2020年高考生物一轮复习 第10单元 现代生物科技专题 第34讲 基因工程学案（含解析）（选修3）.doc

第34讲基因工程考纲明细1.基因工程的诞生()2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)()3.基因工程的应用()4.蛋白质工程()5.实验：DNA的粗提取与鉴定考点1基因工程的操作工具1基因工程概念2限制酶(1)存在：主要存在于原核生物中。(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3DNA连接酶(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。(2)种类(3)DNA连接酶和限制酶的关系4载体(1)条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切割位点；具有标记基因。 (3)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。(4)特点：可在受体细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。1(选修3 P6寻根问底)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。提示不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。2(选修3 P4寻根问底、P7思考与探究T2)限制酶主要来自于原核生物，为什么它不剪切自身的DNA？试推测其在原核生物中的作用。提示限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割原核生物自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是原核生物的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。3(选修3 P7思考与探究T3)天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？提示不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。题组基因工程工具酶分析1(2016全国卷)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_ _。(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图c所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_ _。图c(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。答案(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)(3)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶解析(1)分析图a可知，限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。知识拓展归纳与DNA相关的六种酶题组载体的作用及特点2(2016全国卷)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。答案(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞解析(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。考点2基因工程的基本程序1目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 (3)几种目的基因获取方法的比较(4)PCR技术的原理和反应过程PCR原理：DNA双链复制PCR反应过程结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式扩增。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成(3)构建过程深挖教材(1)获取目的基因与切割载体时只能用同一种限制酶吗？提示不是。在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(2)启动子与起始密码子、终止子与终止密码子是一回事吗？提示启动子与起始密码子、终止子与终止密码子看起来差不多，实际上却是两组不同的概念。简单地说，启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA片段，属于基因的非编码序列，负责调控基因的转录。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三联体密码子，分别决定翻译的起始和终止。3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定(1)分子水平的检测利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。利用分子杂交技术检测目的基因的转录。利用抗原抗体杂交技术检测目的基因的翻译。(2)个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。1(选修3 P11寻根问底)将生物所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射等方法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多。2(选修3 P15思考与探究T3)利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器知识，结合基因工程操作程序的基本思路，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？提示不可以。糖蛋白上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌中不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。3(选修3 P15思考与探究T4)利用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的珠蛋白，应如何进行设计？提示基本操作如下。(1)从小鼠中克隆出珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。(2)将cDNA前后分别接上在大肠杆菌中可以适用的启动子和终止子，然后用限制酶和DNA连接酶将其整合到含四环素抗性基因的载体上，构建一个基因表达载体。(3)将基因表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有四环素抗性基因而死亡；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明珠蛋白基因已进入大肠杆菌。(4)培养含有珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，从中提取珠蛋白。题组基因表达载体构建时限制酶的选择1(2016江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌中。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。答案(1)Bcl和HindDNA连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)都不能(4)7解析(1)由题图可知，质粒的两个标记基因中都含有BamH的切点，因此不能用BamH进行切割，结合题干及表中信息可知也不能用Sau3A进行切割，所以只能用质粒和目的基因中都含有切点的Bcl和Hind这两种限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。要将重组质粒转入大肠杆菌，要先用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态。(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，含有重组质粒的大肠杆菌能在该平板上长出菌落。要用PCR扩增目的基因，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，因为从图2中可以看出，引物甲与引物丙与模板链结合后能完成目的基因的复制。(3)BamH酶切的DNA末端是，Bcl酶切的DNA末端是，这两个末端连接后的连接部位的6个碱基对序列为，由于连接后的6个碱基对序列不是BamH和Bcl的识别序列，故对于该部位BamH和Bcl都不能将其切开。(4)因为质粒的BamH和Bcl识别序列中都有Sau3A的识别序列和切割位点，所以用Sau3A切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。Sau3A切点及得到的7种大小不同的DNA片段情况如下：切点在1或2或3的位置可以分别得到1种DNA分子，但其大小相同；切点在1和2的位置可以得到2种DNA分子；切点在1和3的位置可以得到2种DNA分子；切点在2和3的位置可以得到2种DNA分子，故最多可能获得7种大小不同的DNA片段。技法提升选择限制酶的方法(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。题组PCR技术的原理及应用2(2017江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过_获得_用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(3)图中步骤1代表_，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_(填序号：升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。答案(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5)解析(1)目的基因的获取：从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR的扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便基因与载体相连构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。(4)退火温度过高，会破坏引物与模板的碱基配对。因A、T之间形成两个氢键，G、C之间形成三个氢键，形成G、C碱基对需要更多的能量，故需要更高的温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板结合。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。知识拓展生物体内DNA复制与PCR反应的区别题组基因工程操作程序及实例3(2017北京高考)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是()A用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上答案C解析C基因两端有EcoR酶切位点，可用限制性核酸内切酶EcoR和(DNA)连接酶构建重组质粒，A正确；一般用农杆菌等作为媒介去侵染植物的愈伤组织等，将含有目的基因的质粒导入细胞，B正确；据图可知，质粒中含有潮霉素抗性基因，不含卡那霉素抗性基因，故无法用卡那霉素来筛选被转化的菊花细胞，C错误；检测C基因是否整合到菊花染色体上，常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作为标记，以此作为探针，使探针与C基因杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中，D正确。4(2018全国卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_。使用这两种酶进行酶切是为了保证_，也是为了保证_。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_移入牛的_中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。答案(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA解析(1)甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端而获得的L1GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达，基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。考点3基因工程的应用及蛋白质工程1基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高动物生长速率，从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如抗烟草花叶病毒的转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。(3)比较基因治疗与基因诊断2蛋白质工程(1)概念理解基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。操作：基因修饰或基因合成。结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。(2)操作过程从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。