple quantumcoherence 等 对于结构复杂或用一般NMR方法难以进行结构确证的化合物 进行二维谱测试可更有效地确证药物的结构 碳谱注意点 1 碳信号数目比实际的少 原因可能为信号重叠 或有些季碳信号弱 或隐藏在溶剂信号内 2 碳信号数目比实际的多 原因可能是某些化合物存在构象异构 分子式 C44H69NO12 H2O 结构式为C44H69NO12 在其13C全去偶谱中应显示44个峰 但实际显示多达83个峰 这是因为在溶剂中有两种构像 一种为优势一种为劣势 文献报道在氯仿中比例为3 1 6 质谱 MS 基本原理 将气体分子经电子流轰击 使分子中的电子成为带正电荷的分子离子 而后裂解成一系列的碎片离子 再通过磁场使不同质荷比的正离子分离并记录其相对强度 画出质谱图 主要应用 提供分子离子峰 碎片峰 丰度等信息 可以确定分子量 分子式以及推测部分结构单元 对含有同位素元素 如Cl Br等 的药物 利用同位素簇的丰度比 可推断药物中部分元素的种类 数量 乃至分子式 裂解方式等 技术要求 a 应尽量设法获得化合物分子离子峰 当用EI法不能出现分子离子峰时 可试用其它电离源 如CI FAB FI FD ESI等 b 所获数据按规定列表 并对重要的碎片离子峰的产生进行解释 提供离子裂解图 c 高分辨质谱不能反映药品的纯度和结晶水 结晶溶剂 残留溶剂的情况 资料撰写格式仪器测试条件数据表裂解图解析 7 热分析 基本原理 采用程序控温下 精确记录待测物质理化性质与温度的关系 研究其受热过程中晶型转变 熔融 升华等物理变化和脱水 热分解 氧化 还原等化学变化 主要应用 差示扫描量热法 DSC 测定熔点 结晶水 结晶溶剂 考察晶型等 热重法 TGA 测定结晶水 吸附水和结晶溶剂 分解温度等 技术要求 a 应说明使用仪器型号 参数设定值 包括升温度速度 样品重量 温度范围 b 供试品与对照品应在同一仪器 相同条件下测定 c 差热分析曲线表达 纵坐标为热流率 dp dt 横坐标为温度 气体一般为氮气 流速为40ml min 热重分析曲线表达 纵坐标为重量 mg 或重量百分数 横坐标为温度 气体一般为氮气 流速为40ml min 资料撰写格式仪器测试条件测试结果和讨论 8 X 射线衍射 粉末X 射线衍射主要应用 a 固体状态下单一化合物的鉴别b 晶型确定c 晶态与非晶态物质的判断等 单晶X 射线衍射 主要应用 a 化合物的骨架结构信息b 化合物的相对或绝对构型c 构象及差向异构d 盐键及配位键f 结晶水 溶剂 资料撰写格式仪器测试条件结构解析晶体学参数结构测定方法结构数据结构图结论 9 综合解析 在结构确证申报资料中存在的问题主要体现在解析不充分 未对各项研究提供的数据和信息进行有机 深入 合理地综合分析 仅是机械式地罗列测试数据和图谱 没有综合解析过程 割裂了各种测试数据的联系 以致未达到对药物结构进行准确认识的目的 特别是在药物结构中的某些信息需多种方法相互结合才能作出准确判断或多种方法相互结合方可进一步深入了解药物结构信息的情况下 该现象表现得尤为明显 综合解析的一般过程 a 确定化合物的分子式元素分析质谱法 尤其是高分辨质谱 综合各种谱图提供的碳 氢等原子数b 根据分子式计算不饱和度c 确定分子中存在的主要官能团和结构单元d 明确各官能团 结构单元的连接方式e 对构型 晶型 结晶水 结晶溶剂进行分析 技术要求 a 有对照品样品和对照品的测试结果是否一致波谱信号的归属b 无对照品详细的解析 正确的归属参考文献可以作为重要的参考资料 资料撰写要求 简明扼要有机合理深入 药物的结构确证研究是药物研发的基础 不论是新药还是仿制药 都必需先明确其结构 由于原料药的结构确证存在很多特殊情况和不断出现更为先进的分析方法 在实际工作中 应根据药物本身的特点 选择合适的结构确证方法或手段 科学 合理地将药物的结构进行严密地阐述 而不能机械地照搬照抄指导原则的方法