肿瘤分子检测与质量控制课件.ppt

深圳市人民医院病理科分子实验室姜阳阳2015 10 27 肿瘤分子检测方法与质量控制 医学发展历程的启示 经验医学 循证医学 精准医学 诊断靠治疗后期经验积累 诊断治疗以人群 科学研究证据指导临床实践 诊断治疗以个体为基础 更加提前 具体与精确 分子时代 肺腺癌 EGFR KRAS BRAF ALK ROS1 RET等检测已是共识 肺鳞癌发生模式不同 检测靶标以扩增为主 同时EGFR ALK ROS1某些病例也有必要检测 我们可以用的分子生物学手段 实时荧光PCR方法 扩增阻碍突变系统法 AmplificationRefractoryMutationSystem ARMS PCR 高分辨溶点曲线分析 HRM 数字PCR等 PCR 杂交法 膜上 芯片 基因芯片 乳胶颗粒 Luminex PCR Sanger测序PCR 焦磷酸测序新一代高通量测序PCR SSCP RFLP dHPLC等荧光原位杂交 FISH 直接杂交免疫组化 分子病理检测的主要方法 检测技术 检测对象 检测基因 检测水平 EGFR KRAS BRAF BRCA BCR ABL JAK2 EML4 ALK ROS1 HER2 RET BRCA1 TOP2A TYMS EGFR EML4 ALK HER2 是RT PCR平台上的特异扩增技术 易开展 共发表300多篇文献著名的大型临床研究 如IPASS INFORM等 国际肺癌协会专家共识中国基因突变检测专家共识日本临床专家共识 ARMS技术 被临床证明的肿瘤基因突变检测技术 DNA基因重排 融合mRNA或5 3 mRNA差异表达 嵌合蛋白表达 肺癌中ALK基因变异的表达调控 FISH CISHNGS RT PCR5 3 比较qRT PCRRACE PCR IHC 荧光原位杂交技术 FISH 2个信号分离直径的要求 使实际应用中结果难以判断有5 11 出现假阳性信号分离1 2 3工作强度大 费时主观性强 受人为因素影响大 横向 纵向 1 FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法 2 采用 分离 分析 基因倒位和ALK重排后 红色和绿色探针分开3 15 的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1 操作简单 时间短结果客观 易于判读 减少人为因素的影响除FFPE样本外 还适用其他类型样本组织1与EGFR RET ROS1等其他检测不冲突 共用相同组织切片和PCR扩增程序 节约有限资源和时间中国荧光PCR仪器普及率更高 更加适合国情 实时逆转录法 RealTime PCR CFDA批准的基因检测产品 基于RealTime PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品获得CFDA批准最多 2 3片FFPE样品同时将DNA和RNA分离出来同时获得EGFR ALK和ROS1检测结果 节约样本 节约时间 节约成本 DNA RNA EGFR突变型 ALK阳性或ROS1阳性 EGFR野生型ALK阴性ROS1阴性 吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼 克唑替尼色瑞替尼 其他治疗方式 DNA RNA共分离剂盒 EGFR ALK ROS1 2 5小时PCR 4 5小时 FFPE切片1 3片或活检小标本 2015NSCLCNCCN指南 对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态 对于ROS1 MET RET BRAF HER2等崭露头角的靶基因也给予关注 1 室内质量控制2 室间质量评价 分子病理实验室的质量控制 1 建立标准化的实验室2 具备资质且相对固定的人员3 性能稳定的试剂4 持续不断的学习和开展质控 医疗机构临床基因扩增检验室管理办法 卫办医政发 2010 194号 医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则 卫办医政发 2010 194号 FISH实验区 临床基因扩增实验室标准化操作文件 sop 1 写你所做2 做你所写3 实验室的精髓 可操作性的sop文件 人员资质 理想的试剂 试剂方法的性能验证及每批试剂的质检性能指标 重复性 精密度 准确性 定量 回收率 标准物质等 定性 方法学比较等 线性范围 定量 分析特异性测定下限抗干扰能力 资质认证试剂质量试剂反应性能前后批号结果一致性测定下限批内变异 10 和批间变异 15 25 你其实做了这些 但是你有记录么 1 日常维护2 定期保养3 维修记录 实验室最忠实的员工 仪器 全流程 标本接收 石蜡切片 核酸提纯 实时荧光定量PCR扩增 结果分析分析前 标本接收 制片 填写检测申请单分析中 核酸提取 扩增 产物分析 检测有效性判断分析后 结果分析 报告审核 结果解释标准 重复 可控 规范 全流程室内质控 DNA模板质量更重要 建议对提取的DNA模板进行质量检测 OD260 OD280 1 8 0 2 OD260 OD230 1 7 全流程室内质控 积极参加各级室间质量评价 1 深圳市病理质控中心2 广东省临床病理质控中心3 卫生部临床检验中心4 有条件可参加更多检测机构 PQCC EMQN CAP等 ThankYou 敬请各位专家提出宝贵意见