其流程图如下：1(选修3 P26旁栏思考)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？提示毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。2(选修3 P24拓展视野)基因芯片的原理、检测方法、应用分别是什么？提示原理：DNA分子杂交技术。检测方法：荧光标记法。应用：基因诊断、新药筛选、临床用药指导等方面。3(选修3 P27讨论T2)确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？提示确定目的基因的碱基序列后，可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因文库中获取。4(选修3 P27异想天开)能否应用蛋白质工程，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品？提示理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全由人工设计出来而自然界不存在的。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。5(选修3 P28思考探究T3)绝大多数酶是蛋白质，那么酶工程与蛋白质工程有什么区别？提示通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存在的酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。辨析乳腺生物反应器与工程菌生产药物题组基因工程应用及实例1(2018天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是_(单选)。A病毒的DNA聚合酶 B宿主的DNA聚合酶C病毒的RNA聚合酶 D宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_免疫，增强免疫保护效果。答案(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞解析(1)PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，由于将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列，因此肽链合成提前终止，这样与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)，因此不能产生子代病毒。(2)基因工程的核心步骤为基因表达载体的构建，将该基因与载体连接后才能导入宿主细胞，检测目的基因是否成功表达上述tRNA时，利用核酸分子杂交技术，即用相应的DNA探针与宿主细胞的总RNA分子进行杂交鉴定，进而筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)因为设计的宿主细胞具有能合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)，因此将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸(Uaa)的培养基中进行培养，则该宿主细胞可翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。因为转录在宿主细胞内进行，且启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，因此需要使用宿主细胞的RNA聚合酶。故选D。(4)不具侵染性的流感病毒灭活疫苗，不能侵入细胞内部，只能引起体液免疫，产生相应的抗体与记忆细胞，而该疫苗能够侵入细胞，引起的免疫属于细胞免疫。题组蛋白质工程2(2015全国卷)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_基因或合成_基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_进行鉴定。答案(1)氨基酸序列(或结构)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能解析(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸序列进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。所获得的基因表达时遵循中心法则，中心法则的全部内容包括DNA和RNA复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即DNARNA，RNADNA，RNA蛋白质。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列，据此得到的蛋白质，还需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。知识拓展蛋白质工程与基因工程的比较(1)区别(2)联系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。实验16DNA的粗提取与鉴定1DNA粗提取和鉴定的原理(1)提取思路：利用DNA和其他物质在理化性质方面的差异，提取DNA。(2)DNA的性质：(提取和鉴定原理)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同DNA不溶于酒精；对酶、高温和洗涤剂的耐受性强；DNA二苯胺试剂蓝色。2DNA粗提取和鉴定的操作流程1(2018扬州江都中学段考)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()ADNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水B向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了释放出DNAC向浓盐溶液中加蒸馏水是为了析出DNAD用菜花替代鸡血做实验，其实验操作步骤相同答案D解析DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了让鸡血细胞吸水涨破，从而释放出DNA，B正确；向溶解DNA的浓盐溶液中加蒸馏水是为了降低DNA的溶解度，进而析出DNA，C正确；用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤不完全相同，如植物细胞有细胞壁，破碎细胞时需要研磨并加入食盐和洗涤剂，D错误。2实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？_。(3)在沸水浴中加热的目的是_，同时说明DNA对高温有较强的_。(4)A试管在实验中的作用是_。(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与_有关。答案(1)溶液不变蓝色溶液逐渐变蓝色DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色(2)溶液颜色基本不变(3)加快颜色反应速度耐受性(4)对照(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少解析A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。题后归纳DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”高考热点突破1(2018全国卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_ _(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2参与的_方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶解析(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)用Ca2处理大肠杆菌细胞，可以增大细胞膜的通透性，使重组的质粒更容易导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞。噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。2(2017全国卷)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_ _。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_ _(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_ _。答案(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A(2)噬菌体噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体解析(1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原抗体杂交法。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。3(2017全国卷)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。答案(1)嫩叶比老叶生命活动旺盛，mRNA含量高，且易破碎防止RNA降解(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(4)磷酸二酯键(5)目的基因的转录或翻译异常解析(1)与老叶相比，嫩叶生命活动旺盛，mRNA含量高，且易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。4(2017全国卷)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。回答下列问题：(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_。(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为_，加入了_作为合成DNA的原料。(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是_。仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。答案(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子(2)模板dNTP(3)进行细胞传代培养维持培养液的pHC解析(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA)，则基因表达载体中编码乙的DNA序列起始端无ATG，无论以DNA的哪条链为模板，转录出的mRNA都无起始密码子AUG，使所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。(2)在PCR技术中，除了引物和耐高温的DNA聚合酶外，还需要序列甲(DNA片段)作为模板，dNTP(脱氧核苷酸)作为原料。(3)当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，可能是由于发生了接触抑制，可用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，制成细胞悬液分瓶继续传代培养。动物细胞培养中，CO2的作用是维持培养液的pH。对照分析图1和图2可知，能刺激T淋巴细胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而对T淋巴细胞增殖促进作用很弱的丙中没有C片段，据此可知，若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。5(2018江苏高考)为生产具有特定性能的淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了淀粉酶基因(1656个碱基对)，利用基因工程大量制备淀粉酶，实验流程见图。请回答下列问题：(1)利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的_。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：图中虚线框内mRNA片段包含_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_种。(5)获得工程菌表达的淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：根据上述实验结果，初步判断该淀粉酶活性最高的条件为_。答案(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl解析(1)淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。(2)目的基因与载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。(3)进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。(4)根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含2438个密码子；构成mRNA的碱基有4种，因为虚线外第一个密码子已固定为U，且三个终止密码子皆为U开头，所以预测虚线框后的第一个密码子最多有44313种。(5)根据表格数据分析可知，在pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl的条件下，淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。