沙门氏菌检验详细流程ppt课件

GB4789 4 2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 1 沙门菌概况 沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时 分离出的猪霍乱沙门菌 由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越 故定名为沙门菌属 沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌 它是一群抗原结构 生化特性相似的革兰氏阴性杆菌 血清型繁多 目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种 我国发现的有250多个血清型 2 沙门菌的分类 根据生化反应不同 分为2个种 肠道沙门菌 Samonellaenterica 肠道亚种 subsp enterica 萨拉姆亚种 subsp salamae 亚利桑那亚种 subsp arizonae 豪顿亚种 subsp houtenae 因迪卡亚种 subsp indica 邦戈尔沙门菌 Samonellabongori 3 沙门菌种和亚种的鉴别 4 沙门氏菌的血清分型 迄今为止沙门氏菌有57个O抗原116个H抗原Vi抗原被分成2500多个血清型 Vi抗原 O抗原 H抗原 5 沙门氏菌命名与书写方式 目前的命名方法规定 肠道沙门菌肠道亚种 亚种 给予专用名 并采用标本分离地址的地名 菌名的第一个字母需大写 且亚种 的所用菌名不能用斜体 例如 肠道沙门菌鼠伤寒血清型应书写为Salmonellaentericasubsp entericaserotypeTyphimurium 但在实际工作中 可简写为S Typhimurium 其他沙门氏菌均不给专用名 只在亚种数字名后直接书写抗原式 比如S 66 z35 新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所 德国汉堡卫生研究所及美国CDC3个实验室的一致同意 6 沙门氏菌检验程序 7 目的 修复损伤的细菌细胞 方法 25g mL 样品 225mLBPW的无菌均质杯中 以8000r min 10000r min均质1min 2min 或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中 用拍击式均质器拍打1min 2min 若样品为液态 不需要均质 振荡混匀 如使用均质袋 可直接进行培养 于36 1 培养8h 18h 前增菌 8 无菌均质袋 9 轻轻摇动培养过的样品混合物 移取1mL 转种于10mLTTB内 于42 1 培养18 24h 同时 另取1mL 转种于10mLSC内 于36 1 培养18 24h 分别用接种环取增菌液1环 划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板 或HE琼脂平板或显色培养基平板 于36 1 分别培养18 24h XLD琼脂平板 HE琼脂平板 显色培养基平板 或40h 48h BS琼脂平板 观察各个平板上生长的菌落 为了最大可能的检出沙门氏菌 原则上必须使用两种以上选择性分离培养基 选择性增菌与分离 10 分离培养基回收率测定 11 典型菌落 BS 菌落为黑色有金属光泽 棕褐色或灰色 菌落周围培养基可呈黑色或棕色 有些菌株形成灰绿色的菌落 周围培养基不变 国产BS 进口BS 12 典型菌落 HE 国产HE 进口HE 蓝绿色或蓝色 多数菌落中心黑色或几乎全黑色 有些菌株为黄色 中心黑色或几乎全黑色 13 典型菌落 XLD 进口XLD 国产XLD 菌落呈粉红色 带或不带黑色中心 有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心 或呈现全部黑色的菌落 有些菌株为黄色菌落 带或不带黑色中心 14 铜绿假单胞菌也呈紫红色 可以通过前增菌排除 所以推荐在检测中的前增菌用TTB 粉红色 深红色 干燥菌落 边缘锯齿状等均非沙门氏菌菌落 15 生化试验 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落 分别接种三糖铁 TSI 琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板 取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层 接种针在接种TSI后不要灭菌 直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板 于36 培养18 24h 必要时可延长至48h 16 穿刺TSI方法 17 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时 可直接接种蛋白胨水 供做靛基质试验 尿素琼脂 pH7 2 氰化钾 KCN 培养基 也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种 于36 1 培养18h 24h 必要时可延长至48h 将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24h 以备必要时复查 18 沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果 该表显示 只有在三糖铁斜面产酸 底层产酸 同时赖氨酸阴性的菌株可排除 其他反应结果均有沙门菌属的可能 同时也均有不是沙门菌的可能 19 TSI的反应赖氨酸脱羧酶试验 20 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号A1 为典型反应判定为沙门氏菌属 如尿素 KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常 按下表可判定为沙门氏菌 如有2项异常为非沙门氏菌 21 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号2 补做甘露醇和山梨醇试验 沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性 反应序号3 补做ONPG ONPG阴性 同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌 但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性 22 沙门氏菌属各生化群的鉴别必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定 23 沙门菌的其他鉴定 API20EVITEK32GNI 卡片 24 沙门菌的血清学鉴定 培养基 一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯培养 取斜面上部培养物作O抗原玻片凝集试验 下部凝结水里的培养物作H抗原 H抗原的位相诱导试验制备半固体琼脂 融化完全分装10ml 管 121 灭菌15分钟 冷至50 备用 取诱导用血清1滴加到小平皿中 倾入冷至50 的10ml半固体琼脂 轻轻摇匀 凝固 将培养物接种到平板的中央 放入湿盒中培养过夜 取边缘的菌进行H抗原的检测 25 血清学鉴定时的注意要点 做血清凝集时 同时应用生理盐水做对照 O血清不凝集时 可将菌株转接于琼脂量较高 如2 5 3 的斜面上 再做凝集 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应时 应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液 煮沸后再检查 常见于伤寒沙门菌 有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H抗原 也有一些沙门氏菌在培养过程中H抗原会出现第1项和第2项之间的转变 所以血清诱导实验要用新鲜的培养物进行诱导 26 谢谢大家 27